Tecniche istochimiche: differenze con i tessuti di mammifero. Tecniche citologiche

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1 XVIII Convegno Nazionale Società Italiana di Patologia Ittica Seminario di istopatologia Tecniche istochimiche: differenze con i tessuti di mammifero. Tecniche citologiche Carla Calligaro carla.calligaro@uniud.it Paola Beraldo paola.beraldo@uniud.it Anatomicamente il rene è costituito da due lunghe masse scure che decorrono longitudinalmente incassate ai lati della colonna vertebrale, al di fuori della cavità peritoneale. La parte cefalica, pronefro, spesso separata più o meno nettamente dalla parte posteriore, è funzionante nell embrione e nella larva, mentre nell adulto è formata di tessuto emopoietico e tessuto ghiandolare di due tipi, cellule interrenali e cromaffini. La parte caudale, opistonefro, presenta una gran variabilità di forme e grandezze tra le varie specie. Vi sono due dotti escretori che, in molte specie, prima di sboccare all esterno, posteriormente all apertura anale, si uniscono a dare una vescica.

2 XVIII Convegno Nazionale Società Italiana di Patologia Ittica Seminario di istopatologia MODALITÀ DI PRELIEVO DEGLI ORGANI, SCELTA DELLA SOLUZIONE FISSATIVA E TEMPI DI FISSAZIONE fissazione +4 C Anatomicamente il rene è costituito da due lunghe masse scure che decorrono longitudinalmente incassate ai lati della colonna vertebrale, al di fuori della cavità peritoneale. La parte cefalica, pronefro, spesso separata più o meno nettamente dalla parte posteriore, è funzionante nell embrione e nella larva, mentre nell adulto è formata di tessuto emopoietico e tessuto ghiandolare di due tipi, cellule interrenali e cromaffini. La parte caudale, opistonefro, presenta una gran variabilità di forme e grandezze tra le varie specie. Vi sono due dotti escretori che, in molte specie, prima di sboccare all esterno, posteriormente all apertura anale, si uniscono a dare una vescica.

3 PROCESSAZIONE con REAGENTI STANDARD (più tossici, Processatore LX0 PABISCH) ALCOOL 0 ALCOOL 80 ALCOOL ALCOOL ALCOOL 00 ALCOOL 00 3 PARAFFINA PARAFFINA PARAFFINA 3 TEMPO (minuti) i prelievi fissati in bouin (già lavati in alcool 70 ) possono saltare il primo passaggio in alccol 0

4 PROCESSAZIONE CON SOSTITUTI DELLO XILOLO per campioni di dimensione normale (minore tossicità, processatore TISBE, ditta DIAPATH ) ALCOOL 0 OTTIX SHAPER OTTIX PLUS OTTIX PLUS OTTIX PLUS OTTIX PLUS PARAFFINA PARAFFINA PARAFFINA 3 TEMPO (minuti) l'agitazione dei reagenti è garantita da cicli alternati pressione/vuoto i prelievi fissati in bouin (già lavati in alcool 70 ) possono saltare il primo passaggio in alccol 0

5 PROCESSAZIONE CON SOSTITUTI DELLO XILOLO per biopsie o stadi larvali di Teleostei (minore tossicità, processatore TISBE, ditta DIAPATH ) ALCOOL 0 OTTIX SHAPER OTTIX PLUS OTTIX PLUS OTTIX PLUS OTTIX PLUS PARAFFINA PARAFFINA PARAFFINA 3 TEMPO (minuti) l'agitazione dei reagenti è garantita da cicli alternati pressione/vuoto i prelievi fissati in bouin (già lavati in alcool 70 ) possono saltare il primo passaggio in alccol 0

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7 COLORAZIONE EMATOSSILINA EOSINA (E-E) C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione ALCOOL 00 ALCOOL 00 ALCOOL 9 ALCOOL 80 ALCOOL 0 ACQUA DISTILLATA. colorazione Lavaggio alcool 80 EOSINA EMATOSSILINA DI MAYER Lavaggio acqua corrente Lavaggio alcool 80 TEMPO(minuti) TEMPO (minuti) 3. fase di disidratazione ALCOOL 9 ALCOOL 00 ALCOOL 00 MONTARE CON EUKITT TEMPO (minuti) Se mammiferi minuto. Nelcasodicampioni fissatiinbouiniltempoèdiminuto.

8 COLORAZIONE GRAM MODIFICATA TWORT C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione (come precedente). colorazione Acetone Lillie crystal violetto Lavaggio H O rubinetto Lugol's iodine Lavaggio acqua distillata Rosso neutro/verde luce Lavaggio acqua distillata breve secondi secondi secondi 3. fase di asciugatura in stufa a 37 (al fine di evitare la presenza di goccioline di acqua nei preparati) 4. Fase di disidratazione convenzionale ma i tempi sono più brevi. Risultati: Grampositivi blu Gram negativi rosso Collagene, citoplasma verde Nei mammiferi i tempi sono piùlunghi (3 minuti) Nei mammiferi i tempi sono piùlunghi e si usa una miscela di assoluto e acido acetico Lillie's crystal violetto Sciogliere 0g crystal violet in 00ml 9% alcool. Sciogliere 4g ammonio ossalato in 400 ml acqua distillata Unire le due soluzioni e agitare la miscela 3 ore. Filtrare Lugol g di Iodio g ioduro di potassio - 00ml di acqua distillata Mescolare lo iodio e lo ioduro di potassio in una piccola quantitàdi acqua e consentire loro di sciogliersi completamente prima di aggiungere il resto dell'acqua. Rosso neutro/verde luce 0,% fast green 0,% rosso neutro in etanolo al 80%. Soluzione di lavoro da preparare al momento dell'uso: ml Fast Green 9 ml Neutral Red 30 ml acquadist

9 COLORAZIONE GRAM BROWN HOPPS C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Crystal violetto Lavaggio in acqua rubinetto veloce Gram's iodine Acqua rubinetto 0 Tamponare ma non asciugare Acetone breve Acqua rubinetto breve Fucsina basica Lavaggio in acqua distillata veloce Sol. Gallego (agitare) Lavare, tamponare ma non asciugare Immergere 3 volte in acetone (rapido) Immergere 3 volte in acetone/ac picrico (rapido) Immergere 3 volte in acetone (rapido) Immergere volte in acetone/xilene (rapido) Immergere 0 volte in xilene (rapido) Risultati: Grampositivi blu Gramnegativi rosso Fondo giallo Crystal violetto gr Crystal violetto in 00 ml acqua distillata. Soluzione idurata(gram s iodine) % di iodio e 3% ioduro di potassio in etanolo 70% Fucsina basica (sol. base) 0, gr fucsina basica in 00 ml acqua distillata All'uso, diluire la soluzione base : in acqua distillata Gallego ml formalina concin 0 ml acqua dist, + 0, ml acido acetico glaciale Acetone/acido picrico: 0, gr acioi picrico in l acetone Acetone/xilene :

10 COLORAZIONE GIEMSA C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Giemsa Acido acetico 3. fase di disidratazione ALCOOL 9 ALCOOL 00 ALCOOL 00 Risultati: Nuclei blu Citoplasma rosa Eosinofili rosso/arancio Parassiti blu/blu scuro 60 Controllare al m.o. secondi Nei mammiferi i tempi sono più brevi (30min) Decolorare il fondo controllando al microscopio ottico la giusta tonalità del rosa Giemsa commerciale diluita :0 in acqua distillata Acido acetico glaciale 0µl in 00ml di acqua distillata

11 COLORAZIONE PAS (periodic acid Schiff) C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Acido periodico Lavaggio acqua rubinetto Reattivo di Schiff (al buio) Soluzione Solforosa Acqua rubinetto Ematossilina di Mayer Acqua rubinetto 3. fase di disidratazione convenzionale Risultati: Nuclei blu Carboidrati magenta 30 3x 0 8 Verificare la colorazione data dal reattivo, tonolità di rosso magenta. Nei mammiferi i tempi di permanenza nel reattivo sono minori -0 minuti % acido periodico Reattivo di Schiff(commerciale) Soluzione solforosa : 00 ml Na-metabisolfito0% acq. 0 ml HClN 00 ml HO dist.

12 COLORAZIONE ZIEHL NEELSEN C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Carbol-fucsina (soluzione già pronta commerciale) Acqua distillata % HCl in alcool al 70% Acqua rubinetto Blu di metilene (sol.lav.) 3. fase di disidratazione ALCOOL 9 ALCOOL 00 ALCOOL 00 secondi 30 a temperatura amb. breve decolorare le sezioni finché non diventano rosa 8 secondi Risultati: Nuclei blu scuro Batteri acido resistenti magenta Nei mammiferi minuti a 7 C + 30 min a tempamb Controllare al microscopio ottico Molto veloce affinchèil blu non sovrasti la colorazione Soluzione decolorante: % HClin alcool al 70% Soluzione base:,4 g blu metilene in alcool 9 ; soluzione di lavoro 0ml disol base in ml diacquadistillata

13 COLORAZIONE TRICROMICA DI GOLDNER C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Ematossilina ferrica di Weigert Tamponare con carta bibula Acido picrico (sol. alcolica satura) Lavaggio acqua distillata Ponceau-Fucsina Lavaggio acqua distillata Acido fosfomolibdico % Tamponare con carta bibula Blu di anilina al,% in % ac. acetico Lavaggio acqua distillata 3. fase di disidratazione convenzionale il passaggio in alcool 9 è rapido (secondi) Risultati: Nuclei neri Collagene blu Citoplasma, fibre muscolari, cheratina rosso Eritrociti giallo Previa facoltativo mordenzatura in Buoin 4 rapido rapido Nei mammiferi i tempi sono inferiori Controllare al microscopio ottico che i globuli rossi siano giallo e connettivo decolorato Controllare al microscopio ottico che il blu non sovrasti la colorazione Ematossilina ferrica di Weigert soluzione di base: Sol A, ematossilina certificata all % in etanolo; Sol B, 4 ml di cloruro ferrico al 30% uniti a ml acido cloridrico conc Al momento dell'uso mescolare A e B in parti uguali Soluzione satura di acido picrico in alcool 80 Ponceau-Fucsina 0, gr PonceauR 0, gr fucsina acida 0,6 ml ac acetico glaciale 300 ml acqua distillata Blu anilinaal,% in % acido acetico

14 COLORAZIONE GROCOTT (impregnazione argentica per miceti ) C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Cromo triossido (sol acquosa %) Acqua rubinetto Lavaggio acqua distillata Na metabisolfito (sol. acquosa %) Acqua rubinetto+ acqua dist Soluzione argentica Acido cloroaurico Lavaggio acqua distillata Sodio tiosolfato al % Acqua rubinetto Verde luce (sol. 0.% in acido acetico a 0.% ) Lavaggio acqua distillata + a 60ºC 3x secondi 3. fase di disidratazione convenzionale, previa asciugatura in stufa a 37 C Ife fungine nere Fondo verde Nei mammiferi i tempi sono maggiori (h) Controllare al microscopio ottico l'andamento dell'impregnazione quando il fondo tende a impregnarsi e diventare marrone, sopsendere. Argento-esamina soluzione base ml % argento nitrato + 00 ml of 3% soluz acquosa esamina. (Conservare al buio a 4 C per mesi) Soluzione di lavoro: a ml della soluzione base, aggiungere ml di acido borico % (stoccato a 37 C) e ml H O distillata. Preriscaldare a 60. Acido cloroaurico soluzione acquosa 0,% di acido cloroaurico % sodio tiosolfato 0.% verde luce in 0.% acido acetico

15 COLORAZIONE MACCHIAVELLO C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Fucsina basica Acqua distillata Acido citrico Acqua rubinetto Blu metilene Acqua distillata 3. fase di disidratazione convenzionale Rickettsiae e alcuni inclusi virali rosse Fondo blu TEMPO (minuti) sec - veloce 30 secondi veloce

16 COLORAZIONE BLU TOLUIDINA C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Blu toluidina 0.0% Acqua distillata 3. fase di disidratazione convenzionale ALCOOL 9 ALCOOL 00 ALCOOL 00 Nuclei blu scuro Fondo azzurro Metacromasia 0 Nei mammiferi i la concentrazione del colorante è0.%. Per il pesce èmeglio avere il ph acido (3/4)

17 C O L O R A Z I O N I I S T O C H I M I C H E. fase di idratazione. colorazione Acqua distillata Orange G/acido Fosfotungstico Blu anilina (ph4) Tamponare in carta bibula 3. fase di disidratazione convenzionale COLORAZIONE CLEVELAND WOLF (cellule acidofile) Fissazione in formaldeide 4%, se soluzione di Bouin i tempi molti più brevi Eritrosina ALCOOL 9 ALCOOL 00 ALCOOL 00 rapido rapido rapido x rapido 3- Nuclei blu scuro Fondo azzurro Metacromasia 0 secondi se Bouin 0 secondi se Bouin % soluzione acquosa eritrosina % Orange G in % acido fosfotungstico % blu anilina in acqua Le soluzioni devono essere preparate di fresco. Il ph del blu di anilina non deve superare il 4.

18 Bouin, 00x Cleveland formaldeide, 00x Cleveland Mastocti/EGC, distribuzione diffusa nella sottomucosa e lamina propria, epitelale

19 due morfotipi cellulari differenti formaldeide, 000x Cleveland

20 TECNICHE DIAGNOSTICHE E RICERCA PER LE MALATTIE DEI PESCI ricognizione esteriore indiretta e diretta in vivo (sedazione e immobilizzazione del pesce) La prima ricognizione, idealmente, dovrebbe essere condotta nell ambiente di provenienza del pesce, ma, non essendo sempre possibile, può essere sufficiente osservalo nel contenitore in cui viene trasportato. I dettagli del suo comportamento nella colonna d acqua, l orientamento e il comportamento natatorio e la reazioni a stimoli esterni devono essere indicatori per la diagnosi, come eventuali altre anomalie comportamentali: scatti improvvisi sul fondo della vasca, frequenza della struttura opercolare.

21 TECNICHE DIAGNOSTICHE E RICERCA PER LE MALATTIE DEI PESCI esami a fresco non letali raschiato cutaneo e branchiale biopsia branchie e pinne coprologico o lavaggio cloacale biopsia e agoaspirato di masse prelievo di sangue citologia altri esami non letali diagnosi per immagini La prima ricognizione, idealmente, dovrebbe essere condotta nell ambiente di provenienza del pesce, ma, non essendo sempre possibile, può essere sufficiente osservalo nel contenitore in cui viene trasportato. I dettagli del suo comportamento nella colonna d acqua, l orientamento e il comportamento natatorio e la reazioni a stimoli esterni devono essere indicatori per la diagnosi, come eventuali altre anomalie comportamentali: scatti improvvisi sul fondo della vasca, frequenza della struttura opercolare.

22 TECNICHE DIAGNOSTICHE E RICERCA PER LE MALATTIE DEI PESCI eutanasia (metodi chimici con dose letale di MS-, clove oil, benzocaina; metodi fisici: botta in testa, ghiaccio fondente, taglio della testa o della colonna vertebrale) esami postmortem esami a fresco citologia (strisci o impronte) esami microbiologici prelievo per istologia microscopia elettronica La prima ricognizione, idealmente, dovrebbe essere condotta nell ambiente di provenienza del pesce, ma, non essendo sempre possibile, può essere sufficiente osservalo nel contenitore in cui viene trasportato. I dettagli del suo comportamento nella colonna d acqua, l orientamento e il comportamento natatorio e la reazioni a stimoli esterni devono essere indicatori per la diagnosi, come eventuali altre anomalie comportamentali: scatti improvvisi sul fondo della vasca, frequenza della struttura opercolare.

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24 COLORAZIONE GIEMSA C O L O R A Z I O N I C I T O L O G I C H E Fissare il preparato in alcool 9 per 3' Giemsa Lavaggio Disidratazione Asciugare all'aria ALCOOL cambi da ' 30'' Risultati: tessuti colorati con varie tonalità dal blu al violetto (metacromasia)

25 COLORAZIONE MAY GRUNWALD GIEMSA C O L O R A Z I O N I C I T O L O G I C H E Fissare il preparato in alcool 9 per 3' Lavaggio Giemsa May Grunwald Diluire con H O (:) e proseguire altri 0 Lavaggio acqua distillata Disidratazione ALCOOL 00 Asciugare all'aria TEMPO (minuti) 30 secondi breve 3 x Reagenti May Grunwaldpronto all'uso Giemsacommerciale diluito ( goccia di reagente ogni ml di acqua distillata)