Colorazione ed osservazione dei microrganismi

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1 Colorazione ed osservazione dei microrganismi Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica» CdS Medicina e Chirurgia Università G. d Annunzio, Chieti-Pescara AA

2 Le colorazioni in Microbiologia Perché colorare? La cellula batterica è trasparente batterica ed ambiente circostante. contrasto insufficiente tra cellula L utilizzo dei coloranti consente: forte contrasto tra i microrganismi ed il fondo differenziazione di vari tipi morfologici (forma, organizzazione, colorazione Gram) evidenziazione di alcune strutture cellulari (flagelli, capsule, endospore)

3 Le colorazioni in Microbiologia I coloranti i batteri sono carichi negativamente i coloranti sono usati sottoforma di sali (presenza di gruppi cromofori ionici) Coloranti basici (ioni positivi) Blu di metilene Fucsina basica Cristal violetto Coloranti acidici (ioni negativi) Eosina Nigrosina + cromofori attratti da componenti acidi (superficie, proteine, acidi nucleici) COLORAZIONE DIRETTA - cromofori repellono la cellula batterica (non penetrano la cellula) COLORAZIONE INDIRETTA o NEGATIVA

4 Le colorazioni in Microbiologia Preparativa Preparazione di soluzioni coloranti soluzione alcolica al 10% (colorante come sale): 10 g sostanza colorante ml alcool assoluto soluzione idroalcolica al 10% (colorante subisce dissociazione elettrolitica): 10 ml soluzione alcolica colorante + 90 ml H 2 O distillata Reagenti per colorazioni Mordenzanti: sostanze che fissano il colorante od amplificano l ingombro del campione (fenolo, soluzione iodo-iodurata o liquido di Lugol) Differenziatori: sostanze decoloranti (alcool-acetone, acido solforico al 20%)

5 Le colorazioni in Microbiologia Tipologie Colorazioni progressive: si eseguono con soluzioni molto diluite di colorante, interrompendo tempestivamente la colorazione. Colorazioni regressive: si esegue una ipercolorazione, quindi una decolorazione (differenziatore) la cui azione deve essere interrotta tempestivamente. Colorazioni semplici: un colorante basico, applicato al campione per un tempo variabile; l eccesso di colorante viene eliminato tramite risciacquo con acqua consente di rilevare la morfologia e l organizzazione cellulare esempi: blu di metilene, carbolfucsina Colorazioni differenziali: due o più coloranti ed altri reagenti (mordenzanti, differenziatori) consente di distinguere due (o più) differenti tipologie di microrganismi o loro strutture esempi: Gram, Ziehl-Neelsen

6 Tecniche di colorazione Colorazioni differenziali Colorazione di Gram Colorazione per bacilli acido-resistenti: Metodo di Ziehl-Neelsen Metodo a freddo di Kinyoun Metodo della fluorescenza con auramina Colorazione della capsula (inchiostro di china) Colorazione di flagelli (Leifson) Colorazione di spore Colorazione di lieviti e funghi Colorazione di spirochete

7 Le colorazioni in microbiologia Allestimento di un preparato (fissazione) Prima di poter essere colorato, il preparato deve essere fissato al supporto. La tecnica più utilizzata è quella FISICA: 1. Con un ansa, «stendere» il campione su un vetrino per microscopia: sospensione cellulare (brodocoltura), oppure colonie da terreno agarizzato (stemperare in soluzione tampone) 2. Lasciare essiccare il preparato all aria 3. Esporre il vetrino (lato non contenente il campione) direttamente alla fiamma di un «becco bunsen» L esposizione diretta al calore può alterare la morfologia cellulare (artefatti) 1 Fissazione CHIMICA: il fissativo (acetone, etanolo, acido acetico, glutaraldeide, formaldeide) penetra nella cellula preservandone le strutture intracellulari, grazie alla stabilizzazione di lipidi e proteine. La fissazione: impedisce che il campione venga rimosso dal vetrino durante i lavaggi uccide i microrganismi (sicurezza per operatore) facilita la penetrazione del colorante nel preparato inattiva gli enzimi che potrebbero degradare le strutture cellulari (autolisi) preserva le strutture intracellulari (solo fix chimica) 2 3

8 Colorazione di Gram Messa a punto dal batteriologo danese Hans Christian Joachim Gram (13 Settembre 1853) Inventò la colorazione omonima (colorazione Gram) nel tentativo di differenziare Klebsiella pneumoniae da Streptococcus pneumoniae La colorazione di Gram è la tecnica più frequentemente utilizzata in diagnostica, in quanto capace di suddividere i batteri in due gruppi: Gram-positivi (Gram+) e Gramnegativi (Gram-)

9 Colorazione di Gram Tecnica 1. Fissare il campione 2. Coprire con cristalvioletto per 1-2 min 3. Lavare con acqua; non asciugare 4. Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min 5. Lavare con acqua; non asciugare 6. Decolorare per 10 s con alcool-acetone 7. Lavare con acqua; non asciugare 8. Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min 9. Lavare con acqua e lasciare asciugare Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale

10 Colorazione di Gram Principio Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all interno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura peptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene catturato dalla parete cellulare. Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo così il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

11 Campione polimicrobico Colorazione di Gram Osservazione microscopica Staphylococcus epidermidis I batteri Gram+ (es. Staphylococcus spp, Streptococcus spp, etc) appaiono colorati in blu/porpora I batteri Gram- (es. E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.) appaiono colorati in rosso Nel caso di infezioni polimicrobiche (ossia sostenute da più specie), il campo microscopico presenterà evidenze sia per Gram+ che per Gram- Escherichia coli

12 Colorazione di Gram Utilità clinica Idoneità del campione da sottoporre a coltura Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva) meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione non routinarie anaerobi, funghi Ausilio nella interpretazione dell esame colturale angina di Vincent (spirochete, fusobatteri) paziente antibiotizzato Informazioni sulla natura dell infezione infezioni poli/mono-microbiche L esecuzione di una colorazione di Gram può, in alcuni casi, salvare la vita del paziente!

13 Colorazione di Gram Casi particolari La colorazione di Gram, classicamente utilizzata per i batteri, può in alcuni casi rivelare la presenza anche di altri microrganismi: Trichomonas vaginalis (protozoo) è Gram+ Candida albicans (lievito), Aspergillus fumigatus (muffa) sono Gram+ Occasionalmente, anche Mycobacterium tuberculosis è Gram+ (oppure Gram-variabile)

14 Mycobacterium spp. Parete cellulare La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i batteri. Mycobacterium tuberculosis (tubercolosi) e M. leprae (lebbra, Hansen s disease) posseggono una struttura parietale caratteristica: la natura cerosa dell involucro esterno (grosse quantità di glicolipidi, scarso petidoglicano) infatti rende la cellula altamente impermeabile ai coloranti Colorazioni: Ziehl-Neelsen (colorazione «a caldo») Kinyoun (coloreazione «a freddo»)

15 Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica 1. versare la fucsina fenicata (fucsina basica in acqua, alcool e fenolo) 2. far evaporare il colorante alla fiamma per 5 min; lavare con acqua 3. decolorare (2 min, circa) con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante; lavare con acqua 4. contrastare con blu di metilene per 1-2 min; lavare con acqua

16 Colorazione di Ziehl-Neelsen Osservazione microscopica Gli organismi acido-resistenti (AFB, Acid-Fast Bacilli) appaiono colorati in rosso Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

17 Le colorazioni in Microbiologia Colorazioni speciali La colorazione negativa consiste nella colorazione del campione con un colorante acido (nero nigrosina, inchiostro India). Usata per evidenziare organismi o strutture non colorabili con tecniche classiche (es., spirochete, capsula cellulare). Il campione NON viene fissato (assenza di artefatti). La colorazione delle spore (Schaffer-Fulton stain) richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante (verde di malachite, fucsina fenicata) attraverso gli involucri sporali. La colorazione dei flagelli (Leison stain) impiega un mordenzante (sali dell acido tannico) che, precipitando alla superficie flagellare, ne aumenta lo spessore. Il diametro flagellare è, di norma, pari a nm (<potere di risoluzione del microscopio ottico).

18 Le colorazioni in Microbiologia Colorazione di flagelli (Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997) Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori. Le frecce indicano i flagelli: alcuni ancora in contatto con il corpo cellulare, altri liberi

19 Osservare «l invisibile» Microscopio

20 Osservazione al microscopio Microscopio ottico L immagine viene ingrandita sia a livello delle lenti dell obiettivo che attraverso quelle dell oculare. Ingrandimento totale = 100 (obiettivo) 10 (oculare) = x La risoluzione (R) è la capacità delle lenti di distinguere due punti: il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di 0.2 µm, cioè in grado di distinguere due punti se distanti almeno 0.2 µm. Luce a lunghezza d onda minore fornisce una maggiore risoluzione: R = 0.5 λ / n sinα (λ: lunghezza d onda; n: indice di rifrazione; α: angolo del cono luminoso)

21 Osservazione al microscopio Microscopio ottico L indice di rifrazione di un mezzo misura la sua capacità di deviare la luce. In aria, la luce potrebbe deviare il suo cammino così tanto da non essere intercettata dalle piccole lenti di ingrandimento. Per questo, l osservazione viene effettuata in immersione, ossia in un mezzo (olio) in grado di ridurre la deviazione (rifrazioine) della luce.

22 Osservazione al microscopio Campo chiaro e campo scuro CHIARO Gli oggetti scuri sono visibili su fondo luminoso. La luce riflessa dal campione NON entra nell obiettivo. SCURO Gli oggetti chiari sono visibili su fondo scuro. La luce riflessa dal campione ENTRA nell obiettivo.

23 Osservazione al microscopio Contrasto di fase Accentuata diffrazione della luce che attraversa il campione.

24 Osservazione al microscopio Microscopio elettronico Utilizza un fascio di elettroni al posto della luce (λ = 10 5 minore): 2-20nm Focalizzato sul campione da magneti: Trasmissione (TEM): sezione sottile Scansione (SEM): 3D Campione disidratato, quindi colorato con sali di metalli pesanti

25 Osservazione al microscopio Microscopio elettronico SEM e TEM TEM. Vibrio cholerae su mucosa intestinale

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