Vi sono più animali viventi nella patina presente sui denti dell uomo, di quanto non siano gli uomini in un Regno intero.

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1 Vi sono più animali viventi nella patina presente sui denti dell uomo, di quanto non siano gli uomini in un Regno intero. Antony van Leeuwenhoek 1

2 L infinitamente piccolo va osservato per mezzo del microscopio I batteri sono organismi unicellulari di dimensioni estremamente piccole, visibili solo al microscopio ottico. Possiedono una struttura piccola, dell ordine del micron (0.5-10) 2

3 Unità Equivalenza metrica Equivalenza inglese Metro (m) 3.28 feet Centimetro (cm) 0.01 m = 10-2 m 0.39 inches Millimetro (mm) m= 10-3 m inches Micrometro ( m) m= inches Nanometro (nm) = inch Angstrom (A) =10-10 m in 3

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6 MICROSCOPIA: tecniche legate all osservazione di organismi microscopici 6

7 Il primo microscopio ottico: un microscopio semplice 7

8 I microscopi ottici microscopi semplici: un solo sistema di lenti (lenti di ingrandimento, i primi microscopi ) microscopi composti: due sistemi di lenti (i microscopi moderni con obiettivi e oculari) 8

9 Il microscopio ottico composto Il microscopio composto, comunemente chiamato soltanto microscopio, è un sistema di due lenti convergenti dette, rispettivamente, obiettivo e oculare. L'oggetto da osservare viene posto davanti all'obiettivo, che ne fornisce un'immagine reale, capovolta e ingrandita. Questa immagine viene fatta cadere davanti all'oculare a distanza opportuna, che ne dà un'altra, virtuale ed ingrandita. 9

10 Principi di base: microscopio composto Sistema di lenti convergenti: 1. Oculare 1. Obiettivo: all estremità di un tubo metallico (16 cm) A) Campione (oggetto) Davanti all oculare: immagine reale, capovolta ed ingrandita B) Davanti all'obiettivo immagine virtuale, capovolta ed ingrandita A B 10

11 Il microscopio ottico composto Obiettivo ed oculare sono inseriti all'estremità di un tubo metallico della lunghezza standard di 16 cm, appoggiato su un sostegno detto stativo, il quale regge anche il piatto dove viene posto il preparato daosservare. La distanza tra obiettivo e preparato può essere variata con un movimento a cremagliera del tubo, regolato da due viti, quella macrometrica per spostamenti rapidi e quella micrometrica per la messa a fuoco. Con movimenti laterali del piatto si può esaminare la parte del preparato che interessa di più. Sotto il piatto si trova il condensatore che fa convergere sull'oggetto la luce prodotta da una lampadina incorporata nel microscopio: il condensatore è munito di un diaframma regolabile. Oculare e obiettivo costituiscono il sistema ottico del microscopio; tubo, piatto, stativo, viti e condensatore, le parti accessorie. 11

12 Anatomia di un microscopio fotocamera o telecamera stativo fonte di illuminazione vite macrometrica e micrometrica oculari revolver con obiettivi tavolino traslatore condensatore diaframma di campo 12

13 I microscopi ottici: un moderno microscopio da ricerca 13

14 Anatomia di un microscopio 14

15 I microrganismi al microscopio Le cellule dei microrganismi e, soprattutto, le loro strutture cellulari sono troppo piccole per essere distinte ad occhio nudo. Ciò non dipende solo dalle dimensioni delle cellule (cellule eucariote mm, cellule procariote 1-5 mm) ma anche dal potere di risoluzione (capacità di vedere due oggetti come distinti). L occhio umano, nelle migliori condizioni ha un potere di risoluzione di 0,2 mm. Un altro aspetto importante è il contrasto dell oggetto da visualizzare: la maggior parte delle cellule sono troppo trasparenti per essere distinte dallo sfondo. 15

16 Concetti chiave 1. Ingrandimento 2. Potere di risoluzione: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti. -occhio umano: 0.2 mm -microscopio ottico: 0.2 µm (200 nm) -microscopio elettronico: nm 3. Contrasto 16

17 Le caratteristiche fondamentali di un microscopio ottico Ingrandimento èilrapportofraledimensionidell'immagineequelle dell'oggetto e dipende dal prodotto degli ingrandimenti forniti dall'oculare e dall'obiettivo, misurati di solito in diametri: Ingrandimento tot = Ingr. obiettivo (lineare) x Ingr. oculare (angolare) Oculari ed obiettivi portano indicato normalmente il proprio ingrandimento, in modo che si possa facilmente calcolare l'ingrandimento totale per le combinazioni dei diversi obiettivi ed oculari, intercambiabili nei microscopi moderni. 17

18 Principi di base: microscopio composto INGRANDIMENTO FISSO 10X oculare 10X, 40X,100X obiettivi Ingrandimento totale= Ingrandimento totale= Ingr. oculare X Ingr. obiettivo OBIETTIVO ED OCULARE LAVORANO INSIEME PER RISOLVERE L IMMAGINE L oculare risolve l immagine reale risolta dall obiettivo 18

19 Le caratteristiche fondamentali di un microscopio ottico Il potere di risoluzione èunindice della ricchezza di particolari che si possono osservare nella struttura di un'immagine. Supponiamo che una certa struttura contenga due piccoli punti molto vicini. Se le immagini di questi due punti si sovrappongono non li si vede più come distinti, ma come una struttura unica. Se invece l'immagine li presenta ancora separati possiamo dire che il microscopio ha risolto (separato) questi due punti. La distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti si chiama limite di risoluzione. 19

20 Il limite di risoluzione dei microscopi Il limite di risoluzione di un microscopio, cioè la minima distanza alla quale due punti possono essere visti come separati può essere calcolato con la formula: D = 0,5 N senα AN = N senα Apertura Numerica (AN) della lente dell obiettivo ovvero il suo angolo d accettazione della luce; è un valore che descrive le qualità della lente e rappresenta la misura del cono di luce che passa attraverso l'obiettivo. Per es: un obiettivo 100X ha una AN= 1,25 Dove èlalunghezzad ondadellasorgentediluceutilizzata,nè l indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente e preparato e α èilsemiangolodescrittodalconodilucecheattraversal'obiettivo 20

21 Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione -L obiettivo 100X è sempre ad immersione - L obiettivo 100X è retrattile -L olio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dell obiettivo 21

22 Principio della diminuzione della rifrazione della luce con immersione in olio Indice di rifrazione ( ): misura il grado di deviazione della luce che passa attraverso un mezzo ambiente Lenti a secco Lenti ad immersione in olio di materiali più comuni: Aria: Acqua: 1.3 Vetro: 1.6 Olio da immersione: 1.55 Vetrino coprioggetto ARIA Vetrino OLIO L olio possiede un indice di rifrazione quasi uguale a quello del vetro, per cui i raggi non vengono deviati, nel passaggio tra il vetrino e il mezzo interposto tra le lenti. 22

23 Le caratteristiche fondamentali di un microscopio ottico Il contrasto dipende dal diverso assorbimento della luce da parte delle strutture osservate, che risultano così più o meno intense, formando un'immagine. Poichè la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile per l'abbondanza di acqua, non si rivelerebbe quasi nessuna struttura cellulare; si preferisce perciò colorare il preparato con sostanze che si legano in modo selettivo ai componenti delle strutture cellulari, diversificandole. 23

24 Altri tipi di Microscopi ottici: in campo chiaro - scuro e a contrasto di fase CAMPO CHIARO: più comune, basata sulla proprietà della cellula di assorbire o disperdere la luce. Illuminazione dal basso (condensatore). Colorazione generalmente necessaria CAMPO SCURO: ideale per l osservazione di superfici. Illuminazione laterale. Colori falsi. CONTRASTO DI FASE : aumenta il contrasto tra cellule e mezzo circostante, sfruttando la differenza di fase della luce che attraversa le cellule in osservazione. Ideale per l osservazione di campioni in vivo. Campo scuro Contrasto di fase 24

25 Osservazione a contrasto di fase Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule mantenute in vita in apposite colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. 25

26 Osservazione a contrasto di fase Sfrutta le lievi differenze di spessore e della natura chimica (indice di rifrazione del materiale da osservare) rispetto al mezzo circostante. Le differenze di spessore ritardano l attraversamento della luce cioè si convertono in una deviazione di fase della luce. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. 26

27 Contrasto di fase Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa. Amplifica le differenze di fase tra cellule e ambiente, rendendo visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo. 1) Diaframma anulare/anello di fase (sotto il condensatore) 2) Lamina anulare (ritardatore, posteriore all obiettivo) 27

28 Contrasto di fase 28

29 Osservazione a contrasto di fase Un batterio (Lb. sakei), Contrasto di fase, 400x Un lievito (S. cerevisiae), Contrasto di fase, 400x Una muffa (G. candidum), Contrasto di fase, 400x 29

30 Osservazione a contrasto di fase Un attinomicete Contrasto di fase, 400x Un lievito (Y. lipolytica), Contrasto di fase, 400x Una muffa (R. oligosporus), Contrasto di fase, 400x 30

31 Osservazione in campo scuro Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico, come fasci di flagelli. Un particolare tipo di condensatore nell osservazione in campo scuro consente di deviare ifascidiluceinmodochelelenti frontali dell obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Soltanto la luce che colpisce il campione e viene riflessa in alto verso l obiettivo forma l immagine. Effetto: Luna illuminata su un cielo scuro!! 31

32 Osservazione in campo scuro 32

33 Microscopia a fluorescenza Imicroscopiafluorescenzadispongono di lampade alogene (mercurio o tungsteno) che hanno una forte emissione all estremità inferiore dello spettro del visibile. Gli obiettivi hanno un altissima AN per raccogliere anche la fluorescenza più debole. Inoltre, possiede due filtri speciali: 1) Filtro di eccitazione (tra la luce e il campione): lascia passare solo la luce a breve lunghezza d onda. 2) Filtro barriera (tra oculare ed obiettivo): blocca le radiazioni a lunghezza d onda minore, che sono passate attraverso il filtro eccitatore, ma lascia passare quelle più lunghe emesse dagli oggetti fluorescenti 33

34 Microscopio a fluorescenza Il percorso ottico del microscopio a fluorescenza Il filtro di eccitazione riflette la luce d'eccitazione a breve lunghezza d'onda sul preparato attraverso l'obiettivo. L'emissione prodotta viene raccolta dall'obiettivo e trasmessa. Poi i raggi passano attraverso il filtro di emissione o barriera, dove viene filtrata la residua luce di eccitazione. La lente del tubo e l'oculare formano come d'uso l'immagine microscopica, che si compone ora solamente di luce di fluorescenza 34

35 Microscopio a fluorescenza Schema sorgente di luce 1. Globo di quarzo 2. e 3. Catodo e Anodo 4. Camera di combustione 5. Arco voltaico linee del mercurio nm

36 Microscopia a fluorescenza Fluorocromi: reagenti speciali in grado di assorbire la luce ad una determinata lunghezza d onda - e di emetterla poi nuovamente ad una lunghezza d'onda maggiore. I diversi fluorocromi presentano ognuno un proprio spettro di assorbimento specifico, in funzione della struttura interna delle molecole a fluorescenza. In microscopia quest'effetto è molto utile: le strutture marcate con molecole fluorescenti s'illuminano (solitamente di rosso, di azzurro o di verde) contro uno sfondo nero. 36

37 Reazioni di immunofluorescenza Metodo diretto: l anticorpo marcato si lega all antigene, formando un immunocomplesso fluorescente Metodo indiretto: l anticorpo non marcato si lega all antigene, l immunocomplesso; quindi viene aggiunto un anticorpo anti-ig marcato che si lega all immunicomplesso, rendendolo fluorescente. 37

38 20/03/2013 COLORANTI FLUORESCENTI UTILIZZATI DAPI (diamidino-2-fenilindolo), syber green, isotiocianato di fluorescina, rodamina... Sono i coloranti fluorescenti maggiormente utilizzati nella microscopia a fluorescenza 38

39 ! colorazione fluorescente: DAPI! attraversa la membrana cellulare! lunghezza d onda 358 nm! visualizzazione cellule vive o fissate! microscopia a fluorescenza [4',6-diamidino-2-phenylindole ] Campione + DAPI Microscopio a fluorescenza 39

40 DAPI SYBR-GREEN 40

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42 DAPI A simple-to-use fluorescent stain, 4',6- diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. (a) and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom (b) culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture (c) at time zero. Upper panel magnification was 10006, lower panel (d) magnification was

43 MICROSCOPIO CONFOCALE Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione. Il Microscopio confocale è un microscopio ottico, uno strumento scientifico che si basa su una tecnologia volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato. Lo strumento opera nel campo convenzionale degli ingrandimenti della normale microscopia ottica, ed è schematicamente costituito da un normale microscopio ottico a cui viene sovrapposto un apparato che si occupa di illuminare e rilevare l'immagine di un campione illuminato con una scansione punto a punto. 43

44 Intensità luminosa Segnale elettrico Digitalizzazione 1 punto = 1 pixel Microscopio confocale a scansione laser: CLSM (confocal laser scanning microscope), èunevolutomicroscopioafluorescenzachepermette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo. La sua sorgente luminosa ècostituitaunoopiùlaser,generalmenteasemiconduttore,perognidiversa frequenza d'eccitazione richiesta. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare in diversi colori diverse molecole presenti nel preparato, permettendone di apprezzarne la tridimensionalità 44

45 MICROSCOPIO CONFOCALE Spostamento verticale della sezione ottica Sovrapposizione singoli piani Ricostruzione 3D 45

46 Microscopia ottica ed elettronica Oculare Fascio di elettroni Lente magnetica Obiettivo Campione Campione Lente obiettivo Lente proiettore Microscopia ottica Fonte luminosa Immagine schermo fluorescente Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 46

47 Elettronico a trasmissione Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici degli stessi Localizzazione di molecole interne a cellule o tessuti preventivamente marcati Osservazione di virus Elettronico a scansione Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici di cellule o tessuti Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcati 47

48 Confronto tra TEM e SEM SEM Immagini al microscopio elettronico a scansione e a trasmissione TEM 48

49 Comparazione tra diversi tipi di microscopi Tipo Caratteristiche Come appare Uso Campo chiaro Luce visibile Campione colorato in campo chiaro Organismi fissati Campo scuro Luce visibile con uno speciale condensatore Campione luminoso in campo scuro Organismi viventi Contrasto di fase Luce visibile con doppio anello nel condensatore che causa distorsione dei raggi I corpi batterici hanno diverso grado si luminosità Organismi viventi in dettaglio Fluorescenza Luce ultravioletta che eccita molecole che emettono luce a differente lunghezza d onda Background scuro e campione colorato e luminoso Microscopia diagnostica TEM Fascio di elettroni e lenti elettromagnetiche Altissimo ingrandimento non tridimensionale Esame di sezioni fini, con dettaglio delle strutture interne SEM Vedi TEM Visione tridimensionale Esame dell esterno delle cellule 49

50 Le colorazioni in Microbiologia Perché colorare? La cellula batterica è trasparente contrasto insufficiente tra cellula batterica ed ambiente circostante. I coloranti debbono consentire: forte contrasto tra i microrganismi ed il fondo differenziazione di vari tipi morfologici (forma, organizzazione, colorazione Gram) evidenziazione di alcune strutture (flagelli, capsule, endospore) 50

51 Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati Fissazione (al calore o chimica): Le cellule devono essere conservate e bloccate prima della colorazione, per inattivare gli enzimi che potrebbero alterare la morfologia cellulare e la forma delle cellule stesse. Colorazione Coloranti (basici o acidi): 1) sali in cui uno dei due ioni èrappresentatodaungruppocromoforo;2)silegano alla cellula mediante legame ionico, covalente o idrofobo. 51

52 I coloranti si distinguono in: Coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana, cristalvioletto, tionina): Carica positiva Affinità per le strutture acide (superficie cellulare, proteine, acidi nucleici) colorazione diretta Coloranti acidi (eosina, negrosina, rosso Congo): Carica negativa Affinità per le strutture basiche, si depositano attorno al microrganismo colorazione indiretta o negativa 52

53 Le colorazioni in Microbiologia Preparativa Altri reagenti per colorazioni Mordenzanti, sostanze che fissano il colorante od amplificano l ingombro del campione: fenolo, soluzione iodo-iodurata Sostanze decoloranti: alcool-acetone, acido solforico al 20% 53

54 Differenti tipi di colorazioni Tipo Esempio Risultato Campo di applicazione Colorazione semplice: uso di un solo colorante per distinguere cellule o strutture Blu di metilene, cristal violetto, safranina Colore uniforme Forma o aggregazione cellulare Colorazione differenziale: uso di un secondo colorante differenziale Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen o acido-resistenza Viola/rosso Acidoresistenti, rossi/blu Gram + e Gram Mycobacterium e Nocardia Colorazioni speciali: colora diverse strutture specializzate Sali d argento per i flagelli; verde di malachite per la spora; colorazione negativa per la capsula Neri Verde Chiara Flagelli Spora Capsula 54

55 Tecniche di colorazione Colorazioni differenziali e speciali Colorazione di Gram Colorazione per bacilli acido-resistenti: Metodo di Ziehl-Neelsen Metodo a freddo di Kinyoun Metodo della fluorescenza con auramina Colorazione della capsula Colorazione di flagelli (Leifson) Colorazione di spore Colorazione di lieviti e funghi Colorazione di spirochete 55

56 Le colorazioni in microbiologia Allestimento di un preparato " Porre un ansata di colonia (o sospensione) batterica al centro di un vetrino pulito # Se si preleva il materiale da terreno agarizzato, aggiungere una goccia di acqua distillata al campione 56

57 Le colorazioni in microbiologia Allestimento di un preparato $ Aiutandosi con un ansa, stemperare il campione nell acqua e stendere il preparato a coprire circa la metà della superficie del vetrino (preparazione dello smear) % Lasciare asciugare il preparato all aria o tramite calore (Bunsen). Fissare il preparato passando il vetrino 4-5 volte direttamente sulla fiamma 57

58 Hans Christian Joachim Gram Batteriologo danese ed inventore della colorazione di Gram (nel tentativo di differenziare Klebsiella pneumoniae dagli pneumococchi) Nato a Copenhagen il 13 Settembre

59 La colorazione di Gram 1. Aggiunta del cristal violetto 2. lavaggio 59

60 La colorazione di Gram 3. Aggiunta del mordenzante, una soluzione iodio-iodurata (Lugol) 4. lavaggio 60

61 La colorazione di Gram 5. Dopo la decolorazione con alcool-acetone il passaggio finale è la colorazione di contrasto con safranina 61

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65 Colorazione di Gram Principio Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all interno della cellula. Il decolorante condensa per disidratazione la struttura petidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene catturato dalla parete cellulare Nei batteri Gram- il decolorante, agendo come solvente lipidico, dissolve la membrana esterna della parete cellulare così permettendo il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica. 65

66 La colorazione di Gram Un Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo 66

67 Non sempre funziona! La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i batteri. Esempi consistono nel Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae Incapacità di colorare per la natura cerosa dell involucro esterno, altamente impermeabile ai coloranti Colorazione di Ziehl-Nielsen 67

68 La colorazione di Ziehl-Neelsen - per batteri acido-resistenti (Micobatteri). L alto contenuto in lipidi della parete cellulare, permette di trattenere la colorazione della fucsina basica di Ziehl anche quando trattati con decoloranti come l'alcool o gli acidi minerali. Risultato: Fondo.: blu-azzurro Batteri alcool-acido resistenti: rossi 68

69 Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica Step 1: Versare la fucsina basica Step 2: Step 2: Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 min Lavare con acqua 69

70 Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica Step 3: Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min) Lavare con acqua Step 4: Contrastare con blu di metilene per 1-2 min Lavare con acqua 70

71 Colorazione di Ziehl-Neelsen Osservazione microscopica Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu 71

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73 Le colorazioni in Microbiologia Colorazioni speciali Colorazione negativa: strutture che non si colorano (es. Capsula) Spore: calore per facilitre la penetrazione del colorante Flagelli: mordenzante per ispessire la struttura flagellare 73

74 La colorazione delle capsule Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus: Capsule colorate con colorazione negativa (inchiostro di china) 1000x, campo chiaro 74

75 La colorazione delle spore Le endospore vengono colorate con il verde di malachite, a caldo, e visualizzate col microscopio a contrasto di fase. Resistenza alla decolorazione us.html 75

76 La colorazioni dei flagelli (Leifson) Colorazione di Leifson (sali d'argento). Cellule flagellate di Helicobacter pylori 76

77 Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata 1. Su un vetrino portaoggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica 2. Si usano cautele di asepsi per prelevare il materiale da osservare 77

78 Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata Un batterio Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus Campo chiaro, 1000x 78