COLORAZIONI SPECIALI

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1 Marco Grillini 1 Stefano Simonazzi 2 1- S.S.D. Diagnostica istopatologica e molecolare degli organi solidi e del relativo trapianto 2- U.O. Anatomia e Istologia Patologica Policlinico Sant Orsola Malpighi, Bologna

2 Colorazione speciale: qualsiasi tecnica per colorare le sezioni, esclusa l Ematossilina Eosina Scopo delle colorazioni speciali: Identificare la presenza o assenza di una determinata classe di molecole Localizzare queste molecole nel preparato Dare una quantificazione approssimativa (es. grado di fibrosi) In maniera più appropriata si potrebbero chiamare «COLORAZIONI MIRATE».

3 COLORAZIONI SPECIALI Cenni storici Le colorazioni istologiche hanno più di cent anni I coloranti utilizzati nell istologia provengono dall industria tessile I primi coloranti erano di origine naturale (cocciniglia, indaco, ematossilina) Il primo colorante artificiale è stato scoperto da Perkin nel 1856 a partire dall anilina L anilina sarà la base per numerosi coloranti usati in istologia (fucsina, eosina, blu di metilene) Campionario di tessuti del 1845

4 Standardizzazione Stabilire in maniera uniforme i metodi, i criteri, i processi delle colorazioni e le specifiche tecniche dei coloranti Ottenere risultati riproducibili in paesi diversi

5 Standardizzazione Per standardizzare le procedure delle colorazioni speciali bisogna stabilire regole uniformi su: Pre-analitica: condizioni di prelievo del campione, tempi di fissazione, processazione, taglio Analitica: sparaffinatura, protocolli, coloranti, reagenti Post-analitica: criteri di valutazione al microscopio Il campione biologico non è standardizzabile!

6 Standardizzazione: coloranti

7 Automazione: Vantaggi Riproducibilità Limitazione all esposizione di sostanze tossiche Ottimizzazione dei tempi Ottimizzazione delle risorse

8 Difficoltà nell automazione Complessità di alcuni protocolli (differenziazione, decolorazione) Variabilità dei protocolli (reagenti utilizzati, tempi di incubazione, lavaggi) Strumenti chiusi

9 COLORAZIONI SPECIALI BSC: Organizzazione senza scopo di lucro che certifica i coloranti per uso scientifico.

10 COLORAZIONI SPECIALI BSC: Storia Difficoltà per i primi patologi che utilizzavano colorazioni nel riconoscere le strutture istologiche Manca la garanzia di qualità! 1880: Grübler, allievo del Dr. Weigert, apre la prima azienda di coloranti per l istologia Prima Guerra Mondiale: blocco dell esportazione di prodotti tedeschi. Gli USA rimangono senza coloranti Numerosi problemi con i coloranti americani 1923: nasce la Commissione per la Standardizzazione dei coloranti Frank Mallory ( ) 1944: BSC

11 BSC: Obiettivi 1. Assicurare la qualità dei coloranti tramite controlli indipendenti in accordo a rigorosi criteri chimici e di performance 2. Promuovere la cooperazione e il dialogo tra i produttori, i fornitori e gli utilizzatori dei coloranti per l istologia 3. Formazione degli utenti su come ottenere coloranti affidabili e sulla loro efficacia nei protocolli di colorazione 4. Pubblicare aggiornamenti su innovazioni o miglioramenti delle colorazioni istologiche

12 BSC: Valutazione della qualità del colorante Analisi della composizione e concentrazione Valutazione delle prestazioni mediante procedure standardizzate Emissione di etichette di certificazione da apporre sui contenitori Sostegno della ricerca sui coloranti e sulle tecniche istologiche The BSC certifies dye powders, not staining solutions.

13 Caratteristiche di un colorante di qualità 1. Elevata specificità 2. Assenza di sostanze contaminanti (possono interferire con la colorazione) 3. La purezza non è necessariamente importante 4. Certificazione

14 La composizione dei coloranti non rimane immutata nel tempo, ma varia con l evolversi e il modificarsi delle procedure di produzione (ad es. per raggiungere nuovi standard di sicurezza). Bisogna adattare i protocolli!

15 Il vetrino per il Controllo di Qualità Necessario per: Capire se la colorazione speciale funziona Valutare il grado di colorazione aspecifica Determinare se un reagente è ancora attivo Avere un parametro di riferimento se la colorazione è negativa

16 Controllo di qualità Tipologia di controlli: 1. Qualitativi: devono contenere gli elementi che si ricercano (es. presenza di microrganismi, funghi, amiloide) 2. Semi-quantitativi: permettono di distinguere il livello di intensità della colorazione (es. fibre reticolari, tricromica)

17 COLORAZIONI SPECIALI Controllo di qualità: Tissue MacroArray (TMA) Vantaggi: Uso di un solo vetrino con il TMA e la sezione da colorare Progettazione personalizzata (controllo qualitativo o semiquantitativo, esigenze del laboratorio) Contiene il controllo negativo

18 COLORAZIONI SPECIALI Controllo positivo: GRAM + 40X

19 COLORAZIONI SPECIALI Controllo positivo: ZIEHL-NEELSEN 40X

20 COLORAZIONI SPECIALI Controllo positivo: ZIEHL-NEELSEN 40X

21 COLORAZIONI SPECIALI Controllo positivo: GIEMSA HP 40X

22 Tips & Tricks Spessore delle sezioni (sezioni più spesse per evidenziare gli accumuli; sottili per i dettagli) Utilizzo di reagenti che non decolorano (isopropanolo durante la disidratazione) Corretta conservazione reagenti

23 COLORAZIONI SPECIALI Presente e futuro Patologia oncologica

24 Presente e futuro: importanza delle colorazioni speciali Patologia vascolare (nello stabilire il grado di fibrosi e frammentazione delle fibre elastiche) Patologia renale Patologia epatica (PAS-D, Ferro, Reticolo) Ricerca di microrganismi

25 Qualità superiore all immunoistochimica Perché le colorazioni speciali sono ancora utili: Per stabilire il grado di fibrosi e di frammentazione delle fibre elastiche (Tricromica, Weigert). Con i marcatori IHC c è il rischio di cross-reazioni Il PAS è in grado di evidenziare minime quantità di mucopolisaccaridi e glicogeno Tempi brevi (Gram)

26 COLORAZIONI SPECIALI Patologia renale Agarwal SK, Sethi S, Dinda AK. Basics of kidney biopsy: A nephrologist s perspective. Indian Journal of Nephrology. 2013;23(4): doi: /

27 CD3 - PAS

28 ROSSO CONGO: 134 anni di storia in breve

29 ROSSO CONGO: Vetrino digitale???

30 ROSSO CONGO

31 COLORAZIONI SPECIALI VON KOSSA 1901 «Sulle calcificazioni prodotte artificialmente nell organismo» 2017

32 COLORAZIONI SPECIALI TRICROMICA e FIBRE ELASTICHE

33 COLORAZIONI SPECIALI RAME GROCOTT

34 COLORAZIONI SPECIALI