Preparazione soluzioni, sol. tampone, sol. di Ag., decal. Tecniche di Anatomia Patologica Dott. Giorgio Bettarelli

Transcript

1 Preparazione soluzioni, sol. tampone, sol. di Ag., decal.

2 materiali Polveri Liquidi Acqua kit

3 Si misurano Polveri: Liquidi: Kg. = chilogrammi hg. = ettogrammi gr.= grammi mg. = milligrammi μg. = microgrammi lt. = litri dl. = decilitri cl.= centilitri ml. = millilitri (cc) μl. = microlitri (λ)

4 Polveri Le polveri vengono misurate in grammi ed spesso entrano nella preparazione delle soluzioni in una certa percentuale. Ad esempio: sol cloruro di sodio allo 0,09% Cloruro di sodio 0,09 g Acqua distillata 100 g / ml / cc Di volume finale

5 Soluzioni Nelle soluzioni generalmente si usa chiamare soluto o fase dispersa la sostanza (o le sostanze) in quantità minore e solvente o fase disperdente la sostanza in quantità maggiore. Quando, le sostanze sono in differenti stati fisici si definisce solvente la sostanza che conserva il suo stato.

6 Liquidi I liquidi vengono misurati in millilitri o centimetri cubi ed spesso entrano nella preparazione delle soluzioni in una certa percentuale. Ad esempio: sol ac. acetico glaciale all 1% ac. acetico glaciale Acqua distillata Volume finale = 100 ml 1 ml 99 ml / cc

7 Kit In tutti i kit di colorazione trovate le istruzioni per la preparazione. Spesso le quantità possono essere indicate in gocce e sono contenute in appositi boccettini contagocce.

8 La ricetta Nella preparazione di tutte le soluzioni seguire sempre scrupolosamente le istruzioni contenute nella metodica

9 La ricetta Prima di iniziare qualunque preparazione assicurarsi di avere a disposizione tutto il materiale occorrente: reagenti, beute, cilindri, matracci, bilance, contenitori, carta da filtro ecc...

10 Soluzioni Molari E una soluzione che contiene La quantità in grammi pari al peso molecolare (1 grammo molecola) della sostanza disciolta in un litro di H 2 O. Es: Sol. M di Sodio glicerofosfato pm. = 315,13 Soluzione 0,01M = 3,1513 g in 1000 ml Peso molecolare x la molarità desiderata = grammi di sostanza in 1000 ml di H 2 O

11 Soluzioni Normali E una soluzione che contiene 1 grammo in peso molecolare della sostanza diviso per l equivalente idrogeno della sostanza stessa (valenza) In 1000 ml di H 2 O Sodio idrossido NaOH Pm = 40.0 Valenza = 1 Sol 1N = 40g in 1000 H 2 O

12 Soluzioni Normali Per quanto riguarda gli acidi la formula ml di ac. per ml di H 2 O distillata: Peso molecolare Valenza x gravità specifica x concentrazione HCl = pm 36,4 valenza1, gravità spec. 1.18, conc. 36%, =85,6 ml in 1000 ml H 2 O

13 Soluzioni Normali Acido solforico H 2 SO 4 Peso molecolare 98,08 Valenza 2 gravità specifica concentrazione 98,% 98,08 2 x x 0,98 =27,27 ml

14 Gli elettroliti sono quei composti che in soluzione dissociano spontaneamente in cationi(h + ) O in anioni (OH - ) Per un acido debole la costante di dissociazione Ka= [A-] [H+] [AH] pk = logaritmo negativo della costante di dissociazione K (-logk)

15 Bassi valori di pk = acido forte Alti valori di pk= acido debole

16 soluzioni tampone Una soluzione tampone è una soluzione formata da una coppia coniugata acido/base, che, nei limiti definiti dal potere tampone, resiste alle variazioni di ph Può essere costituita da: acido debole / base coniugata (Es.: CH 3 COOH / CH 3 COONa) base debole / acido coniugato (ES,: NH 3 / NH 4 Cl)

17 soluzioni tampone Le concentrazioni dei due componenti la coppia devono essere sufficientemente grandi e pressoché uguali (e comunque in un rapporto compreso fra ). Il ph di soluzioni di questo tipo dipende dal valore della pka e dal rapporto tra Ca (concentrazione iniziale della specie acida) e Cb (concentrazione iniziale della specie basica), e non dai singoli valori delle due concentrazioni.

18 soluzioni tampone Due soluzioni della stessa coppia coniugata con concentrazioni iniziali diverse ma con il rapporto Ca/Cb uguale hanno lo stesso valore di ph; in particolare se Ca/Cb = 1 risulta ph = pka. Inoltre, se si diluisce o si concentra una soluzione di questo genere, poichè Ca e Cb variano dello stesso fattore, il rapporto Ca/Cb rimane inalterato con la conseguenza che il ph della soluzione rimane praticamente costante. Questa è una proprietà caratteristica ed importante delle soluzioni tampone, non riscontrabile nelle soluzioni contenenti o solo acidi o solo basi.

19 soluzioni tampone Un'altra interessante proprietà riguarda la risposta delle soluzioni tampone, misurata in termini di variazione di ph, all'aggiunta di acidi o basi. Il potere tamponante cresce al crescere delle concentrazioni Ca e Cb all avvicinarsi a 1 del rapporto Ca/Cb.

20 soluzioni tampone Sono generalmente composte da due soluzioni madre Che miscelate tra loro danno origine a 2 equilibri competitivi: Ad esempio per il CH 3 COOH / CH 3 COONa Le conc. di H 3 O + e di OH - (quindi il ph) dipendono dai rapporti tra le due soluzioni

21 soluzioni tampone Tampone acetato Sol. madre PH 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 Sodio acetato Ac. acetico Acqua distill. 0,2 M 1,64 g/100 0,2 M 1,2 ml/100 3, ,2 19,5 24, ,2 39,5 46, , , ,8 10,

22 soluzioni tampone Tampone fosfato Sol. madre PH Sodio fosfato monoba -sico Sodio fosfato bibasico 0,2 M 2,75 g/100 0,2 M 2,83 ml/100 36,7 31,2 25,5 19,5 14 9,5 6,5 4,2 2,6 13,3 18,8 24, ,5 43,5 45,8 47,4 Acqua distill

23 soluzioni tampone Veronal acetato citrato ac. citrico Fosfato citrato Tris maleato Tris HCl Sorensen PBS

24 soluzioni di argento I Sali di argento in particolare il nitrato di argento AgNO 3 sono spesso utilizzati in colorazioni istochimiche: Melanina Fibre nervose Reticolo Cellule enterocromaffini ricerca Helicobacter pilori

25 soluzioni di argento COME AGISCONO Argentaffinità o argirofilia = le cellule sono in grado di legare e ridurre direttamente i Sali di Ag Argentofilia = proprietà istochimica di legare i Sali di Ag ma non di ridurli

26 soluzioni di argento Nella preparazione delle soluzioni di Ag deve essere posta la massima attenzione alla pulizia della vetreria e di tutti gli oggetti che potranno venire a contatto con l Ag. Tutto deve essere ben lavato e sciacquato più volte in acqua distillata

27 soluzioni di argento Le soluzioni di Ag ammoniacale furono introdotte nella tecnica microscopica da BIELSCHOWSKY che ridusse i Sali d argento in argento metallico mediante l uso formaldeide formando così una soluzione colloidale contenente particelle di metallo dotate di carica negativa che vengono attratte dalla superficie delle strutture dei tessuti dotati di carica opposta. In queste soluzioni l argento si trova per lo più presente sotto forma del catione complesso Ag(NH 3 ) 2 +

28 soluzioni di argento SOLUZIONE DI Ag AMMONIACALE METODO GOMORI PER FIBRE RETICOLARI A 10 ml di soluz. acquosa di nitrato d argento al 10% si uniscono 2 ml di soluz. Acquosa di K OH (potassa caustica) al 10%. Si forma un precipitato bruno. Sciogliere il precipitato agitando e versando ammoniaca (NH 4 ) a goccia a goccia fino a che il precipitato scompaia completamente. Sempre agitando aggiungere a goccia a goccia AgNO 3 fino a che il precipitato che si forma si dissolve lasciando infine la sol leggermente opalescente. Raddoppiare il volume con H 2 O distillata.

29 soluzioni di argento La soluzione di Ag ammoniacale deve essere conservata in bottiglia scura al buio e, secondo il BECCARI, rimane attiva per non più di due giorni

30 soluzioni decalcificanti La decalcificazione è una tappa fondamentale nella routine istopatologica ossea. Tutti i tessuti prima di essere sottoposti a decalcificazione devono essere perfettamente fissati. La completa fissazione impedisce, infatti, che l azione corrosiva dei decalcificanti danneggi i tessuti. La quantità di decalcificante deve essere pari almeno a 3 volte il volume del tessuto da decalcificare e deve essere cambiata spesso.

31 soluzioni decalcificanti In ambiente acido il calcio viene estratto con la seguente reazione: Ca CO 3 +2H + = Ca ++ + H 2 O + CO 2

32 soluzioni decalcificanti Le sostanze acide più usate sono: Ac. acetico glaciale Ac. cloridrico Ac. formico Ac. nitrico Ac. citrico Ac. tricloroacetico Ac. picrico

33 soluzioni decalcificanti E possibile effettuare la decalcificazione usando agenti chelanti si tratta di composti organici che hano la proprietà di legare certi metalli come il calcio e il ferro. Decalcificano lentamente: EDTA sale disodico dell Ac. etilendiamino tetraacetico

34 soluzioni decalcificanti decalcificante acido Ac. cloridrico Ac. formico Acqua distillata 40 ml 50 ml 1000 ml

35 soluzioni decalcificanti EDTA 0,5 M Sciogliere a caldo in 1 lt. di H 2 o distillata 37,22 gr. di EDTA. lasciare intiepidire e aggiungere 70 ml di HCl concentrato. lasciar riposare almeno 12 ore. Filtrare.

36 soluzioni decalcificanti Protocollo per B.O.M. La biopsia osteomidollare va pesata e posta in una provetta con una quantità di decalcificante EDTA pari al suo peso (es. 2,5 gr. Il peso 2,5ml decal) deve essere lasciata in questa soluzione per 2,5 ore o fino a che non galleggia sulla superficie sciacquare velocemente in acqua poi va posta in alcool 70 fino all inizio della processazione che deve iniziare dall alcool.

37 Diluizioni La diluzione consiste nell aumentare la quantità (volume del solvente) in una soluzione. Rimanendo invariata la quantità del soluto diminuisce la concentrazione della soluzione

38 Diluizioni Ad es. 5X (leggi: "5 per") vuol dire che la sol. è 5 volte più concentrata del necessario. Per arrivare alla concentrazione corretta (1X) si dovrà diluire 5 volte. Altra dizione può essere 1:5 Ovvero 1 parte su 5 totali Quindi 1 parte più 4

39 Diluizioni Utile quando si utilizzano soluzioni di più composti per cui non ha senso definire la concentrazione assoluta. Ad esempio, non è possibile definire la molarità una soluzione come il PBS (Phosphate Buffered Saline), che contiene 137 mm NaCl, 10 mm fosfato e 2.7 mm KCl; PBS 1X (concentrazione d'uso) PBS 3X, 5X, 10X in caso di soluzioni stock più concentrate. È anche possibile ottenere, ad esempio, una soluzione 0.5X, diluendo 2 volte la soluzione 1X

40 Diluizioni Formula x alcool Vx= volume di H2O da aggiungere V= volume di alcool da ridurre C1= concentrazione che vogliamo ridurre C2= concentrazione che vogliamo ottenere Vx= V x C1 C2 - v

41 Diluizioni Es. alcool: quanta acqua devo aggiungere a 100ml di alcool 95 per ottenere un alcool 80 Vx= volume di H 2 O da aggiungere V= 100 ml C1= 95 C2= x 95 Vx = Vx=18 ml

42 Diluizioni Vx= volume di H 2 O da aggiungere V= 400 ml C1= 30% C2= 10% 400 x 30 Vx = Vx= 800 ml

43 Diluizioni Vx= volume di H 2 O da aggiungere V= 500 ml C1= 50% C2= 25% 500 x 50 Vx = Vx= 500 ml

44 Si calcoli la quantità di Alcool a 70 necessaria a preparare 60 ml di soluzione a 43 V1 = Volume iniziale C1 = Concentrazione iniziale V2 = Volume finale C2 = Concentrazione finale V 1. C 1 = V 2. C 2 V = > V 1 = / 70 = 36.86

45 Diluizioni Diluizioni 1 : X (uno a X) Significa una parte su un totale di x parti Es. 400 μl di una sol 1:4 = 100 μl di sol μl di diluente 1x400 Proporzione 1:4=X:400 X= =100 (conc.) = 300 (diluente)

46 Diluizioni Diluizioni seriali (scalari): sono diluizioni fatte in serie, si parte da una soluzione iniziale e la si diluisce poi da questa si prende una parte e la si diluisce ulteriormente, e così via fino a formare una serie di diluizioni. Ad es. diluizioni seriali 1:10, 1:5, 1:2... Quando le diluizioni seriali vengono fatte diluendo sempre una parte della soluzione precedente in 2 parti di soluzione totale (1 parte di soluzione + 1 parte di solvente) vengono dette diluizioni al raddoppio.

47 Diluizioni N diluente Diluizione Al raddoppio 1 0 Indiluita 20 μl 2 10 μl 10 μl 1:2 diluizione 1:2 dal pozzetto μl 10 μl 1:4 diluizione 1:2 dal pozzetto μl 10 μl 1:8 diluizione 1:2 dal pozzetto μl 10 μl 1:16 diluizione 1:2 dal pozzetto μl 10 μl 1:32 diluizione 1:2 dal pozzetto 5

48 Diluizioni diluizione seriale 1:10 N Diluizione 1 Indiluita 2 1:10 preparata facendo una diluizione 1:10 dalla provetta 1 3 1:100 preparata facendo una diluizione 1:10 dalla provetta 2 4 1:1000 preparata facendo una diluizione 1:10 dalla provetta 3 5 1:10000 preparata facendo una diluizione 1:10 dalla provetta 4 6 1: preparata facendo una diluizione 1:10 dalla provetta 5

49 Diluizioni Ricordare la seguente equazione : C 1 V 1 = C 2 V 2 Dove: C 1 = Concentrazione iniziale o molarità. V 1 = Volume iniziale. C 2 = Concentrazione finale o molarità. V 2 = Il volume finale

50 Diluizioni oppure: Vi x Ci = Vf x Cf con : Vi = volume iniziale Ci = concentrazione iniziale Vf = volume finale Cf = concentrazione finale In questo caso, conoscendo tre dei quattro parametri, è possibile ricavare il quarto. Ad esempio, vogliamo ottenere 100 ml di una soluzione 50 mm a partire da una soluzione stock 1M. Quanto stock dobbiamo usare? Conosciamo Ci = 1M = 1000 mm, Cf = 50 mm e Vf = 100 ml Notare che è importante utilizzare unità di misura coerenti. Ad esempio si devono esprimere i valori o tutti in l o tutti in ml. Il pratica è la proporzione in cui: Il volume iniziale sta alla concentrazione iniziale come il volume finale sta alla concentrazione finale

51 esercizi quantità richiesta diluizione quantà di diluente quantità di anticorpo : : : : : : : :

52 esercizi quantità richiesta diluizione quantà di diluente quantità di anticorpo : : : : : : : :

53 esercizi Nel caso di alte diluizioni può essere necessario effettuare una prediluizione prediluizione 1:500 La formula sarà Dil = Vf Cf Ci

54 esercizi Nel caso di alte diluizioni può essere necessario effettuare una prediluizione prediluizione 1:500 Richiesto diluizione 500 pred : : : : : :