Fosforilazione ossidativa

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1 Chimica Biologica A.A Fosforilazione ossidativa Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Teoria Chemiosmotica ΔG = 2.3 RT (ph (matrice) -ph (spazio itermembr) ) + ZFΔψ - se H + è trasportato da una regione negativa ad una positiva Δψ >0 il trasporto di H + dalla matrice allo spazio intermembrana (contro il gradiente protonico) è un processo endoergonico lo scarico del gradiente protonico è esoergonico

3 Teoria Chemiosmotica NADH + H + + ½O 2 NAD + + H 2 O ΔG = RT ln(c 2 /C 1 ) + zf ΔΨ ΔG = 2.3RT ΔpH + F ΔΨ ΔG = -220 kj/mol Forza proton-motrice 2 componenti: differenza di [H + ] differenza di potenziale elettrico ΔΨ = V (potenziale di membrana) ΔpH = 0.75 ΔG = 20 kj/mol (H + ) 10H + N 10 H + P ΔG = +200 kj/mol l energia libera dell ossidazione del NADH da parte dell O 2 viene efficientemente convertita in gradiente elettrochimico di H +

4 Teoria Chemiosmotica - in condizioni fisiologiche l energia libera per la sintesi di un ATP è ~40-50 kj/mole almeno 2 H + devono tornare indietro nella matrice mitocondriale per generare tale energia libera - l ATP sintasi utilizza tale energia libera per la fosforilazione dell ADP

5 Teoria Chemiosmotica - per ogni coppia di e - trasportata dal NADH all O 2 attraverso la catena respiratoria sono traslocati 10 H + dal lato N a quello P della membrana interna il ritorno di 10 H + dal lato P a quello N rende disponibile ~200 kj di energia libera ADP + Pi + nh + P ATP + nh + N Quindi l accoppiamento tra la reazione: e la reazione: NADH + H + + ½O 2 NAD + + H 2 O ADP + Pi ATP è mediato dal trasporto vettoriale di H + nelle due direzioni attraverso la membrana interna rispettivamente contro e a favore del gradiente elettrochimico

6 ATP sintasi pompa protonica o F 1 F 0 -ATPasi (complesso V) F 0 : proteina transmembrana fino a 8 tipi di subunità F 1 : proteina periferica di membrana (solubile) 5 tipi di subunità - F 1 solubilizzato idrolizza ATP ma non lo sintetizza ( ATP-asi) - F 1 proiettato all interno della matrice F 1 stelo ~50 Å F 0

7 Componente F 1 subunità α 3 β 3 γδε subunità α e β: - 20% identiche in aa - α e β stesso fold ed arrangiamento alternato -soloβ catalizza la sintesi di ATP α β γ 20 Å subunità γ: - elica C-terminale di 90 Å - stelo ~30 Å (coil-coil antiparallelo eliche N-term e C-term) F 1 -ATP sintasi da mitocondri di cuore bovino

8 Componente F 0 subunità a 1 b 2 c 9-12 (E. coli) Subunità ε subunità c: 2 eliche che formano 2 anelli concentrici transmembrana subunità a: 5 eliche transmembrana Subunità c Asp 61 deprotonato Asp 61 protonato subunità b: - singola elica transmembrana - dominio polare (dimero) che contatta le subunità δα 3 β 3 di F 1

9 Macromolecole Biologiche Complesso F1-c10 da lievito

10 ATP sintasi: meccanismo del cambiamento di legame -sintesi di ATP mediante translocazione di protoni (dallo spazio intermembrana alla matrice mitocondriale) da parte dell ATP sintasi 3 tappe: 1) translocazione di protoni promossa da F 0 2) formazione catalitica del legame fosfoanidridico dell ATP da parte di F 1 3) accoppiamento della dissipazione del gradiente protonico con la sintesi di ATP, che necessita l interazione di F 1 con F 0 Meccanismo del cambiamento di legame: - F 1 possiede 3 protomeri catalitici (subunità αβ) interagenti fra loro ma ognuno dei quali con un diverso stato conformazionale: stato L (loose), stato T (tight), stato O (open)

11 ATP sintasi: meccanismo del cambiamento di legame stato L: substrati e prodotti si legano debolmente alla subunità αβ di F 1 stato T: substrati e prodotti si legano saldamente stato O: substrati e prodotti non si legano -l ATP viene sintetizzato solo nello stato T -l ATP viene rilasciato solo nello stato O - l energia libera rilasciata durante la translocazione dei protoni viene utilizzata per interconvertire questi 3 stati conformazionali

12 ATP sintasi: meccanismo del cambiamento di legame 1) ADP e Pi si legano debolmente alla subunità ab di F 1 nello stato L 2) - conversione del sito L in sito di legame T dovuto ad un cambio conformazionale promosso dal rilascio di energia libera - concomitante conversione del sito T (contenente ATP legato) a sito O e sito O in sito L 3) sintesi di ATP nel sito T, dissociazione di ATP dal sito O L energia libera fornita dal flusso di protoni facilita principalmente il rilascio dell ATP sintetizzato dall enzima, cioè la transizione T O

13 Meccanismo rotatorio cambiamenti di legame promossi dalla rotazione relativa fra α 3 β 3 e le altre parti della F 1 F 0 -ATPasi in bianco residui apolari subunità γ libera rotazione di γ in α 3 β 3 fisso (dovuta ad assenza di interazioni polari o di legame a H fra γ e α 3 β 3 nel poro) variazioni in α 3 β 3 correlate alla posizione di γ (movimento ad albero a camme )

14 statore: α 3 β 3, l unità ab 2 (e δ per E.coli) Meccanismo rotatorio rotore: anello di subunità c, subunità γ (e ε per E.coli) modello di F 1 F O -ATPasi da E.coli in E.coli: citoplasma nel mitocondrio: matrice in E.coli: spazio periplasmico nel mitocondrio: spazio intermembrana

15 Meccanismo rotatorio - i protoni si legano probabilmente ad Asp 61 di una subunità c - alterazione conformazione subunità c spinta contro subunità a rotazione - i protoni entrano in un canale idrofilico tra la subunità a e l anello c e si legano ad una subunità c - vengono rilasciati all interno della matrice attraverso un secondo canale, dopo che l anello c ha eseguito quasi un giro completo - F 1 F 0 -ATPasi genera 3 ATP per giro Asp 61 deprotonato in lievito (10 subunità c) 0.3 ATP per ogni H + che passa dall esterno all interno della membrana interna Asp 61 protonato

16 Meccanismo rotatorio evidenza diretta - filamento di actina biotinilato e resa fluorescente - streptavidina che lega fortemente la biotina (4 siti di legame) in E.coli la F 1 F 0 -ATPasi può agire anche in modo inverso Glu 2 Glu Cys 2 Cys esperimento di idrolisi di ATP (5 mm MgATP) con microscopio a fluorescenza - rotazione actina in senso antiorario -lasubunità γ ruota per incrementi di ~120

17 Rapporto P/O relazione stoichiometrica fra sintesi di ATP (P) e quantità di ossigeno ridotto (O), cioè il numero di moli di ATP per atomo di ossigeno ridotto, ovvero per coppia di elettroni trasportata - la catena di trasporto degli elettroni genera il gradiente protonico ai capi della membrana mitocondriale interna - lo scarico del gradiente protonico è accoppiato con la sintesi di ATP è possibile esprimere la quantità di ATP sintetizzato in termini di molecole di substrato ossidate esperimenti su mitocondri isolati: ossidazione di una molecola di NADH sintesi di ~ 3 ATP ossidazione di una molecola di FADH 2 sintesi di ~ 2 ATP ossidazione di una molecola di TMPD sintesi di ~ 1 ATP TMPD (tetrametil-p-fenilenediamina): dona 2e - dire direttamente al Complesso IV forma ossidata

18 Rapporto P/O e teoria chemiosmotica i rapporti P/O determinati sperimentalmente sono compatibili con la teoria chemiosmotica - il flusso di 2 elettroni attraverso i Complessi I, III, e IV risulta nella translocazione di 10 H + nello spazio intermembrana - l influsso di 10 H + attraverso la F 1 F 0 -ATPasi (10 subunità c negli eucarioti) porta ad una completa rotazione del rotore formato dall anello c e dalla subunità γ rispetto allo sferoide α 3 β 3 sintesi di ~ 3 ATP

19 Rapporto P/O e teoria chemiosmotica - il flusso di 2 elettroni attraverso il Complesso II (bypass del Complesso I) risulta nella translocazione di 6 H + nello spazio intermembrana rotazione di 2/3 del rotore di F 1 F 0 -ATPasi sintesi di ~ 2 ATP - il flusso di 2 elettroni attraverso il Complesso IV risulta nella translocazione di 2 H + nello spazio intermembrana rotazione di 1/3 del rotore di F 1 F 0 -ATPasi sintesi di ~ 1 ATP

20 Rapporto P/O e teoria chemiosmotica - il gradiente protonico può essere parzialmente dissipato dal (1) ritorno non specifico di H + nella matrice (2) consumo di H + per altri scopi es: trasporto di P i nella matrice dal citosol attraverso simporto P i -H + 4 protoni consumati per la sintesi di un ATP rapporti P/O ~2.5, ~ 1.5, ~ 1

21 Respirazione Bilancio energetico - glicolisi: 1 glucosio viene convertito in 2 molecole di piruvato 2 ATP + 2 NADH (~7 ATP) - complesso piruvato deidrogenasi: 2 molecole di piruvato convertite in 2 acetil-coa 2 NADH (~5 ATP) - per ogni ciclo si generano ~ 10 ATP 2 giri del ciclo dell acido citrico (uno per gruppo acetile) (~20 ATP) 5 ATP 2 ATP 5 ATP 15 ATP 3 ATP 2 ATP In condizioni aerobiche 1 glucosio può potenzialmente promuovere la sintesi di ~32 ATP. Solo 2 ATP in condizioni di anaerobiosi