Histology FISH Accessory Kit Codice K5799

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1 Histology FISH Accessory Kit Codice K a edizione Per l ibridazione in situ con sonde fluorescenti (FISH) su sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Il kit contiene i reagenti sufficienti per 20 test. ( ) P04094IT_02_K / p. 1/29

2 Sommario Finalità d uso... 3 Introduzione... 3 Reagenti... 3 Materiali forniti... 3 Materiale necessario ma non fornito... 4 Precauzioni... 5 Conservazione... 7 Preparazione dei campioni... 7 Sezioni incluse in paraffina... 7 ISTRUZIONI PER L USO... 9 A. Preparazione dei reagenti... 9 A.1 Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Wash Buffer... 9 A.4 Serie ascendente di etanolo... 9 A.5 Soluzione pepsina... 9 B. Procedura di colorazione B.1 Note sulla procedura B.2 Trattamento dei campioni prima della colorazione B.3 Protocollo di colorazione B.3.a. B.3.b. Protocollo di colorazione per sonde FISH diluite in un tampone di ibridazione a base di carbonato di etilene Protocollo di colorazione per sonde FISH diluite in tampone di ibridazione a base di formamide Controllo di qualità Interpretazione dei risultati Risoluzione dei problemi Appendice Appendice Bibliografia Spiegazione dei simboli ( ) P04094IT_02_K / p. 2/29

3 ITALIANO Finalità d uso Per uso diagnostico in vitro. Il prodotto Histology FISH Accessory Kit è destinato all uso nella tecnica di ibridazione in situ con sonde fluorescenti (FISH) su campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina. I reagenti forniti in Histology FISH Accessory Kit possono essere utilizzati anche in combinazione con HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (codice K5731, Flacone 3). Se si utilizzano i reagenti di Dako Histology FISH Accessory Kit, codice K5799, con i reagenti del codice K5731, seguire la procedura indicata nel foglietto informativo relativo al codice K5731. Introduzione La confezione Histology FISH Accessory Kit contiene tutti i reagenti necessari, ad eccezione della sonda che serve per portare a termine la procedura FISH sui campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina. Una volta rimossa la paraffina e reidratato il tessuto, i campioni vengono sottoposti a un trattamento termico nella soluzione Pre-Treatment Solution tramite digestione proteolitica usando Pepsin. Al termine del pretrattamento termico e proteolitico, le sonde FISH (che devono essere reperite a parte dall utente) vengono applicate e i campioni vengono sigillati con il prodotto Coverslip Sealant prima di denaturazione e ibridazione. Dopo l ibridazione, viene effettuato un lavaggio stringente per assicurare la completa rimozione delle sonde FISH che non si sono legate o che si sono legate in modo aspecifico, quindi viene eseguita la disidratazione con etanolo. Da ultimo i campioni vengono montati con il mezzo Fluorescence Mounting Medium, il quale contiene una colorazione di contrasto blu fluorescente. I risultati vengono interpretati con un microscopio a fluorescenza dotato degli appositi filtri (vedere l Appendice 1). Reagenti Materiali forniti I materiali elencati di seguito sono sufficienti per 20 test (un test rappresenta un area bersaglio di 22 mm x 22 mm). Questo kit fornisce materiali sufficienti per un massimo di 10 cicli FISH singoli (quattro cicli separati quando si utilizza il metodo di immersione in pepsina). La confezione Histology FISH Accessory Kit spedita al cliente contiene ghiaccio secco. Per verificare che i componenti del kit non siano stati esposti a temperature elevate durante il trasporto, accertarsi che vi sia ancora ghiaccio secco al momento della consegna. Va sottolineato che alcuni componenti presenti nella confezione Histology FISH Accessory Kit possono rimanere scongelati senza per questo compromettere il rendimento dell analisi. Flacone 1 Flacone 2A Flacone 2B Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, concentrato 20x Tampone MES (acido 2-[N-morfolino]etansolfonico). Pepsin 4 x 6,0 ml, pronto all uso Soluzione di pepsina, a ph 2,0, contenente uno stabilizzante ed un agente antimicrobico. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, concentrato 10x Tampone di diluizione, a ph 2,0, contenente un agente antimicrobico. ( ) P04094IT_02_K / p. 3/29

4 Flacone 4 Flacone 5 Flacone 6 Articolo 7 Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, concentrato 20x Tampone SSC (soluzione salina di sodio citrato) con detergente Tween-20. Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Mezzo di montaggio fluorescente pronto all uso, con 500 µg/l DAPI (4,6-diamidina-2-fenilindolo). Wash Buffer (20x) 500 ml, concentrato 20x Tampone Tris/HCl. Coverslip Sealant 1 tubetto Soluzione pronta all uso per apporre un sigillo rimovibile al vetrino coprioggetto. NOTA: tutti i reagenti sono sostituibili con i corrispondenti reagenti di Dako HER2 IQFISH pharmdx (codice K5731). Se si utilizzano i reagenti di Dako Histology FISH Accessory Kit, codice K5799, con i reagenti del codice K5731, seguire la procedura indicata nel foglietto informativo relativo al codice K5731. Materiale necessario ma non fornito Reagenti da laboratorio Acqua distillata o deionizzata Etanolo, 96% Xilene o derivati dello xilene Apparecchiatura da laboratorio Garze assorbenti Pipette regolabili Termometro calibrato ad immersione parziale (intervallo di misura C) Coprioggetto (18 mm x 18 mm o 22 mm x 22 mm e 24 mm x 50 mm o 24 mm x 60 mm) Pinzette Cappa aspirante Dako Hybridizer (codice S2450/S2451)* Piastra di riscaldamento o forno di ibridazione* Camera umida di ibridazione* Microcentrifuga Vetrini, Dako Silanized Slides codice n. S 3003, oppure polilisinati, o vetrini Plus superfrost Vaschette o bagni per la colorazione Supporti in metallo o plastica Contaminuti (per intervalli di 0-60 minuti) Bagnomaria con coperchio (in grado di mantenere una temperatura di 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C e temperature comprese tra 95 C e 99 C Forno a microonde con funzione di rilevazione, se il pretrattamento viene eseguito utilizzando un forno a microonde** (vedere Fase 1 nella sezione B.3.a oppure B.3.b. Protocollo di colorazione, Metodo B). Contenitore per microonde, il coperchio deve contenere fori di un diametro di ad es. un cm ( ) P04094IT_02_K / p. 4/29

5 * Blocco riscaldante per la digestione (37 (±2) C), blocco riscaldante o forno per ibridazione per la denaturazione (66 (±2) C (B.3.a.) o 82 (±2) C) (B.3.b.) e, per l'ibridazione, è possibile utilizzare una camera umida per ibridazione (45 (±2) C), tuttavia, Dako Hybridizer, codice S2450/S2451, è lo strumento consigliato. ** Bagnomaria con coperchio (in grado di mantenere una temperatura di C) o camera a pressione controllata da microprocessore come Dako Pascal, codice S2800, al posto del forno a microonde. Apparecchiatura per microscopia e accessori Filtri per microscopio a fluorescenza: filtro DAPI e filtri adatti al fluorocromo utilizzato, ad esempio filtro doppio FITC/Texas Red o filtri singoli FITC e Texas Red per sonde Dako FISH (vedere l'appendice 1 per ulteriori informazioni). Con le sonde Dako FISH si consiglia l uso di un microscopio a fluorescenza con lampada al mercurio da 100 watt come fonte luminosa. Altre fonti luminose non sono raccomandate con questi filtri Raccoglitore per vetrini (contenitore di cartone per 20 vetrini, con chiusura a cerniera o simile) Precauzioni 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Per operatori specializzati. 3. Il flacone 1, Soluzione di pretrattamento (x 20), non richiede etichettatura di pericolo. Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti. 4. Il flacone 2A, Pepsin, contiene 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsina A e <0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one e 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Il flacone 2A è etichettata: Pericolo H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Può provocare una reazione allergica cutanea. Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Indossare indumenti protettivi. IN CASO DI INALAZIONE: Trasportare l infortunato all aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. IN CASO DI INGESTIONE: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. NON provocare il vomito. IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Sciacquare la pelle/fare una doccia. Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. Conservare sotto chiave. Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 5. Il flacone 2B, Pepsin Diluent (10x), contiene 50-<75% propan-2-ol e 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Il flacone 2B è etichettata: Pericolo ( ) P04094IT_02_K / p. 5/29

6 H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Liquido e vapori facilmente infiammabili. Provoca grave irritazione oculare. Può provocare sonnolenza o vertigini. Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. Tenere lontano da fonti di calore, superfici calde, scintille, fiamme libere o altre fonti di accensione. Non fumare. Utilizzare impianti elettrici, di ventilazione, d illuminazione e per la movimentazione dei materiali a prova di esplosione. IN CASO DI INALAZIONE: trasportare l infortunato all aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Sciacquare la pelle/fare una doccia. Conservare in luogo fresco. Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 6. Il flacone 4, Stringent Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% sodium chloride, e 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Il flacone è etichettata: Attenzione H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Provoca grave irritazione oculare. Provoca irritazione cutanea. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Lavarsi accuratamente le mani dopo l uso. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. 7. Il flacone 6, Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% sodium chloride e 10-<20% trometamolo. Il flacone 6 è etichettata: Attenzione H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Provoca grave irritazione oculare. Provoca irritazione cutanea. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Lavarsi accuratamente le mani dopo l uso. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. 8. Elemento 7, Coverslip Sealant, contiene il 100% di nafta (petrolio), frazione leggera di hydrotreating e è etichettata: Pericolo H225 H304 H411 P280 P210 Liquido e vapori facilmente infiammabili. Può essere letale in caso di ingestione e di penetrazione nelle vie respiratorie. Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. Tenere lontano da fonti di calore, superfici calde, scintille, fiamme libere o altre fonti di accensione. Non fumare. ( ) P04094IT_02_K / p. 6/29

7 P241 Utilizzare impianti elettrici, di ventilazione, d illuminazione e per la movimentazione dei materiali a prova di esplosione. P273 Non disperdere nell ambiente. P301 + P310 + P331 IN CASO DI INGESTIONE: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. NON provocare il vomito. P303 + P361 + P353 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. P235 Conservare in luogo fresco. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 9. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla scheda di sicurezza dei materiali (Safety Data Sheet, SDS) corrispondente. 10. L impiego di metodi di fissazione e campioni con spessori diversi rispetto a quelli specificati potrebbe avere ripercussioni negative sulla morfologia del tessuto e/o sull intensità del segnale. 11. Tempi, temperature e modalità di incubazione diversi da quelli specificati possono generare risultati scadenti. 12. I reagenti sono stati diluiti in modo ottimale. L ulteriore diluizione potrebbe comprometterne il rendimento. 13. Per il metodo di immersione in pepsina (Fase 2. Metodo C), devono essere utilizzate solo vaschette per la colorazione pulite. Conservazione Conservare al buio a 2 8 C. In alternativa, tutti i reagenti tollerano la conservazione alla temperatura di congelamento. Il flacone 2A (Pepsin) potrebbe essere danneggiato se esposto al calore. Non lasciare questo componente a temperatura ambiente. Il flacone 5 (Fluorescence Mounting Medium) potrebbe essere danneggiato dall esposizione a livelli di luce eccessivi. Non conservare questo componente alla luce. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza impressa all esterno della confezione. Se i reagenti sono conservati in condizioni difformi da quelle specificate, tali condizioni dovranno essere approvate dall utente (1). Non è possibile indicare segni evidenti di instabilità del prodotto. Pertanto, è importante utilizzare come controllo del ciclo di analisi un campione di tessuto normale che in precedenza abbia risposto bene alla tecnica FISH. Qualora si ottenga un pattern di fluorescenza imprevisto, che non sia spiegabile con variazioni nelle procedure di laboratorio, e si sospetti che il problema dipenda dal prodotto Histology FISH Accessory Kit, contattare l Assistenza Tecnica Dako. Preparazione dei campioni I campioni ottenuti con biopsie, escissioni o resezioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per l analisi FISH. Seguire il metodo consigliato per l allestimento del tessuto ai fini della colorazione immunocitochimica. Per ulteriori informazioni, consultare il riferimento (2). L uso di tessuto esposto a decalcificazione acida per FISH non è raccomandato (3-6). EDTA come decalcificante sembra conservare meglio il DNA (6) per le tecniche (F)ISH (3, 4, 7). NOTA: le prestazioni di Dako Histology FISH Accessory Kit non sono state convalidate su tessuto decalcificato. Sezioni incluse in paraffina Sono idonei per l uso in questo test solamente i tessuti preservati in formalina tamponata neutra e inclusi in paraffina. Per esempio, i campioni devono essere bloccati in uno spessore di 3 o 4 mm e fissati per ore in formalina tamponata neutra. Successivamente, i tessuti devono essere disidratati utilizzando una serie ascendente di etanolo e xilene, quindi devono essere infiltrati con ( ) P04094IT_02_K / p. 7/29

8 paraffina fusa, mantenuta a non più di 60 C. Se le procedure di fissazione e inclusione vengono svolte correttamente e la conservazione avviene in condizioni adeguate (15-25 C), i tessuti si conserveranno per un periodo indefinito fino al sezionamento e al montaggio sui vetrini (2, 8). Non vi sono altri fissativi idonei. Il prolungamento dei tempi di fissazione potrebbe comportare un aumento dei tempi di incubazione necessari nella procedura di digestione con il prodotto Pepsin. I campioni tissutali devono essere tagliati in sezioni di 2-6 µm, raccolti su vetrini da un bagnomaria e infine asciugati all'aria. Lo spessore ottimale delle sezioni di tessuto è 2 3 µm per Dako Split Signal FISH Probes. Sezioni d 4 6 µm possono essere usate per altre applicazioni FISH. La paraffina deve essere fusa a 60 C per minuti. In seguito le sezioni devono essere raffreddate a temperatura ambiente (20 25 C) e conservate a 2 8 C. Si raccomanda di montare le sezioni tissutali su Dako Silanized Slides, codice S3003 oppure su vetrini polilisinati o Superfrost Plus. In generale si consiglia di analizzare i campioni entro 6 mesi dal sezionamento, se conservati a 2 8 C. Se le sezioni di tessuto vengono conservate in condizioni diverse da quelle specificate, tali condizioni devono essere verificate dall'utente. ( ) P04094IT_02_K / p. 8/29

9 ISTRUZIONI PER L USO A. Preparazione dei reagenti Per ragioni di praticità, prima di procedere alla colorazione è opportuno preparare i reagenti elencati di seguito: A.1 Pre-Treatment Solution Eventuali cristalli presenti nel flacone 1 si dissolvono a temperatura ambiente. Assicurarsi che non siano presenti cristalli prima della preparazione dei reagenti. Diluire una quantità sufficiente del flacone 1 (Pre-Treatment Solution 20x) diluendo in un rapporto 1:20 la soluzione concentrata del flacone in acqua distillata o deionizzata. La soluzione diluita non utilizzata può essere conservata a 2-8 C per un mese. Eliminare la soluzione diluita se appare torbida. A.2 Stringent Wash Buffer Preparare il tampone Stringent Wash Buffer per diluizione 1:20 della soluzione concentrata del flacone 4 (Stringent Wash Buffer 20x) in acqua distillata o deionizzata. La soluzione tampone diluita non utilizzata può essere conservata a 2 8 C per un mese. Eliminare la soluzione tampone diluita se appare torbida. A.3 Wash Buffer Preparare il tampone di lavaggio in quantità sufficiente per diluizione 1:20 della soluzione concentrata del flacone 6 (Wash Buffer 20x) in acqua distillata o deionizzata. La soluzione tampone diluita non utilizzata può essere conservata a 2 8 C per un mese. Eliminare la soluzione tampone diluita se appare torbida. A.4 Serie ascendente di etanolo Partendo da una soluzione di etanolo al 96%, preparare 3 vaschette contenenti rispettivamente etanolo al 70%, all 85% e al 96%. Conservare le vaschette coperte a temperatura ambiente oppure a 2 8 C ed utilizzare per trattare un massimo di 2 00 vetrini. Eliminare le soluzioni se appaiono torbide. A.5 Soluzione pepsina Una soluzione di pepsina è necessaria solo quando si utilizza il metodo di immersione in pepsina (Metodo C, B.3.a. e B.3.b, Fase 2). Preparare la soluzione di pepsina come segue: Per un contenitore da 6 vetrini, preparare 60 ml di soluzione di pepsina: Aggiungere 48 ml di acqua distillata o deionizzata a temperatura ambiente (20 25 C) al contenitore. Aggiungere 6 ml di Pepsin Diluent (10x) (Flacone 2B) freddo (2 8 C) al contenitore. Aggiungere 6 ml di Pepsin (Flacone 2A) fredda (2 8 C) al contenitore. Posizionare il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) C in un bagnomaria. Per un contenitore da 24 vetrini, preparare 240 ml di soluzione di pepsina: Aggiungere 192 ml di acqua distillata o deionizzata a temperatura ambiente (20 25 C) al contenitore. Aggiungere 24 ml di Pepsin Diluent (10x) (Flacone 2B) freddo (2 8 C) al contenitore. Aggiungere 24 ml di Pepsin (Flacone 2A) fredda (2 8 C) al contenitore. ( ) P04094IT_02_K / p. 9/29

10 Posizionare il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) C in un bagnomaria. La soluzione di pepsina equilibrata deve essere utilizzata entro 5 ore. ( ) P04094IT_02_K / p. 10/29

11 B. Procedura di colorazione B.1 Note sulla procedura Prima dell uso, l utente deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e conoscere bene tutti i componenti (vedi la sezione Precauzioni ). Se i componenti del kit sono conservati nel congelatore, si consiglia di trasferire i reagenti a una temperatura di 2 8 C il giorno precedente l analisi, di modo che possano raggiungere una temperatura equilibrata. Prima dell uso, equilibrare tutti i reagenti alla temperatura indicata. Flacone 1: la soluzione Pre-Treatment Solution diluita deve essere equilibrata a C se si utilizza un bagnomaria (sezione B.3.a o B.3.b. Protocollo di colorazione, Fase 1: Pretrattamento, Metodo A). Se per il pretrattamento si utilizza un forno a microonde con funzione di rilevazione (sezione B.3.a o B.3.b. Protocollo di colorazione, Fase 1: Pretrattamento, Metodo B) la soluzione Pre-Treatment Solution diluita deve essere equilibrata a una temperatura ambiente di C. Flacone 2A: il reagente Pepsin deve essere applicato a 2-8 C (sezione B.3.a. o B.3.b. Protocollo di colorazione, Fase 2: Metodo A e B) e tenuto continuamente freddo. Flacone 2B: il diluente per pepsina (10x) deve essere applicato a 2-8 C (sezione B.3.a. o B.3.b. Protocollo di colorazione, Fase 2: Metodo C) Flacone 4: prima dell'uso, equilibrare una vaschetta con il tampone Stringent Wash Buffer diluito a temperatura ambiente e un'altra vaschetta a 63 (±2) C (Sezione B.3.a.) o a 65 (±2) C (Sezione B.3.b). Flacone 5: Fluorescence Mounting Medium può essere applicato a qualsiasi temperatura nell'intervallo 2-25 C. Flacone 6: il tampone Wash Buffer diluito deve essere equilibrato a temperatura ambiente (20-25 C). Articolo 7: il collante Coverslip Sealant può essere applicato a temperatura ambiente (20-25 C). Tutte le fasi della procedura devono svolgersi alla temperatura indicata. La procedura di precolorazione prevede fasi di disidratazione seguite da essiccazione dei campioni. Accertarsi che i campioni siano completamente asciutti prima di passare all operazione successiva. Evitare che i campioni si secchino nelle altre fasi della procedura. Se la procedura di colorazione deve essere interrotta, i vetrini possono essere conservati in tampone Wash Buffer dopo la rimozione della paraffina per un periodo massimo di 1 ora, a temperatura ambiente (20 25 C). B.2 Trattamento dei campioni prima della colorazione Deparaffinazione e reidratazione: prima di eseguire la colorazione, i tessuti devono essere sottoposti alla procedura di deparaffinazione per la rimozione della paraffina e successivamente reidratati. Evitare la rimozione incompleta della paraffina. La presenza di eventuali residui di paraffina può provocare un aumento della colorazione aspecifica. Questa operazione deve essere eseguita a temperatura ambiente (20 25 C). 1. Immergere i vetrini in un bagno di xilene e incubare per 5 (±1) minuti. Sostituire il bagno e ripetere una volta. 2. Eliminare l eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in etanolo al 96% per 2 (±1) minuti. Sostituire il bagno e ripetere una volta. 3. Eliminare l eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in etanolo al 70% per 2 (±1) minuti. Sostituire il bagno e ripetere una volta. ( ) P04094IT_02_K / p. 11/29

12 4. Eliminare l eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in Wash Buffer diluito (vedere le ISTRUZIONI PER L USO, Sezione A.2) per almeno 2 minuti. Iniziare la procedura di colorazione come descritto nella sezione B.3.a o B.3.b., fase 1, Pretrattamento. Dopo 200 vetrini, si consiglia di preparare soluzioni fresche di xilene e alcol. Si possono utilizzare derivati dello xilene. NOTA: le istruzioni e i reagenti forniti in questo kit sono stati studiati per assicurare prestazioni ottimali. L ulteriore diluizione dei reagenti o una variazione delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei o discordanti. Differenze nella processazione del tessuto e nei procedimenti tecnici in uso presso il laboratorio dell utente possono invalidare i risultati del saggio. Invecchiamento facoltativo dei campioni: prima di eseguire le procedure di deparaffinazione e reidratazione, incubare i vetrini a 60 C per un periodo di ad esempio 1 ora su un blocco riscaldante, su un blocco all'interno di un forno per ibridazione o su Dako Hybridizer. In alternativa, incubare i vetrini a 37 C per 1-2 giorni, quindi 1 ora a 60 C. Continuare con deparaffinazione e reidratazione. NOTA: questo passaggio è facoltativo. Campioni maturati potrebbero ridurre il rumore di fondo potenziale. B.3 Protocollo di colorazione Attenersi a una delle varianti del protocollo di colorazione, B.3.a o B3.b. Non intercambiare i passaggi tra le due procedure: Per il protocollo di colorazione B.3.a è descritta la procedura della durata di mezza giornata da applicare a sonde FISH diluite in un tampone di ibridazione a base di carbonato di etilene. Per il protocollo di colorazione B.3.b è descritta la procedura in due giornate da applicare a sonde FISH diluite in un tampone di ibridazione a base di formamide. B.3.a. Protocollo di colorazione per sonde FISH diluite in un tampone di ibridazione a base di carbonato di etilene Fase 1: Pretrattamento (forno a microonde, bagnomaria, Pascal) Il pretrattamento può essere effettuato sia usando un bagnomaria come descritto nel metodo A) che un forno a microonde con funzione di rilevazione come descritto nel metodo B, o attraverso l uso di una pentola a pressione Pascal come descritto nel metodo C). Metodo A: Pretrattamento con bagnomaria Riempire le vaschette per la colorazione, p.es. vaschette Coplin, con la soluzione Pre-Treatment Solution diluita (vedi ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.1). Porre le vaschette contenenti la soluzione Pre-Treatment Solution diluita in bagnomaria. Portare la temperatura del bagnomaria e della soluzione Pre-Treatment Solution a C. Con un termometro calibrato, verificare che la temperatura all'interno della vaschetta sia corretta. Richiudere le vaschette con i coperchi in modo da stabilizzare la temperatura e prevenire l'evaporazione. Immergere le sezioni deparaffinate a temperatura ambiente nelle vaschette contenenti la soluzione Pre-Treatment Solution precedentemente riscaldata. Ricontrollare la temperatura e incubare per 10 (±1) minuti a C. Rimuovere tutta la vaschetta con i vetrini dal bagnomaria. Rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare i vetrini nella Pre-Treatment Solution per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta contenente il tampone Wash Buffer diluito (vedere le ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto destinato a una singola applicazione. Non riutilizzare. ( ) P04094IT_02_K / p. 12/29

13 Metodo B: Pretrattamento con forno a microonde dotato di funzione di rilevazione (consigliato) Riempire una vaschetta di plastica con la soluzione Pre-Treatment Solution diluita a temperatura ambiente (20-25 C). Immergere le sezioni deparaffinate in Pre-Treatment Solution, coprire la vaschetta con un coperchio forato e collocarla nel forno a microonde. Selezionare la funzione del sensore di ebollizione e programmarlo in modo che rimanga in funzione per 10 minuti dopo il raggiungimento della temperatura di ebollizione*. Dopo 10 minuti di incubazione, rimuovere la vaschetta con i vetrini del forno, rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta con Wash Buffer diluito e lasciarli immersi per 3 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. * Per forno a microonde con funzione di rilevazione si intende un forno munito di un sensore e di programmi che consentano di portare inizialmente la soluzione Pre-Treatment Solution al punto di ebollizione e successivamente di mantenere la temperatura di pretrattamento richiesta (superiore a 95 ºC) durante il conto alla rovescia del tempo impostato (10 (±1) minuti). Alcuni modelli di forni a microonde con funzione di rilevazione non prevedono la possibilità di impostare un intervallo di tempo per il conto alla rovescia. Se il modello dispone solo di programmi pre-impostati, fare attenzione a selezionare un programma che mantenga la temperatura di pretrattamento richiesta (superiore a 95 ºC) per almeno 10 (±1) minuti e arrestare manualmente il programma dopo 10 (±1) minuti. NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto destinato a una singola applicazione. Non riutilizzare. Metodo C: Pretrattamento con camera a pressione Pascal Riempire la vasca all'interno della camera a pressione Pascal con 500 ml di acqua deionizzata. Riempire una vaschetta di plastica con 250 ml di Pre-Treatment Solution. Immergere le sezioni deparaffinate nella Pre-Treatment Solution e posizionare la vaschetta nella vasca della camera a pressione Pascal. Incubare per 1 minuto a 121 C. I n seguito al raffreddamento a 90 C, consentire il rilascio delle pressione. Per informazioni sul corretto utilizzo della camera a pressione Pascal, leggere attentamente il Manuale Pascal. Rimuovere il contenitore dopo la fuoriuscita della pressione. Rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione Pre-Treatment Solution per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta contenente tampone Wash Buffer diluito (vedere ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.2). Immergere le sezioni per 3 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare con il passaggio 2. NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto destinato a un singolo utilizzo. Non riutilizzare. Non utilizzare un contenitore chiuso ermeticamente per il pretrattamento in forno a microonde poiché l'aumento della pressione all'interno del contenitore potrebbe causare lesioni al momento dell'apertura o esplosioni. Nel forno a microonde, è possibile utilizzare un supporto per vetrini di metallo se tale supporto è immerso nella soluzione di pretrattamento durante l'intera durata del trattamento con il forno. Non utilizzare metallo in altro modo in un forno a microonde. Attenersi alle istruzioni del produttore del forno a microonde. Evitare la continua ebollizione della soluzione Pre-Treatment Solution durante i 10 minuti di incubazione. Controllare regolarmente la temperatura con un termometro calibrato per verificare che le condizioni di temperatura siano appropriate. Fase 2: Pepsin, pronto all'uso (RTU) o soluzione di pepsina L'incubazione con Pepsin può essere eseguita tramite applicazione diretta di gocce di Pepsin RTU sui vetrini a temperatura ambiente (20 25 C) (Metodo A) o a 37 C (Metodo B). In alternativa, i vetrini possono essere immersi in una soluzione di pepsina e incubati a 37 (±2) C (Metodo C). Metodo A e metodo B: Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Usando carta bibula (per esempio una salviettina assorbente oppure carta di tessuto assorbente), asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere ogni eccesso di liquido e mantenere i reagenti all'interno dell'area prescritta. Applicare 5-8 gocce (250 µl) di Pepsin (flacone 2A) fredda (2-8 C) in modo tale da coprire il campione. Conservare il reagente Pepsin sempre a 2-8 C. ( ) P04094IT_02_K / p. 13/29

14 Metodo A: Pepsin, RTU Incubazione a C Incubare per 5-15 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 5-15 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall utente. Eliminare picchiettando la pepsina ed immergere le sezioni in tampone Wash Buffer diluito (vedi ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione. Metodo B: Pepsin, RTU - Incubazione a 37 C Collocare i campioni con Pepsin su un blocco riscaldante a 37 C, ad esempio Dako Hybridizer, e incubare per 3-5 minuti. Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 3-5 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall utente. Picchiettare per rimuovere la pepsina in eccesso e immergere le sezioni nel tampone Wash Buffer diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione. Disidratare le sezioni tissutali in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all'85% e 2 minuti in etanolo al 96%. Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente all aria. Metodo C: Soluzione di pepsina - Immersione dei vetrini in soluzione di pepsina a 37 C Il kit contiene reagenti sufficienti per quattro cicli separati (60 ml di soluzione di pepsina, contenitore piccolo per sei vetrini) oppure per un ciclo singolo (240 ml di soluzione di pepsina, contenitore grande per 24 vetrini). Preparare la soluzione di pepsina come descritto nella sezione A.5. Posizionare il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) C in un bagnomaria. Assicurarsi che la temperatura si sia stabilizzata. Con un termometro calibrato, verificare che la temperatura all'interno del contenitore sia corretta. Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Immergere i vetrini nella soluzione di pepsina a 37 (±2) C e incubare per minuti. Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall utente. Picchiettare per rimuovere la soluzione di pepsina in eccesso e immergere le sezioni nel tampone Wash Buffer diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione. Disidratare le sezioni tissutali in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all'85% e 2 minuti in etanolo al 96%. Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente all aria. Fase 3: Sonda FISH diluita in tampone di ibridazione a base di carbonato di etilene (fornito dall'utente) NOTA: le miscele di sonde FISH diluite in tampone di ibridazione a base di carbonato di etilene devono essere conservate a -18 C tra un utilizzo e l'altro. La conservazione a -18 C comporta la separazione del tampone in due fasi. Prima dell'utilizzo, assicurarsi che sia presente un'unica fase equilibrando la miscela di sonde a temperatura ambiente (20-25 C) e, successivamente, miscelando. Scongelare la miscela di sonde FISH a temperatura ambiente (20-25 C) per un massimo di 30 minuti (proteggere dalla luce intensa), quindi scuotere il flacone vigorosamente per 15 secondi a 2500 rpm con un miscelatore vortex. Applicare una quantità appropriata di miscela di sonde, ad esempio 10 µl, al centro della sezione tissutale. Ricoprire immediatamente la miscela di sonde con un vetrino coprioggetto 22 mm x 22 mm e lasciare che il reagente diffonda in modo omogeneo al di sotto del vetrino coprioggetto. ( ) P04094IT_02_K / p. 14/29

15 Evitare l intrappolamento di bolle d aria. Eliminare eventuali bolle d'aria presenti picchiettando delicatamente con le pinzette per allontanarle dal tessuto. Sigillare il vetrino coprioggetto distribuendo il collante Coverslip Sealant attorno al bordo. Lasciare che il collante si sovrapponga al coprioggetto e al vetrino formando così una chiusura ermetica. Assicurarsi che il collante Coverslip Sealant ricopra l'intero bordo del vetrino coprioggetto. Preparare Dako Hybridizer* (codice S2450 o S2451) per la fase di ibridizzazione. Verificare che gli Humidity Control Strips (codice S2452) siano saturati e ottimali per l'uso. Avviare Hybridizer e selezionare un programma che consenta di eseguire le operazioni seguenti: Denaturazione a 66 C per 10 minuti seguita da ibridazione a 45 C per minuti. Collocare i vetrini nell'hybridizer, verificare che il coperchio sia perfettamente chiuso e avviare il programma. Per ulteriori informazioni, fare riferimento al documento al manuale di istruzioni di Dako Hybridizer. * Per la denaturazione e l'ibridazione è possibile anche usare altra strumentazione che consenta di ottenere condizioni simili a quelle descritte in precedenza: Collocare i vetrini su una superficie piana di pietra o metallo (su un blocco riscaldante o su un blocco all'interno di un forno per ibridazione) preriscaldata a 66 (±1) C. Denaturare per 10 minuti esatti. Collocare i vetrini all'interno di una camera di ibridazione umidificata precedentemente riscaldata. Coprire la camera con un coperchio e incubare a 45 (±2) C per minuti. Fase 4: Lavaggio stringente Riempire due vaschette per la colorazione, p. es. vaschette Coplin, con Stringent Wash Buffer diluito (vedi ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.2). Si raccomanda di utilizzare un volume minimo di 100 ml oppure 15 ml per vetrino in ciascuna vaschetta. Collocare una vaschetta contenente il tampone Stringent Wash Buffer di stringenza diluito a temperatura ambiente in una cappa aspirante e l altra in un bagnomaria. Portare la temperatura del bagnomaria e del tampone Stringent Wash Buffer diluito a 63 (±2) C. Assicurarsi che la temperatura si sia stabilizzata. Coprire le vaschette con il rispettivo coperchio per stabilizzare la temperatura ed evitare l evaporazione. Con un termometro calibrato, verificare che la temperatura all'interno della vaschetta nel bagnomaria sia corretta. Il tampone Stringent Wash Buffer contiene un detergente e può diventare torbido a 63 C. Tutt avia, questo fenomeno non altera la prestazione del reagente. Usando pinzette o guanti, estrarre i vetrini dalla camera di ibridazione, rimuovere delicatamente il collante Coverslip Sealant e il vetrino coprioggetto e collocare i vetrini uno alla volta nella vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso tutti i vetrini coprioggetto, trasferire i vetrini dalla vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente alla vaschetta a 63 (±2) C nel bagnomaria. Avviare il timer immediatamente dopo il trasferimento dei vetrini nel tampone Stringent Wash Buffer diluito nel bagnomaria a 63 (±2) C. Eseguire un lavaggio stringente per 10 minuti esatti. Estrarre i vetrini dal tampone Stringent Wash Buffer diluito ed immergere le sezioni in Wash Buffer diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti. Disidratare le sezioni tissutali in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all'85% e 2 minuti in etanolo al 96%. Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente. Fase 5: Montaggio Applicare 15 µl di Fluorescence Mounting Medium contenente DAPI (flacone 5) sull'area bersaglio del vetrino e coprire con un vetrino coprioggetto di vetro. ( ) P04094IT_02_K / p. 15/29

16 NOTA: è possibile eseguire una lettura dei vetrini dopo 15 minuti o entro 7 giorni dal montaggio. Tuttavia, i preparati potrebbero sbiadire se i vetrini sono esposti a luce o temperature eccessive. Per ridurre al minimo tale rischio, conservare i vetrini al buio a C. B.3.b. Protocollo di colorazione per sonde FISH diluite in tampone di ibridazione a base di formamide GIORNO 1 Fase 1: Pretrattamento (forno a microonde, bagnomaria, Pascal) Il pretrattamento può essere effettuato utilizzando un bagnomaria come descritto nel metodo A), un forno a microonde con funzione di rilevazione come descritto nel metodo B) o una camera a pressione Pascal come descritto nel metodo C). Metodo A: Pretrattamento con bagnomaria Riempire le vaschette per la colorazione con la soluzione Pre-Treatment Solution diluita (vedere le ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.1). Porre le vaschette contenenti la soluzione Pre-Treatment Solution diluita in bagnomaria. Portare la temperatura del bagnomaria e della soluzione Pre- Treatment Solution a C. Con un termometro calibrato, verificare che la temperatura all'interno della vaschetta sia corretta. Richiudere le vaschette con i coperchi (senza fori) in modo da stabilizzare la temperatura e prevenire l evaporazione. Immergere le sezioni sparaffinate nella soluzione Pre-Treatment Solution preriscaldata. Controllare nuovamente la temperatura, chiudere il coperchio del bagnomaria e incubare per 10 (±1) minuti a C. Rimuovere tutta la vaschetta con i vetrini dal bagnomaria. Rimuovere il coperchio (non rimuovere i vetrini). Lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione Pre-Treatment Solution per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta contenente tampone Wash Buffer diluito (vedere ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.2) lasciandoli per 3 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare con il passaggio 2. Metodo B: Pretrattamento con forno a microonde dotato di funzione di rilevazione (consigliato) Riempire un contenitore con la soluzione Pre-Treatment Solution diluita a temperatura ambiente (20 25 C). Immergere le sezioni sparaffinate nella soluzione e chiudere il coperchio. Il coperchio deve contenere dei fori per consentire la fuoriuscita della pressione. Collocare il contenitore con i vetrini nel forno a microonde e riscaldare. Prima del riscaldamento, assicurarsi che la parte esterna del contenitore e l interno del forno siano puliti. Incubare ad una temperatura leggermente inferiore al punto di ebollizione (non inferiore a 95 C) per 10 minuti. Dopo l incubazione, rimuovere il coperchio (non rimuovere i vetrini). Lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione Pre-Treatment Solution per 15 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). I vetrini devono essere coperchi con tampone durante tutta la procedura di pretrattamento. Trasferire i vetrini in una vaschetta contenente tampone Wash Buffer diluito (vedere ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.2) lasciandoli per 3 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare con il passaggio 2. Metodo C: Pretrattamento con camera a pressione Pascal Riempire la vasca all'interno della camera a pressione Pascal con 500 ml di acqua deionizzata. Riempire una vaschetta di plastica con 250 ml di Pre-Treatment Solution. Immergere le sezioni deparaffinate nella Pre-Treatment Solution e posizionare la vaschetta nella vasca della camera a pressione Pascal. Incubare per 1 minuto a 121 C. I n seguito al raffreddamento a 90 C, consentire il rilascio delle pressione. Per informazioni sul corretto utilizzo della camera a pressione Pascal, leggere attentamente il Manuale Pascal. Rimuovere il contenitore dopo la fuoriuscita della pressione. Rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione Pre-Treatment ( ) P04094IT_02_K / p. 16/29

17 Solution per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta contenente tampone Wash Buffer diluito (vedere ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.2). Immergere le sezioni per 3 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare con il passaggio 2. NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto destinato a un singolo utilizzo. Non riutilizzare. Non utilizzare un contenitore chiuso ermeticamente per il pretrattamento in forno a microonde poiché l'aumento della pressione all'interno del contenitore potrebbe causare lesioni al momento dell'apertura o esplosioni. Nel forno a microonde, è possibile utilizzare un supporto per vetrini di metallo se tale supporto è immerso nella soluzione di pretrattamento durante l'intera durata del trattamento con il forno. Non utilizzare metallo in altro modo in un forno a microonde. Attenersi alle istruzioni del produttore del forno a microonde. Evitare la continua ebollizione della soluzione Pre-Treatment Solution durante i 10 minuti di incubazione. Controllare regolarmente la temperatura con un termometro calibrato per verificare che le condizioni di temperatura siano appropriate. Fase 2: Pepsin, pronto all'uso (RTU) o soluzione di pepsina L'incubazione in pepsina può essere eseguita tramite applicazione diretta di gocce di Pepsin RTU sui vetrini a temperatura ambiente (20 25 C) (Metodo A) o a 37 C (Metodo B). In alternativa, è possibile immergere i vetrini in una soluzione di pepsina e incubarli a 37 (±2) C (Metodo C) Metodo A e Metodo B: Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Utilizzando carta bibula (ad esempio una carta di tessuto assorbente o una garza), asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere il liquido in eccesso e mantenere i reagenti all interno dell area prescritta. Applicare 5-8 gocce (250 µl) di reagente Pepsin (flacone 2A) freddo (2-8 C) verificando che il campione sia coperto. Conservare il reagente Pepsin sempre a 2-8 C. Metodo A: Pepsin, RTU Incubazione a C Incubare per 5-50 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). Per la maggior parte dei campioni dovrebbe essere sufficiente un incubazione di minuti a temperatura ambiente, tuttavia spetta all utente determinare il tempo di incubazione ottimale. Eliminare picchiettando la pepsina ed immergere le sezioni in tampone Wash Buffer diluito (vedi ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti. Andare alla fase 3: Sonda FISH. In alternativa, consultare l Appendice 2 per l ottimizzazione del tempo di digestione (facoltativa). Metodo B: Pepsin, RTU Incubazione a 37 C Collocare i campioni con Pepsin a 37 C sul Dako Hybridizer o su una piastra di riscaldamento preriscaldata. Per la maggior parte dei campioni sarà sufficiente un tempo di incubazione di 2-6 minuti a 37 C, purché siano state rispettate le istruzioni riportate nella sezione Preparazione dei campioni. Il tempo di incubazione ottimale, che dovrebbe essere determinato personalmente dall utente, dipende dal tipo di tessuto, dalla fissazione del tessuto, dallo spessore e dalla maturazione del campione. Questi fattori possono aumentare il tempo di digestione richiesto a 7-15 min o più. Chi esegue questa operazione per la prima volta deve individuare il tempo di digestione ottimale testando un tessuto campione per 1, 3, 6, 12 e 18 minuti. Eliminare la pepsina picchiettando ed immergere le sezioni in tampone Wash Buffer diluito (vedere le ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti. Andare alla fase 3: Sonda FISH. In alternativa, consultare l Appendice 2 per l ottimizzazione del tempo di digestione (facoltativa). ( ) P04094IT_02_K / p. 17/29

18 Metodo C: Soluzione di pepsina - Immersione dei vetrini in soluzione di pepsina a 37 C Il kit contiene reagenti sufficienti per quattro cicli separati (soluzione pepsina 60 ml, piccolo contenitore per sei vetrini) o un unico ciclo (soluzione pepsina 240 ml, contenitore grande per 24 vetrini). Preparare la soluzione di pepsina come descritto nella sezione A.5. Posizionare il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) C in un bagnomaria. Assicurarsi che la temperatura si sia stabilizzata. Con un termometro calibrato, verificare che la temperatura all'interno del contenitore sia corretta. Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Immergere i vetrini nella soluzione di pepsina a 37 (±2) C e incubare per minuti. Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall utente. Picchiettare per rimuovere la pepsina in eccesso e immergere le sezioni nel tampone Wash Buffer diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Andare alla fase 3: Sonda FISH. In alternativa, consultare l Appendice 2 per l ottimizzazione del tempo di digestione (facoltativa). NOTA: si consiglia di attenersi alla procedura descritta nella sezione Preparazione dei campioni. Un tessuto sotto-digerito potrebbe non restituire segnali o segnali confusi, spesso con un livello elevato di sfondo citosolico verde. Fase 3: Sonda FISH (fornita dall utente) NOTA: se si utilizzano i reagenti di Dako Histology FISH Accessory Kit, codice K5799, con i reagenti del codice K5731, seguire la procedura indicata nel foglietto informativo relativo al codice K5731. La seguente fase deve essere eseguita in una cappa aspirante. Le sonde marcate con fluorocromo possono essere danneggiate dall esposizione a livelli di luce eccessivi. Non eseguire la parte restante di questa procedura sotto la luce diretta del sole o in condizioni di luminosità intensa. Disidratare le sezioni tissutali in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all'85% e 2 minuti in etanolo al 96% (vedere le ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.4). Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente all aria. Applicare una quantità sufficiente di sonda marcata con fluorocromo, ad esempio 10 µl di una sonda Dako FISH, puntando al centro della sezione di tessuto. Montare immediatamente un vetrino coprioggetto di 18 mm x 18 mm (o 22 mm x 22 mm) in vetro sopra alla sonda, lasciando che si espanda in modo uniforme sotto al vetrino coprioggetto. Evitare l intrappolamento di bolle d aria. Se si osserva la formazione di bolle d aria, picchiettarle via delicatamente utilizzando una pinza. Sigillare il vetrino coprioggetto applicando il prodotto Coverslip Sealant attorno al bordo. Lasciare che il collante si sovrapponga al coprioggetto e al vetrino formando così una chiusura ermetica. Assicurarsi che il prodotto Coverslip Sealant sia distribuito uniformemente lungo tutto il bordo del vetrino coprioggetto. In caso di utilizzo delle sonde Dako FISH, posizionare i vetrini in Dako Hybridizer (codice S2450/S2451) e impostare la denaturazione a 82 C per 5 min e l'ibridazione a 45 C per tutta la notte (14 20 h). Continuare con la procedura relativa a Giorno 2, Fase 4, Lavaggio stringente. Per ulteriori informazioni, consultare il manuale dell'hybridizer. NOTA: in alternativa, è possibile utilizzare un blocco riscaldante, un forno per ibridazione e una camera di ibridazione. Vedere di seguito. Collocare il vetrino su una superficie piana di metallo o pietra (blocco riscaldante o forno per ibridazione) preriscaldata a 82 (±2) C. Denaturare per 5 minuti, assicurandosi che la temperatura del blocco non scenda al di sotto degli 80 C. Collocare i vetrini all'interno di una camera di ibridazione umidificata precedentemente riscaldata. Chiudere la camera con un coperchio e incubare per tutta la notte (14 20 ore) a 45 (±2) C, se si utilizzano sonde Dako FISH. ( ) P04094IT_02_K / p. 18/29

19 GIORNO 2 Fase 4: Lavaggio stringente Riempire due vaschette per la colorazione con il tampone Stringent Wash Buffer diluito (vedi ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.2). Per il numero di vetrini contenuti normalmente in una vaschetta (tra 1 e 6), è necessario un volume minimo di 100 ml di tampone stringente diluito. Nel caso in cui il numero di vetrini sia maggiore di 6, serviranno 15 ml di tampone per ogni vetrino. Collocare una vaschetta contenente il tampone Stringent Wash Buffer di stringenza diluito a temperatura ambiente in una cappa aspirante e l altra in un bagnomaria. Portare la temperatura del bagnomaria e del tampone Stringent Wash Buffer a 65 (±2) C. Assicurarsi che la temperatura si sia stabilizzata. Coprire le vaschette con il rispettivo coperchio per stabilizzare la temperatura ed evitare l evaporazione. Misurare la temperatura interna della vaschetta con un termometro calibrato, verificando che sia corretta. Estrarre i vetrini dalla camera di ibridazione. Con una pinza rimuovere delicatamente il prodotto Coverslip Sealant e il vetrino coprioggetto, trasferendo il vetrino nella vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente. Dopo avere rimosso tutti i vetrini coprioggetto, trasferire i vetrini dalla vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente alla vaschetta a 65 (±2) C nel bagnomaria. Chiudere il coperchio della vaschetta e quello del bagnomaria. Eseguire un lavaggio stringente per 10 minuti esatti a 65 (±2) C. Estrarre i vetrini dal tampone Stringent Wash Buffer diluito ed immergere le sezioni in tampone diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti. Disidratare le sezioni tissutali in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all'85% e 2 minuti in etanolo al 96% (vedere le ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.4). Lasciare che i vetrini si asciughino all aria completamente. Fase 5: Montaggio Sull'area bersaglio del vetrino applicare 15 µl di Fluorescence Mounting Medium (Flacone 5), contenente una colorazione di contrasto fluorescente blu, e montare un vetrino coprioggetto (ad es. 24 mm x 50 mm o 24 mm x 60 mm). Lasciar diffondere il mezzo uniformemente sul campione. NOTA: è possibile eseguire una lettura dei vetrini dopo 15 minuti o entro 7 giorni dal montaggio. In caso di esposizione alla luce o a temperature elevate, i vetrini potrebbero scolorirsi. I vetrini devono essere conservati al buio a C. Controllo di qualità 1. I segnali devono essere chiari, netti e facili da valutare. 2. Come controllo del ciclo di analisi è necessario utilizzare un tessuto normale che in precedenza abbia risposto bene alla tecnica FISH. 3. Le cellule di tessuto normale devono mostrare segnali fluorescenti chiaramente visibili, così da indicare che l ibridazione delle sonde FISH alle regioni bersaglio è riuscita perfettamente. 4. Se al contrario le cellule di tessuto normale non mostrano segnali chiari, significa che la procedura non è andata a buon fine e i risultati non possono essere considerati validi. 5. A causa del sezionamento del tessuto, è possibile che alcune cellule normali presentino un numero di segnali inferiore al previsto. ( ) P04094IT_02_K / p. 19/29

20 6. La morfologia nucleare deve risultare intatta e colorata uniformemente all esame con un filtro DAPI. Un numero elevato di cellule fantasma, a ciambella e una morfologia nucleare sostanzialmente scarsa indicano che il campione è stato sottoposto a digestione eccessiva o a denaturazione eccessiva, con conseguente perdita o frammentazione dei segnali. La colorazione periferica, fori nelle cellule (filtro DAPI) e/o una forte colorazione di fondo citosolica verde se osservati con un doppio filtro rosso/fitc Texas possono indicare sottodigestione, con conseguente perdita di segnale. Questi campioni devono essere considerati non validi. 7. Le differenze che esistono tra i laboratori per quanto riguarda lo svolgimento di procedure quali la fissazione, l allestimento e l inclusione del tessuto, ad esempio, possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli interni periodici. Interpretazione dei risultati Esaminare le cellule in diverse aree tenendo conto di una possibile eterogeneità. Selezionare un area caratterizzata da una buona distribuzione nucleare. Iniziare l esame a partire dal quadrante in alto a sinistra dell area prescelta e, procedendo da sinistra verso destra, contare il numero di segnali all interno del perimetro nucleare di ciascun nucleo analizzato, facendo riferimento alle istruzioni che seguono. Variare la profondità del fuoco per rilevare tutti i segnali del nucleo individuale. Non eseguire la valutazione dei nuclei privi di segnali. Non includere i nuclei che richiedono una valutazione soggettiva. Ignorare i nuclei con intensità di segnale debole e con fondo non specifico o elevato. Spetta all utente stabilire il numero di nuclei che dovranno essere contati per ogni sonda. Evitare le aree laddove i bordi nucleari risultano ambigui. Limiti 1. Il tempo di incubazione della digestione con pepsina può dipendere dalla fissazione tissutale e/o dallo spessore del campione e deve essere determinato e verificato dall utente. 2. Per informazioni sull uso previsto della sonda FISH, consultare le informazioni relative al prodotto corrispondente nel foglietto informativo della sonda FISH. 3. FISH è una tecnica multifase che richiede una formazione specifica per quanto riguarda la selezione dei reagenti appropriati, la scelta dei tessuti, la fissazione, la processazione e la preparazione dei vetrini per FISH nonché l'interpretazione dei risultati della colorazione. 4. I risultati della tecnica FISH sono strettamente correlati alle modalità di manipolazione e processazione del tessuto precedenti alla colorazione. L'incorretta esecuzione di fissazione, lavaggi, essiccazione, riscaldamento e taglio oppure la contaminazione con altri tessuti o liquidi può influenzare l'ibridazione della sonda. Risultati incoerenti possono essere dovuti anche a variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto. 5. Per garantire risultati ottimali e riproducibili, i vetrini con tessuto devono essere completamente deparaffinati. La rimozione della paraffina deve essere eseguita all inizio del processo di colorazione (consultare le ISTRUZIONI PER L USO, sezione B.2). 6. Utilizzare solo forno per ibridazione, blocco riscaldante o bagnomaria a temperatura calibrata. L uso di altri tipi di apparecchiatura può causare l evaporazione della miscela di sonde durante l ibridazione e deve essere convalidato dall utente. ( ) P04094IT_02_K / p. 20/29

21 Risoluzione dei problemi Problema Probabile causa Intervento consigliato 1. Nessun segnale o segnali deboli 1a. Tempo di digestione inappropriato. 1b. Il Kit è stato esposto ad elevate temperature durante il trasporto o la conservazione 1c. Le condizioni di pretrattamento erano inadeguate. 1d. Le condizioni di denaturazione erano inadeguate. 1e. La temperatura di ibridazione era inadeguata. 1a. Assicurarsi che vengano utilizzate sezioni tissutali incluse in paraffina, fissate in formalina. Potrebbe essere utile predisporre un periodo di digestione prolungato, ad esempio di 7-15 minuti o più a 37 C. Consultare la sezione B.3.a o B.3.b Fase 2, la sezione Risoluzione dei problemi, punti 4d e 4e e l'appendice 2. 1b. Controllare le condizioni di conservazione. Accertarsi che il ghiaccio secco fosse presente al momento della consegna. Controllare che i flaconi 2A e 5 siano stati conservati a 2 8 C e che il flacone 5 sia rimasto sempre al buio. 1c. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata. Inoltre, verificare che, qualora richiesto, il tempo di incubazione della digestione sia stato ottimizzato (vedere la sezione B.3.a o B.3.b Fase 2). Più è vicina la temperatura di pretrattamento al punto di ebollizione, più sono forti i segnali. Assicurarsi che il prodotto Pepsin venga utilizzato alla temperatura indicata. Vedere la sezione B.1. 1d. Assicurarsi di utilizzare tempo e temperatura di denaturazione consigliati. 1e. Quando si utilizzano le sonde Dako FISH, eseguire l ibridazione a 45 (±2) C. ( ) P04094IT_02_K / p. 21/29

22 2. Aree senza segnali 1f. Il tampone della sonda è evaporato durante l ibridazione. 1g. Le condizioni di lavaggio stringente erano inadeguate. 1h. Il microscopio non funziona correttamente - Il filtro impostato non è adatto - La lampada non è adatta - La lampada al mercurio è datata - Bruciatura filtri - Le lenti sono sporche o graffiate - L olio di immersione non è adatto 1f. Assicurare un grado di umidità adeguato all interno della camera di ibridazione. Usare Dako Hybridizer (codice S2450/S2451) e Hybridizer Humidity Control Strips (codice S2452). Usare il collante Coverslip Sealant. Vedere Risoluzione dei problemi, punti 5a e 5b. 1g. Verificare che la temperatura e i tempi utilizzati nel lavaggio stringente siano corretti e che prima del lavaggio siano rimossi i vetrini coprioggetto. 1h. Esaminare il microscopio e accertarsi che i filtri in uso siano adatti ai fluorocromi e che non siano usurati e che la lampada al mercurio sia idonea e non sia stata sovrautilizzata (vedere l Appendice 1). Usare olio di immersione adatto per la fluorescenza. In caso di dubbio, contattare il fornitore del microscopio. 1i. I segnali hanno perso intensità. 1i. Evitare un esame microscopico prolungato e ridurre al minimo l esposizione a fonti di luce intensa. 2a. Il volume della sonda è insufficiente. 2b. Durante l applicazione della sonda o il montaggio sono state intrappolate delle bolle d aria. 2a. Assicurarsi che il volume della sonda sia sufficientemente largo da ricoprire l area al di sotto del coprioggetto 2b. Evitare l intrappolamento di bolle d aria. Se sono presenti bolle d aria, picchiettarle via delicatamente con la pinza. 2c. Sparaffinatura insufficiente. 2c. Assicurarsi che la paraffina sia stata completamente rimossa dalle sezioni. Vedere la sezione B.2. ( ) P04094IT_02_K / p. 22/29

23 3. Colorazione eccessiva del fondo 4. Morfologia dei nuclei scarsa o colorazione dei nuclei troppo debole 3a. Tempo di digestione inappropriato. Fondo citosolico verde forte potrebbe indicare sotto-digestione. 3b. Le sezioni sono state asciugate in B.3. 3c. La paraffina è stata rimossa parzialmente. 3d. La temperatura del lavaggio stringente è troppo bassa. 3e. La sezione sottoposta a ibridazione è stata esposta a una fonte di luce intensa per troppo tempo. 3f. Vetrini scaduti o non adatti possono provocare una colorazione rossa eccessiva. 3g. Olio di immersione non fluorescente miscelato con Fluorescence Mounting Medium. 4a. Condizioni inadeguate durante il pretrattamento possono determinare un risultato poco chiaro o ambiguo. 4b. L ebollizione durante il pretrattamento può provocare danni morfologici e perdita di segnali. 3a. Assicurarsi che vengano utilizzate sezioni tissutali incluse in paraffina, fissate in formalina. Potrebbe essere utile predisporre un periodo di digestione prolungato, ad esempio di 7 15 minuti a 37 C. Consultare la sezione B.3.a o B.3.b. Fase 2, Risoluzione dei problemi punto 4e e Appendice 2. 3b. Seguire le istruzioni ed evitare l asciugatura dei vetrini se non diversamente specificato. 3c. Seguire le procedure di sparaffinatura e di reidratazione descritte nella sezione B.2 3d. Assicurarsi di utilizzare la temperatura di lavaggio stringente consigliata. 3e. Evitare un esame microscopico prolungato e ridurre al minimo l esposizione a fonti di luce intensa. 3f. Usare i tipi di vetrini raccomandati e assicurarsi che non siano scaduti. Vedere la sezione Sezioni incluse in paraffina. 3g. Usare vetrini coprioggetto grandi durante il montaggio come indicato. Consultare la sezione B.3.a o B.3.b, Fase 5. Ciò evita la miscelazione dell olio di immersione con il mezzo di montaggio, evitando l auto-fluorescenza e la rimozione accidentale di coprioggetti con l obiettivo del microscopio. 4a. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata. Vedere anche Risoluzione dei problemi, punto 4b-e. 4b. Evitare l ebollizione. Vedere la sezione B.3, fase 1. Vedere anche Risoluzione dei problemi punto 4d. ( ) P04094IT_02_K / p. 23/29

24 4c. Trattamento errato con Pepsin. 4c. Rispettare i tempi d incubazione raccomandati per la pepsina. Vedere sezione B.3, fase 2 e Appendice 2. Vedere anche Risoluzione dei problemi punto 1a, 1c 3a, 4d e 4e. 5. Il coprioggetto aderisce al vetrino dopo l ibridazione ed è difficile rimuoverlo. 4d. Un trattamento con pepsina troppo lungo dissolverà il tessuto con conseguente mancanza di segnali. La sovradigestione può provocare cellule ghost o donut e nuclei con una morfologia nucleare generalmente scarsa. 4e. Un trattamento con pepsina troppo breve può provocare assenza di segnali. Un tessuto sotto-digerito può provocare la colorazione dei nuclei periferici e fori nei nuclei (filtro DAPI); fondo verde elevato in citosol (doppio filtro rosso/fitc Texas). I nuclei in tessuto sotto-digerito hanno una bella morfologia rispetto al tessuto sovradigerito. 4f. La denaturazione si è svolta a una temperatura eccessiva. 4g. Condizioni di ibridazione inadeguate. 5a. Coprioggetto applicato in modo appropriato al vetrino. 4d. Abbreviare l incubazione con Pepsin. Consultare la sezione B.3.a o B.3.b, Fase 2 e l'appendice 2. Assicurarsi che lo spessore delle sezioni sia di 2-6 µm. Vedere anche Risoluzione dei problemi punto 1a, 1c, 4b e 4e. 4e. Prolungare il tempo di incubazione della pepsina a 2 3 volte il tempo di digestione usato. Vedere anche Risoluzione dei problemi, punti 1a, 1c, 3a, 4a e 4d. 4f. Assicurarsi di utilizzare la temperatura di denaturazione consigliata. 4g. Vedere Risoluzione dei problemi, punti 1f e 5b. 5a. Non forzare il coprioggetto se quest ultimo aderisce troppo al vetrino. Immergere il vetrino nella vaschetta contenente Stringent Wash Buffer diluito a temperatura ambiente per cinque minuti e quindi rimuovere il coprioggetto. Seguire le raccomandazioni per la sigillatura dei vetrini coprioggetto nella sezione B.3.a o B.3.b, Fase 3. Vedere anche Risoluzione dei problemi punto 1f e 5b. ( ) P04094IT_02_K / p. 24/29

25 6. Livello elevato di autofluorescenza verde sui vetrini, comprese le aree senza tessuto FFPE 5b. Condizioni di ibridazione inadeguate. Può provocare segnali ridotti o assenti, danni ai tessuti e colorazione di fondo. 6. Uso di vetrini scaduti o sconsigliati 5b. Assicurare un grado di umidità adeguato all interno della camera di ibridazione. Usare Dako Hybridizer (codice S2450/S2451) e Hybridizer Humidity Control Strips (codice S2452). Seguire le istruzioni fornite nel Foglietto illustrativo per Hybridizer Humidity Control Strips. Consultare le condizioni di ibridazione consigliate nella sezione B.3.a o B.3.b, Fase 3. Vedere anche Risoluzione dei problemi punto 1f e 5a. 6. Assicurarsi che il vetrino rivestito (Dako Silanized Slides, codice S3003 o vetrini rivestiti in poli-l-lisina) non abbiano superato la data di scadenza. NOTA: se il problema non è imputabile a nessuna di queste cause o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l Assistenza Tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. ( ) P04094IT_02_K / p. 25/29

26 Appendice 1 Histology FISH Accessory Kit, codice K5799 Specifiche per il microscopio a fluorescenza Dako consiglia di utilizzare l attrezzatura elencata di seguito insieme al prodotto Histology FISH Accessory Kit e alle sonde Dako FISH: 1. Tipo di microscopio Microscopio ad epifluorescenza. 2. Lampada Lampada al mercurio da 100 watt (in genere va sostituita dopo 200 ore d uso). 3. Obiettivi Per l esame del tessuto, utilizzare obiettivi a secco per fluorescenza 10X oppure obiettivi a immersione d olio per fluorescenza 16X. Per un ingrandimento elevato e per la valutazione dei segnali, utilizzare solo obiettivi a immersione d olio per fluorescenza, in particolare 63X o 100X. 4. Filtri Esistono filtri progettati in modo specifico per singoli fluorocromi. Dako consiglia di utilizzare un filtro DAPI specifico e un filtro doppio Texas Red/FITC di alta qualità insieme alle sonde Dako FISH. Filtro DAPI, ad es. Omega Optical #XF06 o filtro Chroma # Filtro doppio Texas Red/FITC, ad esempio filtro Omega Optical n. XF53 o filtro Chroma n Per conferma, è possibile utilizzare filtri singoli Texas Red e FITC, ad es. filtro Omega Optical # XF102-2 e XF202, rispettivamente. Fluorocromo Lunghezza d onda di eccitazione Lunghezza d onda di emissione FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Dato che esistono filtri specifici per ogni tipo di microscopio, l uso dei filtri adatti è fondamentale per una corretta interpretazione. Per informazioni più dettagliate, rivolgersi al produttore del microscopio in uso o al rappresentante Dako o il sito Web Dako. 5. Olio Olio per immersione non fluorescente. Precauzioni Per ogni fluorocromo serve un attrezzatura specifica. Nel caso delle sonde Dako FISH, si sconsiglia l uso di una lampada al mercurio da 50 watt, di filtri in rodamina e di filtri tripli. L uso di un microscopio non ottimizzato potrebbe causare problemi durante la lettura dei segnali fluorescenti. È importante che la fonte di illuminazione non sia utilizzata oltre la data di scadenza e che sia allineata con precisione e a fuoco. Si consiglia ai clienti di seguire attentamente le istruzioni per l uso e la conservazione fornite dal produttore della lampada al mercurio e dal produttore del microscopio. È necessario assicurarsi che il campione sia esposto alla luce di eccitazione per il minor tempo possibile, di modo che la fluorescenza non perda intensità. Prima di iniziare la procedura di ibridazione in situ con sonde fluorescenti, si consiglia di parlare della configurazione del microscopio con il produttore o di leggere la documentazione tecnica disponibile sull argomento. ( ) P04094IT_02_K / p. 26/29

27 Appendice 2 Procedura facoltativa per ottimizzare il tempo di digestione con Pepsin Questa procedura facoltativa consente di valutare l effetto della digestione con Pepsin e di ottimizzare il tempo previsto nel fase 2: Pepsin. Per verificare se il tempo previsto per la digestione con Pepsin è o meno sufficiente, colorare la sezione di tessuto digerita con Pepsin reperendo a questo scopo 10 µl di ioduro di propidio (400 ng/ml). Montare un vetrino coprioggetto di 22 mm x 22 mm in vetro sopra allo ioduro di propidio, lasciando che questo si espanda in modo uniforme sotto al vetrino coprioggetto. Incubare per 1 minuto. Utilizzare un microscopio a fluorescenza con filtro doppio Texas Red/FITC (vedere l'appendice 1) per valutare la colorazione rossa dei nuclei ad opera dello ioduro di propidio. Se la digestione del tessuto è accettabile, dovrebbero essere visibili nuclei rossi con perimetri ben definiti. Rimuovere lo ioduro di propidio immergendo due volte le sezioni in tampone Wash Buffer diluito, per 3 minuti ogni volta, a temperatura ambiente (20 25 C). Continuare con la sezione B3, Protocollo di colorazione, Fase 3, Sonda FISH. Se i nuclei sono ancora verdi per autofluorescenza e non sono stati colorati di rosso dallo ioduro di propidio, è necessario ripetere il ciclo di digestione. Immergere due volte le sezioni in tampone Wash Buffer diluito, per 3 minuti, a temperatura ambiente (20 25 C) per rimuovere lo ioduro di propidio. Applicare 5-8 gocce (250 µl) di reagente Pepsin (flacone 2) freddo (2-8 C) in modo tale da coprire il campione. Conservare il reagente Pepsin sempre a 2-8 C. Collocare i vetrini a 37 C su Dako Hybridizer o su un blocco riscaldante preriscaldato. In assenza totale o parziale di digestione, incubare per 10 minuti. Il tempo indicato (10 minuti) è solo indicativo: spetta all utente definire il tempo ottimale. Immergere nuovamente i vetrini per due volte in tampone Wash Buffer diluito, per 3 minuti, a temperatura ambiente (20 25 C), per rimuovere il reagente Pepsin. Applicare ancora una volta 10 µl di ioduro di propidio (400 ng/ml) per 1 minuto. Valutare la colorazione e immergere due volte le sezioni in tampone Wash Buffer diluito, per 3 minuti ogni volta, a temperatura ambiente (20 25 C). Ripetere il ciclo per il numero di volte necessario oppure passare alla sezione B3.a o B.3.b, Protocollo di colorazione, Fase 3, Sonda FISH. NOTA: il kit contiene i reagenti sufficienti per 20 test. Se si utilizzano i prodotti Wash Buffer e Pepsin in questa procedura facoltativa, il numero totale di test che si possono eseguire con il kit si ridurrà. ( ) P04094IT_02_K / p. 27/29

28 Bibliografia 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; ( ) P04094IT_02_K / p. 28/29

29 Spiegazione dei simboli Numero di catalogo Limiti di te mperatura Codeice del lo tto Dispositivo medico-diagnostico in vitro Consu ltare le instruzio ni pe r l'uso Tenere al ripar o dalla luce diretta del sole (con sultare la sezio ne relativa alla conservazione) Contenuto sufficien te par "n" saggi Utilizzare entro Fa bb ricante Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle precauzioni) Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle p recauzioni) Pittogramma GHS (con sultare la se zione sulle precauzioni) Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle precauzioni) Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle p recauzioni) Prodotto da: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel DK-2600 Glostrup Fax Denmark ( ) P04094IT_02_K / p. 29/29