CICLO DELL AZOTO

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1 CICLO DELL AZOTO

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6 CICLO AZOTO Il ciclo dell N rappresenta uno dei più importanti cicli dei nutrienti negli ecosistemi terrestri. L N è utilizzato dagli organismi per produrre molecole organiche complesse come amino acidi, proteine, e acidi nucleici. La riserva di N è l atmosfera, dove è presente come gas (N2). Altre riserve di N sono la materia organica del suolo e del mare. Nonostante la sua abbondanza nell atmosfera l N è spesso l elemento che più limita la crescita delle piante. Questo perchè la maggior parte delle piante assorbe N in due forme: ione ammonio (NH4+ ) e ione nitrato (NO3- ). Le piante assorbono N come nitrato inorganico dalla soluzione del suolo. L ammonio è meno utilizzato dalle piante per l assorbimento. Gli animali ricevono l N necessario per il metabolismo e la crescita e la riproduzione consumando materia organica che contiene molecole azotate. Nella maggior parte degli ecosistemi l N è immagazzinato nella materia organica viva e morta. Questo N organico è convertito a forme inorganiche quando rientra nel ciclo biogeochimico attraverso la degradazione della S.O.. I decompositori che si trovano nello strato superiore del suolo modificano chimicamente l N della sostanza organica ad ammoniaca (NH3 ) a sali di ammonio (NH4+). Questo processo si chiama mineralizzazione ed è portato avanti da una grande varietà di batteri, attinomiceti, funghi.

7 L azoto in forma di ammonio può essere assorbito sulla superficie delle particelle di argilla nel suolo. Lo ione ammonio ha una carica positiva ed è trattenuto dai colloidi del suolo. L ammonio è rilasciato dai colloidi per scambio cationico. Quando è rilasciato, l ammonio è spesso chimicamente trasformato da uno specifico gruppo di batteri autotrofi (Nitrosomonas) in nitrito (NO2- ). Ulteriori modificazioni da parte di Nitrobacter convertono il nitrito in nitrato (NO3- ). I due processi comportano una ossidazione chimica e sono conosciuti globalmente come nitrificazione. Comunque, il nitrato è molto solubile ed è facilmente perso dal sistema suolo per dilavamento. Parte di questo nitrato fluisce attraverso il sistema idrico e può ritornare nell atmosfera per denitrificazione. La denitrificazione è comune in suoli allagati anaerobi ed è portata avanti da batteri eterotrofi, che riducono il nitrato a azoto molecolare (N2) o ossido nitroso (N2O).

8 Le attività umane hanno alterato il ciclo dell N: - Applicazione di fertilizzanti azotati alle colture ha causato tassi più alti di denitrificazione e il dilavamento di nitrati nelle falde idriche, da cui fluiscono nei fiumi, laghi, mari. E dove possono causare eutrofizzazione. - Aumento delle deposizioni dall atmosfera a causa della combustione di risorse fossili e delle foreste. - Gli allevamenti di animali rilasciano grandi quantità di ammonio nell ambiente neglio escrementi. Questo N entra nel suolo e nel sistema idrico attraverso il dilavamento e il flusso nelle falde acquifere.

9 Quasi tutto l N trovato negli ecosistemi terrestri proviene dall atmosfera. Piccole quantità di N arrivano al suolo con le piogge o i fulmini. La maggior parte è fissata biochimicamente nel suolo da microrganismi specializzati, batteri, attinomiceti e cianobatteri. Piante della famiglia delle leguminose e altre specie formano una simbiosi mutualistica con batteri fissatori di N, che in cambio ricevono dalla pianta zuccheri e strutture (noduli radicali) dove vivere in una nicchia ecologica speciale.

10 Solo i microrganismi portano avanti il processo di fissazione, nitrificazione e denitrificazione. Fissazione dell Azoto = la conversione microbica dell azoto molecolare (N2) ad ammonio (NH3). L ammonio esiste in soluzione come ione ammonio (NH4+). Cioè, gli organismi superiori sono completamente dipendenti dai microrganismi per il loro N delle proteine, acidi nucleici etc. Assimilazione N = ammonio è incorporato in molecole organiche (R- NH2). Deaminazione = le molecole organiche contenenti N sono deaminate durante la decomposizione del materiale organico, producendo ammonio. Nitrificazione = batteri del suolo ossidano l ammonio. Il primo prodotto della ossidazione è NO2-, prodotto da batteri del genere Nitrosomonas. Il nitrito è ulteriormente ossidato dai batteri del genere Nitrobacter, producendo ione nitrato (NO3-). Denitrificazione (o riduzione dei nitrati) = riduzione dissimilativa dei nitrati, in cui il nitrato è ridotto producendo gas N2. Le piante sono capaci di operare la riduzione assimilativa dei nitrati, i.e. usano il nitrato come fonte di N riducendolo e incorporando N nelle molecole organiche.

11 MINERALIZZAZIONE Nella mineralizzazione, l N organico proveniente dalla degradazione del materiale vegetale e animale (proteine, acidi nucleici, amino zuccheri, urea) è convertito ad ammoniaca (NH3) ed ammonio (NH4+). Questo processo si definisce ammonificazione. L ammonio che ne deriva può essere convertito ad N organico (immobilizzazione) quando è assorbito da microrganismi e piante (assimilata), o nitrificato a nitrato (NO3-).

12 Una volta formato, NH4+ può avere diversi destini: assimilato (o immobilizzato) dai microbi o dalle piante. trattenuto dai colloidi del terreno. fissato nello strato interno delle argille. volatilizzato come NH3 nella vegetazione o nel letame in decomposizione. nitrificato da parte dei batteri nitrificanti autotrofi

13 Rimozione del gruppo amminico: 1. Diretta R-CH2 CH-NH2-COOH > R-CH=CH-COOH + NH3 2. Deaminazione (ossidativa - aerobica, riduttiva - anaerobica) Ossidativa: R-CH2CH-NH2COOH + 1/2 O > R-CH2-CO-COOH + NH3 Riduttiva: R-CH2CH-NH2COOH + 2H > R-CH2CH-COOH + NH3 3. Decarbossilazione Reductive: R-CH2CH-NH2COOH + H > RCH3 + CO2 + NH3 Oxidative: R-CH2CH-NH2COOH + O > R-COOH + CO2 + NH3 4. Idrolisi dell Urea - Ammonificazione CO(NH2)2 + HOH + UREASI ----> H2NCOOHNH4 (Ammonio Carbammato)-----> 2NH3 + CO2 2NH3 + HOH > 2NH4OH

14 IMMOBILIZZAZIONE Ammonio e nitrato sono assorbiti dai microrganismi e resi indisponibili per le piante, in dipendenza del rapporto C:N. Quando N è abbondante, sia i microbi che le piante assimilano ammonio e nitrato. Il nitrato è ridotto e convertito ad ammoniaca con reazioni simili a quelle della denitrificazione. L ammoniaca è poi incorporata negli intermedi del ciclo di Kreb's per formare amino acidi. Il rapporto C:N è usato come indicatore della tappa del ciclo dell N che sta avvenendo. Rapporti minori di 20 portano ad un eccesso di N e la nitrificazione procede. Con rapporti tra 20 e 30, i tassi di nitrificazione e immobilizzazione sono in equilibrio. Con rapporti maggiori di 30, N è limitato e si ha immobilizzazione.

15 Nitrobacter sp. Nitrosomonas sp. Nitrosolobus sp.

16 Relazione tra rapporti C:N e netta immobilizzazione e nitrificazione. < >30 Net gain of NH 4 + and NO 3 - Neither gain nor loss Net uptake of NH 4 + and NO 3 - C:N Ratio Microbial tissues 6-12 Sewage sludge 5-14 Soil humus Legume residues and green manures Cereal residues and straw Pine needles 225 Forest wastes Residues that have C:N ratios greater than about 30, equivalent to N contents of about 1.5% or less, result in lowering of mineral N reserves because of net immobilization. Residues with C:N ratios below about 20, or N contents greater than 2.5%, lead to an increase in mineral levels through net mineralization. Excess nitrogen (as NH4+) stimulates the process of NITRIFICATION.

17 NITRIFICAZIONE Processo portato avanti da un gruppo di chemoautotrofi aerobi: i nitrificanti. Bassi livelli di nitrificazione eterotrofa possono avvenire, ma le quantità di nitrato prodotte sono molto basse. Tutti i nitrificanti sono aerobi e la nitrificazione procede a rapporti C:N di meno di 20, quando cioè N è abbondante. Nelle lettiere forestali, la maggior parte della nitrificazione avviene da parte dei funghi saprofiti piuttosto che dei batteri chemolitotrofi.

18 Tassi di nitrificazione di alcuni nitrificanti eterotrofi e autotrofi (Tasso di Formazione (micro-g N/giorno/g peso secco) Organismo Substrato Prodotto Arthrobacter NH4+ Nitrito 375-9,000 (eterotrofo) Aspergillus NH4+ Nitrato 1, Nitrosomonas NH4+ Nitrito 1-30 million (autotrofo) Nitrobacter NO2- Nitrato 5-70 million (autotrofo)

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20 La Nitrificazione è un processo a due tappe 1. Prima tappa: Ossidazione dell ammonio Batteri: ammonio ossidanti. Quattro generi, con diverse specie: Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus. Nitrosomonas è stato molto studiato ed è il più numeroso nel suolo, mentre Nitrosospira è un nitrificante acquatico. NH4+ + 1/2 O > NH2OH + H+ NH2OH + O > NO2- + HOH + H+ Reazione complessiva: NH /2 O2 ----> NO2- + HOH + 2H+. 65 kcal sono liberate per grammo atomo of ammonio ossidato. 2. Seconda tappa: Ossidazione del nitrito Batteri: genere Nitrobacter NO2- + 1/2 O > NO kcal liberate per grammo atomo di nitrito ossidato.

21 Batteri Ammonio-Ossidanti: Bacilli, sferici, spirilli o lobati, Gram-negativi. Flagellazione delle cellule mobili polare-subpolare-peritrica. Aerobi ma possono crescere anche a pressioni ridotte di ossigeno. Chemoautotrofi, ammonio come substrato energetico e CO2 come fonte di C. Ottima temperatura di crescita 30 C e ottimo ph tra 7.5 e 8.0. Presenti in una gran varietà di suoli, oceani, fiumi, laghi. Nitrosomonas sp. Nitrosolobus sp.

22 Batteri Nitrito-Ossidanti Bastoncini, ellissoidali, sferici, spiralati, Gram negativi. Cellule mobili e non. I flagelli sono polari o laterali. Aerobi. Chemoautotrofi, ottengono energia dalla ossidazione del nitrito a nitrato. CO2 è fissata attraverso il ciclo di Calvin. Mesofili, con ottimo di temperatura di 28 C e un range di ph range di , con ottimo tra 7.6 e 7.8. Unicellulari, aerobi. Presenti nel suolo, in acque dolci e salate, fanghi, discariche, e sulle pietre di edifici storici e nelle riocce. Nitrobacter sp.

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24 IMPATTO AMBIENTALE (i) La Nitrificazione è importante nel processo di decomposizione del materiale azotato e nel riciclo degli atomi di N: la deaminazione dell N organico produce ammoniaca che è ossidata a nitrato attraverso la nitrificazione. (ii) I microrgansismi che operano la nitrificazione sono inefficienti. La maggior parte sono autotrofi che usano l energia ottenuta dalla ossidazione dell ammonio per fissare C. Quindi hanno un duplice ruolo ecologico: nel ciclo dell N e nella fissazione del C in molecole organiche. La fissazione del C attraverso questo sistema non è efficiente, perciò devono ossidare molto ammonio per ottenere abbastanza energia per fissare il C. La fissazione di una mole di C richiede l ossidazione di 35 moli di ammonio a nitrito e di 100 moli di nitrito a nitrato. (iii) I microrganismi che operano la nitrificazione sono fragili. Sono sensibili agli acidi pur producendoli. In presenza di grandi quantità di sostanze azotate nell ambiente essi possono provocare la loro morte producendo acido nitrico. Sono aerobi stretti, e possono essere uccisi dall introduzione di grandi quantità di residui organici che favoriscono la crescita abbondante di altre specie che consumano ossigeno.

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26 AGRICOLTURA La Nitrificazione è considerata dannosa nell agricoltura industriale. In condizioni ottimali, la conversione dell ammoniaca a nitrato è molto rapida: per esempio metà del fertilizzante ammoniacale somministrato può essere convertito a nitrato in 30 giorni. I fertilizzanti contengono ammonio (NH4+). Si può verificare una competizione per l ammonio tra piante, che lo incorporano in molecole organiche (R-NH2), e i microbi che lo ossidano a nitrato. Sebbene le piante possano usare sia ammonio che nitrato come fonti di N, l ammonio può essere adsorbito sulle particelle di argilla caricate negativamente a causa di interazioni elettrostatiche. Il Nitrato non ha tali affinità per l argilla ne è allontanato avendo la stessa carica. L N dei fertilizzanti è così sprecato se è convertito a nitrato che è velocemente dilavato dal suolo con le pioggie. Una strategia usata per combattere questo problema è quella di aggiungere nitrapirina ai fertilizzanti, che inibisce la crescita dei nitrificanti inbendo l enzima ammonio monoossigenasi.

27 DENITRIFICAZIONE Denitrificazione è la riduzione del nitrato (NO3-) ad N gassoso o a N organico. Due tipi di denitrificazione: dissimilativa e assimilativa. 1. Dissimilativa La via dissimilativa riporta N nell atmosfera riducendo il nitrato a N gassoso: NO > NO > NO -----> N2O -----> N2 gas L emzima chiave della denitrificazione è la nitrato riduttasi. L ossigeno è l accettore di elettroni preferito, ma quando non è presente i denitrificanti usano il nitrato. L espressione di geni nar che codificano per la nitrato riduttasi è altamente regolata. Tali geni sono attivati solo quando il nitrato è presente e non c è ossigeno.

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29 2. Denitrificanti più importanti: La denitrificazione è un processo esclusivamente microbico, portato avanti da anaerobi facoltativi, due generi principali: Pseudomonas spp., Bacillus spp. 3. Impatto in agricoltura La denitrificazione dissimilativa era considerata dannosa per l agricoltura. Ma è un importante processo che riporta nell atmosfera l N gassoso sottratto dalla azotofissazione Pseudomonas sp.

30 Individual Steps in Dissimilatory Nitrate Reduction First step: Reduction of Nitrate to Nitrite 2HNO > 2HNO2 +4e [2NADH-H -----> 2NAD] Enzyme: Dissimilatory Nitrate Reductase Second step: Reduction of Nitrite to Nitric oxide 2HNO > 2NO +2e [NADH-H > NAD] Enzyme: Dissimilatory Nitrite Reductase Third Step: Reduction of Nitric Oxide to Nitrous Oxide 2NO >N2O +2e [NADH-H ----> NAD] Enzyme: Dissimilatory Nitric Oxide Reductase Fourth Step: Reduction of Nitrous Oxide to Dinitrogen N2O > N2 +2e [NADH-H > NAD]

31 RIDUZIONE ASSIMILATIVA DEI NITRATI I Microorganismi e le piante possono assorbire e usare sia nitrato che ammonio come fonte di N. Quando viene assorbito nitrato, deve essere prima ridotto ad ammonio per produrre aminoacidi (il contrario della nitrificazione). Questa riduzione è un processo a tre stadi che richiede NADH ed energia. First step: reduction of nitrate to nitrite 2 HNO3-----> 2HNO2 [2 NADH-H > 2NAD] enzyme: Assimilatory Nitrate Reductase Second step: reduction of nitrite to hydroxylamine 2 HNO > 2NH2OH [ NADH-H ----->NAD] enzyme: Assimilatory Nitrite Reductase Third step: reduction of hydroxylamine to ammonia 2 NH2OH -----> 2NH3 [NADH-H ----> NAD] enzyme: Assimilatory Hydroxylamine Reductase Fourth step: protein synthesis 2NH3 + Organic Acids ---> Amino Acids ---> Proteins

32 IMPATTO AMBIENTALE DEL NITRATO L azoto usato in maniera irrresponsabile può avere effetti disastrosi sull ambiente. Elevati livelli di NO3- nel cibo enell acqua possono costituire un rischio per la salute umana e animale. L ingestione di grandi quantità di NO 3- da parte di neonati può causare una malattia chiamata metemoglobinemia. La Metemoglobinemia si verifica quando NO 3- ingerito è ridotto a NO 2- dai batteri presenti nel tratto gastrointestinali dei neonati durante i primi mesi di vita. NO 2- è rapidamente assorbito dallo stomaco e fluisce nel sangue dove ossida il Fe dell emoglobina allo stato ferrico, formando metemoglobina. La Metemoglobina non può funzionare nel trasporto dell ossigeno molecolare e si verifica anossia cellulare. Gli effetti possono essere osservati quando circa il 5% della emoglobina è convertito a metemoglobina, ma la morte avviene solo quando il livello di metemoglobina è superiore al 50%.

33 FISSAZIONE DELL AZOTO. 1. Fissazione Chimica Il processo Haber (sviluppato nel 1908) è un metodo chimico per produrre ammoniaca partendo da azoto molecolare e idrogeno: N2 + H > NH3 Le condizioni per la reazione sono estreme: C e 200 atm. do pressione. Tali condizioni forniscono l energia di attivazione necessaria per la reazione.

34 Azotofissazione biologica azotofissazione nitrificazione ammonificazione

35 2. Fissazione biologica dell azoto

36 Azotofissatori Nonostante l enzima nitrogenasi sia sensibile all ossigeno, alcuni microrganismi aerobi possono fissare N. Gli organismi che fissano N includono: Azotofissatori liberi: Azotobacter spp.: vive nel suolo, in ambienti aerobi, ha un alto tasso di respirazione. Mesofilo, temperatuira ottimale 30 C, ph> 6. Fissa 5-20 mg di N2 per grammo di zucchero ossidato. (Fissa meno di 1 Kg/ha/anno di N). nelle regioni temperate la specie più rappresentativa è Azotobacter chroococcum ( /g suolo) Klebsiella spp. bacteri del suolo, possono vivere in presenza o assenza di ossigeno. Clostridium pasterianum, nei suoli anaerobi Cianobatteri (e.g. Anabeana spp., Nostoc) batteri acquatici; presenti in ambienti aerobi. Azotofissatori Simbionti : Rhizobium spp. simbionti vegetali; fissano grandi quantità di N (50-400Kg N 2 per ha per anno). Frankia alni (ontano), Bradirhizobium japonicum (soia), Rhizobium trifolii (trifoglio), Rhizobium meliloti (medica).

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42 Protezione della Nitrogenasi Come fanno gli organismi che vivono in ambienti aerobi a proteggere la nitrogenasi dall ossigeno e quindi a fissare l N? (i) Azotobacter ha un tasso molto alto di respirazione. Consuma ossigeno molto velocemente cosicché la concentrazione intracellulare di ossigeno è mantenuta abbastanza bassa che la nitrogenasi non è inibita. (ii) L aerobio facoltativo Klebsiella fissa N solo quando è in un ambiente privo di ossigeno. (iii) I Cianobatteri filamentosi possiedono cellule specializzate chiamate eterocisti all interno delle quali fissano N. La diffusione dell ossigeno all interno di queste cellule è limitata. (iv) Rizobi Un ambiente "anaerobio" si viene a formare nei noduli. I noduli sono strutture formate sulle radici delle piante dove la fissazione dell N è portata avanti dai batteri. Le piante riforniscono i batteri di C e i batteri forniscono N. L ambiente è mantenuro anaerobio attraverso la cattura dell ossigeno da parte della legemoglobina (LHb). Trifolium subterraneum

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46 TUBERCOLI RADICALI: risultato della proliferazione dei tessuti nicchie ecologiche: ambiente privo di ossigeno. Sistema di protezione del complesso enzimatico LEG-EMOGLOBINA essenziale nell N fissazione: facilita il trasporto di O 2. Conferisce il colore rosso al tessuto indice dell attività di N-fissazione dei noduli

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48 T.repens

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50 Primordi nodulari su radice di V. faba

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55 USO IN AGRICOLTURA

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