Il laboratorio accreditato di diagnosi fitopatolologica del Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura "Basile Caramia" Trisciuzzi N. e A. Cardone Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura Basile Caramia, Locorotondo (BA) Premessa Il Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura Basile Caramia (CRSA) sin dall'avvio delle attività si è occupato di problemi fitopatologici, organizzando, con il supporto del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata (DPPMA) dell'università di Bari, un laboratorio di diagnosi fitopatologica. Successivamente all emanazione dei DD.MM. del 14.04.1997, che presentano tra gli aspetti innovativi il riconoscimento formale del ruolo dei laboratori di diagnosi fitopatologica per la garanzia della qualità delle produzioni vivaistiche (categoria C.A.C.) da parte del fornitore (vivaista), il CRSA ha avviato presso il Servizio Fitosanitario della Regione Puglia (SFR) la procedura per la richiesta di accreditamento del proprio laboratorio, in quanto questo risultava conforme al disposto dell'articolo 10 dei DD.MM. del 14 aprile 1997 (Fig. 1). Fig. 1. Il laboratorio accreditato del C.R.S.A. In data 6 aprile 1998 il laboratorio è stato accreditato a svolgere "analisi fitosanitarie relative a batteri, funghi, fitoplasmi (MLO's), viroidi e virus su piantine ortive e relativi materiali di moltiplicazione (art. 3 comma 1 lettera d del D.P.R. 21/12/1996, n.698), e su piante da frutto e relativi materiali di moltiplicazione (art. 3 comma 1 lettera d del D.P.R. 21/12/1996, n. 697)".
Inoltre, in data 21 maggio 1999 il laboratorio è stato accreditato a svolgere anche analisi fitosanitarie relative ai nematodi. Attività di accreditamento In qualità di laboratorio accreditato, il CRSA pone la sua attività al servizio del fornitore (vivaista) il quale, per produrre materiale di propagazione di categoria C.A.C., dovrà presentare apposita domanda al SFR competente per territorio, indicando il laboratorio che effettuerà le analisi richieste. Per quanto riguarda l iter proposto dal CRSA, il vivaista deve inoltrare al laboratorio una domanda in cui, oltre ad indicare i dati personali e identificativi dell azienda, deve riportare le caratteristiche tecniche dei campi e delle strutture destinate alla produzione del materiale di moltiplicazione categoria C.A.C.. Successivamente alla presentazione della domanda, i tecnici del laboratorio del CRSA procederanno alla verifica dell effettivo possesso da parte dell azienda dei requisiti dichiarati dal vivaista. Questa verifica è propedeutica alla sottoscrizione di un contratto (allegato 1) tra il laboratorio e il vivaista. Con la stipula del contratto, il vivaista si impegna ad osservare tutte le norme tecniche e gli obblighi previsti per l accreditamento (allegato V per le ortive e allegato VII per le piante da frutto nel rispettivo decreto del 14/4/1997) nonché le indicazioni del laboratorio stesso (allegato 2), pena l annullamento del contratto. Da parte sua, il CRSA si impegna a comunicare al vivaista i risultati dei saggi eseguiti tramite il rilascio di un certificato (allegato 3) secondo i tempi e le modalità indicati nel contratto. Per quanto riguarda i protocolli di accertamento sanitario, il CRSA, in possesso di competenze soprattutto nel settore virologico, si attiene alle indicazioni impartite dal SFR relativamente alle modalità di campionamento, ai patogeni e alle tecniche di diagnosi (allegato 4), e si avvale del supporto scientifico del DPPMA e del Centro di Studio sui Virus e le Virosi delle Colture Mediterranee (Ce.Vi.Co.M) del CNR di Bari per l attuazione della stessa diagnosi virologica, delle analisi micologiche e batteriologiche; per le analisi nematologiche, si avvale della collaborazione dell Istituto di Nematologia Agraria del CNR di Bari. In questi primi anni di attività come laboratorio accreditato, il CRSA ha lavorato per aziende vivaistiche della Puglia e della Sicilia. Nella tabella 1, che riassume l attività svolta, si riportano, per ciascuna delle regioni in cui il Laboratorio ha operato, le località e il numero delle aziende interessate all attività di accreditamento, le specie vegetali e, per ognuna di esse, il numero delle piante saggiate ed, infine, come risultato degli accertamenti sanitari effettuati, si riporta il numero delle piante con stato sanitario conforme a quanto previsto dal decreto per ciascuna specie, oltre a quelle non conformi con l indicazione del patogeno individuato.
Conclusioni L avvio delle attività è stato caratterizzato dalla difficoltà iniziale di far comprendere il ruolo del laboratorio accreditato e la necessità di modificare il processo produttivo e di eseguire interventi di carattere strutturale per poter produrre piantine di ortive e materiale di propagazione di specie arboree con stato sanitario conforme all allegato II dei DD.MM. del 14/4/1997, cioè produzioni vivaistiche di categoria C.A.C. Dopo due anni di attività, pur essendoci ancora molti problemi da risolvere, non mancano riscontri positivi come testimoniato dall incremento delle richieste di accreditamento e soprattutto dalla disponibilità dei vivaisti nel mettere in atto i suggerimenti del laboratorio e dalla loro collaborazione nelle attività di controllo.
Tabella 1. Attività svolta dal laboratorio accreditato del CRSA nel biennio 1999-2000 Regione Sicilia località n aziende prov. di: Palermo Messina 1 3 specie n piante saggiate virus e viroidi agrumi 186 CTV (Virus della tristezza degli agrumi) CPV (Virus della psorosi) CVV (Virus della variegatura infettiva) CEVd (Viride dell exocortite) CCaVd (Viroide della cachessia) CGV (concavità gommose) Imp. (impietratura) CCr (cristacortis) n piante con stato sanitario conforme 147 39: n piante con stato sanitario non conforme 31 pos. ai viroidi; 4 pos. a viroidi e psorosi 1 pos. alla variegatura; 2 pos. ad agenti virussimili fruttiferi 2000 PPV (Virus della vaiolatura del susino) PDV (Virus del nanismo del susino) PNRSV (Virus della maculatura anulare necrotica dei Prunus) 1870 130: 122 pos. a PDV; 8 pos. a PNRSV Puglia prov. di: - Foggia - Bari - Brindisi - Lecce - Taranto 8 2 3 1 2 ortive: pomodoro; altre ortive 300 di pomodoro (corrispondenti a circa 25 milioni di piante); 200 di altre ortive (corrispondenti a circa 10 milioni di piante CMV (Virus del mosaico del cetriolo), PVX (virus X della patata) PVY (virus Y della patata) TMV (Virus del mosaico del tabacco) TYLCV (Virus dell accartocciamento fogliare giallo del pomodoro) AMV (Virus del mosaico dell erba medica) TSWV (Virus dell avvizzimento maculato del pomodoro) CeMV (Virus del mosaico del sedano) LeMV (Virus del mosaico della lattuga) WMV2 (Virus del mosaico 2 dell anguria) ZYMV (Virus del mosaico giallo dello zucchino) PMMV (Virus del mosaico lieve del peperone) CGMV (Virus del maculatura verde del cetriolo). 490 10: 6 pos. a TSWV 4 pos. a CMV
Allegato 1. Fac-simile di contratto
Allegato 2. Norme tecniche ed obblighi previsti per il vivaista I fornitori di fruttiferi, si impegnano: - ad adeguare le strutture, gli impianti, i campi delle fonti iniziali, i vivai ed i semenzai a quanto previsto dal protocollo tecnico dei punti critici del processo produttivo; - ad indicare le fonti iniziali (piante), in impianti commerciali ubicati in aree esenti da focolai da agenti da quarantena (tristezza e mal secco per gli agrumi; fuoco batterico per le pomacee; sharka per le drupacee) dichiarate esenti dal Servizio Fitosanitario Regionale, e che abbiano superato la fase giovanile ed in particolare abbiano un'età minima indicata a seconda della specie. I fornitori di piantine di ortive si impegnano: - ad osservare tutte le norme tecniche e gli obblighi di adeguamento previste per l accreditamento pena il mancato rilascio del certificato da parte del Centro; - consentire al personale tecnico del Centro l accesso agli impianti e agli appositi registri o moduli in cui saranno annotati relativamente alle piantine da sottoporre ai saggi, i dati relativi all origine delle sementi, e al calendario dei trattamenti effettuati; - controfirmare apposito che attesta l avvenuto prelievo dei campioni secondo i criteri previsti.
Allegato 3. Fac-simile di certificato rilasciato dal laboratorio
Allegato 4. Tecniche di diagnosi adottate dal laboratorio accreditato del C.R.S.A. Virus: - diagnosi sierologica : ELISA - diagnosi molecolare: - ibridazione molecolare - amplificazione genica - estrazione ed analisi in dsrna In associazione a rilievi sintomatologici e saggi biologici su piante indicatrici Funghi: - isolamento e allevamento su idonei substrati colturali Batteri: - isolamento e allevamento su idonei substrati colturali Nematodi: - setacciamento, decantazione ed osservazione al microscopio ottico. Allegato 5. Campionamento e saggi Fruttiferi Nei periodi stabiliti, le piante indicate dal vivaista vengono sottoposte a rilievi sintomatologici per verificare l'assenza di malattie e dei patogeni specifici (insetti, acari, batteri, funghi) e, quindi, ad analisi di laboratorio indispensabili per i virus. Si preleva un campione di materiale vegetale per ogni fonte iniziale (costituito da rami e/o foglie prelevati da quattro punti della pianta). Il campione, inserito in busta numerata per l'identificazione dello stesso, viene conservato in una borsa frigo e trasportato al laboratorio, ove sarà sottoposto ad analisi specifiche a seconda della specie da saggiare: ELISA (fig. 2) per la diagnosi di virus degli agrumi (CTV, CPV, CVV), e delle drupacee (PPV, PDV, PNRSV, ACLSV); ibridazione molecolare per la diagnosi dei viroidi degli agrumi (CEVd e CcaVd), PCR, ibridazione molecolare e dsrna per la diagnosi di virus dell'olivo; trasmissione meccanica e/o per innesto per l'identificazione di infezioni degli agrumi e delle drupacee. Ortive Sulla base al ciclo produttivo, tecnici con specifiche competenze programmano con il vivaista il numero di campionamenti da effettuare. Il campionamento è condotto nel seguente modo: da tutti i lotti in allevamento si prelevano campioni di foglie dalle piantine da sottoporre al saggio di laboratorio per i più importanti virus contemplati nel D.M. per ciascuna specie. Un campione, costituito da 12-15 subcampioni (porzioni di foglie), è prelevato in modo tecnicamente e statisticamente attendibile, ogni 100 mila piantine o frazione. La raccolta dei subcampioni dai bancali viene eseguita con un attrezzo telescopico che permette il loro prelievo fino alla distanza di quattro metri dall'operatore. I subcampioni, inseriti in una bustina, appositamente numerata per l'identificazione, devono essere conservati in borsa frigo fino al trasporto in laboratorio. La diagnosi sarà effettuata e mediante ibridazione molecolare (Fig. 3) o attraverso trasmissione meccanica su piante spie.
Caricamento campioni su piastra ELISA Spot su membrana di nylon+ di un campione di ortive Lettura risultati Rilevazione positivi Figura 2. Fasi di diagnosi immunoenzimatica (ELISA) Figura 3. Fasi di diagnosi molecolare (ibridazione molecolare)