Uptake e accumulo di nanoparticelle a base di acido poli(lattico-co-glicolico) in Vitis vinifera e fitopatogeni fungini (Botrytis cinerea; Aspergillus spp.)
Vitis vinifera e l attacco da patogeni fungini Botrytis cinerea Aspergillus spp. Fumonisina B1 Ocratossina A
Metodi tradizionali: i pesticidi Ossidazione Fotossidazione Biodegradazione Lisciviazione Inquinamento acqua Inquinamento suolo Regolamento 1107/2009 da Gennaio 2014
Nanobiotecnologia Somministrazione di pesticidi attraverso nanovettori Pesticida Nanoparticella
Nanocapsule polimeriche Lume Rivestimento Carico 10-1000 nm
Nanocapsule polimeriche PLGA: Acido poli(lattico-co-glicolico) 460 nm 500 nm
Dimensioni Metodo osmotico 600 nm 200 nm 1.5 μm 200 nm 30 nm Metodo microfluidico 1.5 μm 200 nm Misura del potenziale Z: carica superficiale negativa
PLGA NPs in sistemi vegetali e fungini Le PLGA NPs sono in grado di attraversare la parete e la membrana cellulare??? Cellula vegetale Cellula fungina Cellula animale Schrade et al. 2013; Macromolecular Bioscience
PLGA NPs in Vitis vinifera PLGA NPs con cumarina-6 Cellule in sospensione Analisi a fluorescenza Analisi TEM 15 mg l -1 3 gr cellule/ 20 ml B5N Localizzazione subcellulare Meccanismo d internalizzazione Uptake cellulare
Risultati: parte 1 Uptake cellulare
Localizzazione subcellulare Citoplasma Nucleo Vacuolo Siti d accumulo delle PLGA NPs: CITOPLASMA NUCLEO Risultati: parte 1
Localizzazione subcellulare PLGA NPs adese alla parete PLGA NP attraversa la parete Accumulo di PLGA NPs al livello citoplasmatico Risultati: parte 1
Uptake cellulare Parete cellulare: selezione dimensione dipendente 600-30 nm 50 nm Risultati: parte 1
Meccanismo d internalizzazione FM4-64 + 10 μl 15 mg l -1 Risultati: parte 1
Risultati: parte 1 Meccanismo d internalizzazione
Meccanismo d internalizzazione Ikarugamicina 10 μm >30 min Bandmann et al. 2012 FEBS Letters 586:3626-3632 Wortmannina 30 μm >30 min Anieto & Robinson 2005 Protoplasma 226:3-11 Acido salicilico 10 μm >30 min Du et al. 2013 PNAS 110:7946-7951 Risultati: parte 1
PLGA NPs in piante di Vitis vinifera V. vinifera in vitro Analisi a fluorescenza
Assorbimento fogliare Incubazione con 2.5 mg l -1 PLGA NPs 1-5 min 5-15 min Segnale intenso: tricomi non ghiandolari Segnale intenso: pareti ventrali stomi 1-2 ore Parenchima palizzata Camera sottostomatica Risultati: parte 2
Assorbimento radicale Osservazione a 1-3 ore Incubazione con 2.5 mg l -1 PLGA NPs Segnale intenso: peli radicali Osservazione a 48 ore Segnale debole: strati 1-2 cilindro corticale Segnale intenso: strati 3-4 cilindro corticale Segnale intenso: cilindro vascolare Risultati: parte 2
Trasporto Controllo Osservazione a 48 ore Xilema RADICE xilema FOGLIA Risultati: parte 2
PLGA NPs in funghi fitopatogeni Botrytis cinerea Aspergillus niger Aspergillus carbonarius Sospensione fungina Analisi a fluorescenza
Uptake in cellule fungine Incubazione con 15 mg l -1 PLGA NPs Aspergillus niger Botrytis cinerea Osservazione a 1-5 minuti: Segnale intenso in corpi sferici di aspetto vescicolare Aspergillus carbonarius Risultati: parte 3
Ruolo della carica superficiale Guscio in PLGA: carica superficiale NEGATIVA Guscio in PLGA e sottile strato di chitosano: carica superficiale NEUTRA Guscio in PLGA e spesso strato di chitosano: carica superficiale POSITIVA Risultati: parte 4
Conclusioni PLGA NPs attraversano la parete e la membrana delle cellule vegetali (Vitis vinifera) e fungine (Botrytis cinerea; Aspergillus spp.) in relazione alla carica superficiale delle particelle PLGA NPs non attraversano il tonoplasto, accumulandosi al livello citoplasmatico ma non vacuolare, suggerendo come meccanismo d internalizzazione le vie di endocitosi PLGA NPs sono potenzialmente in grado di attraversare i tessuti di plantule di V. vinifera propagate in vitro
GRAZIE PER L ATTENZIONE