Parassitologia (modulo 5CFU)

Corso di Laurea Magistrale in Scienze Biologiche Indirizzo Diagnostica molecolare Anno Accademico 2018/19 METODOLOGIE EPIDEMIOLOGICHE e PARASSITOLOGICHE e Laboratorio Parassitologia (modulo 5CFU) Prof. Anna Scandurra 1 Università degli Studi di Napoli Federico II

2 Phylum Platyhelminthes Il nome deriva dal greco e significa verme piatto. Sono acelomati, triblastici, di dimensioni piuttosto variabili (microscopici o lunghi anche 15 m), con cefalizzazione e simmetria bilaterale. Attuano un metabolismo anaerobio e gli scambi gassossi avvengono attraverso la superficie corporea. La loro fonte di nutrimento è rappresentata da piccoli invertebrati, tessuti animali in decomposizione o liquidi/tessuti dell ospite. Hanno un apparato digerente privo di ano (hanno una cavità gastrovascolare con un apertura orale che termina in rami ciechi) o mancano dell apparato digerente. In questo caso la presenza di microtrichi (minuscole estroflessioni dei villi) aumentano la superficie assorbente favorendo l assorbimento dei nutrienti.

3 Phylum Platyhelminthes Il sistema escretore è costituito da protonefridi con cellule a fiamma. Tali cellule sono alla base di tubuli ciechi e spingono i liquidi verso la parte distale grazie alle loro ciglia, creando così una pressione negativa che fa entrare i liquidi interstiziali. Successivamente, i liquidi fuoriescono grazie ai nefridiopori. Il tessuto connettivale spugnoso (parenchima) è rivestito da un sacco muscolo-cutaneo all interno del quale il citoplasma è sinciziale (è una massa continua). La muscolatura di tipo liscio si organizza in modo circolare, dorsoventrale e longitudinale. Il sistema nervoso consiste di una coppia di gangli cerebrali che partono anteriormente e da cui si dipartono fibre e commessure trasversali.

4 Phylum Platyhelminthes Fasciola sp. Tenia sp. Gli organismi rappresentativi sono le fasciole, le tenie, gli schistosomi e le planarie. Il phylum si divide in 3 classi: Turbellaria forme a vita libera (Planaria sp., Dugesia sp.) Trematoda forme parassite (Schistosoma sp., Fasciola sp.) Cestoidea forme parassite (Tenia sp., Echinococcus sp.) Schistosomi sp. Planaria sp.

5 Trematodi Sono organismi dall aspetto fogliaceo, con caratteristiche ventose che sono implicate nei meccanismi di adesione all ospite. La classe si divide Schistosomi sp. in due sottoclassi in relazione al loro ciclo biologico: Monogenea parassiti a ciclo diretto, normalmente classificati come parassiti esterni dei pesci Digenea parassiti a ciclo indiretto che necessitano di ospiti intermedi vertebrati Fasciola sp.

6 Classificazione Phylum Platyhelminthes Classe Trematoda Ordine Strigeatida Echinostomatida Plagiorchiida

7 Trematodi I digenei, o distomi, sono endoparassiti che si localizzano nel tratto alimentare e nel sistema vascolare. Le loro dimensioni possono raggiungere pochi centimetri e il loro tegumento può essere talvolta munito di spine. Sono muniti di una ventosa ventrale e di una orale dalla quale si dipartono faringe e intestino. Quest ultimo può essere diviso in due rami a fondo cieco semplici (Opistorchis sp.) oppure in più ramificazioni (Fasciola sp.). Sostanze a basso peso molecolare sono assorbite tramite il tegumento, mentre quelle ad alto peso sono digerite dall intestino. Sono organismi ermafroditi, ad eccezione degli schistosomi.

Trematodi 8 Alternano una riproduzione sessuata da adulti con una asessuata da larve. Posso riprodursi con fecondazione incronciata o autofecondazione. Il cirro rappresenta un pene primitivo ed è contenuto all interno di una tasca in cui è presente la vescicola seminale e in cui sboccano i due dotti deferenti derivanti da due testicoli. Gli spermatozoi escono dal cirro e si dirigono verso il receptaculum seminis, una vescicola collegata all apparato femminile. Ci arrivano attraversando l utero e l ootipo. É presente un solo ovaio da cui si diparte l ovidotto che termina con l ootipo. Qui il secreto prodotto dalle ghiandole vitellogene circonda l uovo e si forma il guscio. Nel passaggio verso l utero, il guscio di indurisce e l uovo è espulso attraverso un foro genitale, presente a livello della ventosa ventrale.

9 Trematodi Le uova opercolate sono espulse all esterno dell ospite con modalità differenti a seconda della specie. Nell uovo l embrione matura formando il miracidio, una larva ciliata che viene attivata dalla luce. Con l apertura dell opercolo la larva può uscire dal guscio velocemente. Le ciglia permettono alla larva di muoversi in acqua e, grazie a stimoli chemiotattici, di essere attratta dall ospite intermedio. Una volta fissatosi al piede del gasteropode, il miracidio produce un enzima litico che gli permette di penetrare i tessuti dell ospite. Qui perde le ciglia e diventa una sporociste ricca di cellule germinative. In alcuni trematodi, le cellule germinative diventano redie.

10 Trematodi Le redie sono larve con una ventosa orale, un primitivo intestino e poche cellule a fiamma. Dalle redie si sviluppano le cercarie, parassiti con una coda lunga, che escono dall ospite intermedio. Nel caso delle redie di specie come Fasciola, le cercarie si muovono nell acqua e diventano metacercarie, perdendo la loro cosa e incistandosi. Possono sopravvivere anche diversi anni nell ambiente. In seguito all ingestione da parte dell ospite definitivo, le cisti si rompono e il parassita può entrare nella parete intestinale e raggiungere diverse localizzazioni per diventare adulto.

11 Classificazione Phylum Platyhelminthes Classe Trematoda Ordine Strigeatida Famiglia Schistosomatidae Genere Schistosoma

12 Genere Schistosoma Sono circa una ventina le specie parassite dei mammiferi che possono, anche occasionalmente, parassitare l uomo. La schistomatosi è considerata la seconda malattia tropicale più diffusa dopo la malaria. La patologia si può manifestare a livello sintomatologico come schistomatosi intestinale o urinaria a seconda della specie parassita. Le specie maggiormente implicate nella parassitosi umana sono 4: S. mansoni ha uova con spina laterale e causa schistomatosi intestinale S. japonicum, S. mekongi le uova hanno una spina sub-terminale e causano una forma grave di schistomatosi intestinale S. haematobium ha uova con spina terminale e causa schistomatosi urinaria S. intercalatum ha uova con spina terminale e causa problemi intestinali

13 Classificazione Phylum Platyhelminthes Classe Trematoda Ordine Strigeatida Famiglia Schistosomatidae Genere Schistosoma Specie Schistosoma mansoni

14 Schistosoma mansoni La struttura del maschio adulto consiste di un tegumento tubercolato, con forma piatta e affilata alle due estremità. Sono lunghi in media 10 mm e hanno un apertura boccale che si apre a livello della ventosa orale in posizione anteriore; in questa specie l intestino è cieco. Al di sotto della ventosa ventrale, si apre il poro genitale e sono presenti dai 7 ai 9 testicoli. La femmina alberga nel canale ginecoforo ed è qui che viene rilasciato lo sperma. Il dimorfismo sessuale si manifesta con una femmina più sottile, lunga circa 15 mm che si localizza all interno del canale formato dal maschio.

15 Schistosoma mansoni Le uova mature sono liberate con le feci e sono riconoscibili al microscopio per il loro aspetto brunastro, di dimensioni variabili tra i 115 e 175 µm, con un peculiare sperone laterale allungato. In acqua possono sopravvivere diversi giorni, fino a quando non vengono attivate dalla luce e si rompono. Sono necessarie temperature tra i 25 e i 30 C perché ciò avvenga.

Schistosoma mansoni 16 Ciclo biologico 1. Le uova sono rilasciate nell ambiente esterno dall ospite definitivo tramite le feci (o le urine nelle altre specie). 2. In specifiche condizioni ambientali, le uova si schiudono nell acqua e il miracidio fuoriesce all esterno. 3. Grazie alle ciglia di cui è provvisto, il miracidio si muove velocemente nell acqua, senza nutrirsi, con il solo scopo di incontrare l ospite intermedio. Può sopravvivere per poche ore, presenta un fototropismo positivo (e geotropismo negativo)e viene fortemente attratto da segnali biochimici prodotti dal muco dell ospite intermedio. Grazie alla produzione di enzimi litici e a movimenti specifici, il miracidio penetra nell ospite e perde le ciglia.

Schistosoma mansoni 17 Ciclo biologico 4. Nel mollusco maturano le sporocisti e le cellule germinali contenute in esse danno vita ad un numero variabile (da 200 a 5. Dopo circa un mese dall ingresso nell ospite, le cercarie escono dal mollusco. Questo può sopravvivere ed essere infestato, oppure può morire in seguito ai danni riportati dal parassita (possono dipendere da diversi ceppi della stessa specie) 400) di sporocisti figlie nell arco di un paio di settimane. Si spostano nell epatopancreas dell ospite e possono continuare a produrre sporocisti oppure dare vita ad un gran numero di cercarie.

Schistosoma mansoni 18 Ciclo biologico 5. Le cercarie libere di giorno si muovono in acqua tiepida verso la superficie, con movimenti a zigzag. 6. Sostanze presenti sulla pelle dell ospite definitivo attirano attivamente le cercarie, così da permetterne l adesione e la successiva penetrazione attraverso la pelle. Ciò avviene grazie a specifici enzimi litici e movimenti del parassita. 7. Durante il loro ingresso, le cercarie perdono la coda e diventano schistosomuli.

Schistosoma mansoni 19 Ciclo biologico 8. In circa 1-2 giorni lo schistosomulo si riveste di glicolipidi e altre molecole dell ospite, così da coprire i propri antigeni e sfuggire alla risposta immunitaria. Dopo diverse ore nel derma, il parassita entra nel flusso sanguigno. Arrivato ai polmoni, raddoppia di volume per poi continuare a spostarsi. 9. Arrivato nel fegato, il parassita completa il suo ciclo e in circa 30 giorni raggiunge lo stadio adulto. I parassiti che non raggiungono il fegato non possono completare la fase di maturazione. 10. I parassiti adulti femmina si introducono nel canale ginecoforo del maschio. In questa fase, gli adulti si rivestono degli antigeni dell ospite.

Schistosoma mansoni 20 Ciclo biologico 10. Le coppie migrano nella vena mesenterica inferiore, del colon e del retto (A-B; C: plesso venoso vescicale). Qui le femmine depongono circa 400 uova al giorno che si organizzano in colonne nei capillari. Sono passati circa 50 giorni dall ingresso del parassita. Si formano pseudotubercoli che maturano nei tessuti, fino a quando l azione dello sperone e di enzimi litici permettono alle uova di cadere nel lume intestinale e fuoriuscire con le feci. Solo il 50% delle uova riesce a superare il lume dell intestino, mentre il restante viene bloccato dalla risposta immunitaria con formazione di granulomi nelle pareti intestinali.

Schistosoma mansoni 21 Ciclo biologico

Schistosoma mansoni 22

23 Classificazione Phylum Platyhelminthes Classe Trematoda Ordine Strigeatida Famiglia Schistosomatidae Genere Schistosoma Specie Schistosoma japonicum

24 Schistosoma japonicum I maschi sono lunghi circa 20 mm (le femmine 26 mm). Il loro ciclo vitale è simile a quello di S. mansoni, ma il parassita può penetrare anche stando nel fango o sulle rive delle risaie. Le uova mature, più piccole di dimensioni rispetto a S. mansoni, hanno forma ovale e hanno uno sperone rudimentale localizzato a livello subterminale, non facile da visualizzare. Ogni femmina produce circa 3500 uova al giorno, di cui la maggior parte resta bloccata nell intestino o nel fegato. Il parassita è endemico nelle Filippine e in Cina.

25 Genere Schistosoma Spesso le persone non mostrano una specifica sintomatologia. Si parla di febbre di Katayama per indicare la fase acuta della malattia, maggiormente presente nei bambini. Questa è dovuta al sistema immunitario che riconosce l antigene SEA durante la deposizione delle uova. La sintomatologia prevede asma, febbre, manifestazioni a livello della pelle, diarrea e malessere. Nel caso in cui la parassitosi sia provocata da S. japonicum, questa fase può manifestarsi in forma grave e portare alla morte. I problemi per l ospite sono legati alla formazione di processi granulomatosi intorno ad ognuna delle numerose uova, dovuti all azione di macrofagi, eosinofili e linfociti e messi in atto quando le uova attraversano i tessuti.

26 Genere Schistosoma Schistomatosi intestinale: In seguito alla presenza delle uova a livello dell intestino e del fegato, si formano fibromi che possono evolvere a cirrosi (fibrosi di Symmers). Tipicamente si possono riscontrare dolori addominali e feci molli con presenza di muco e sangue. Al tatto la milza e il fegato sono ingrossati, così come altri organi specialmente nelle aree iperdendemiche per S. japonicum. Possono esserci anche problematiche legate al funzionamento del Sistema Nervoso Centrale con la comparsa di convulsioni, o a livello dei polmoni. La diagnosi può essere effettuato osservando la presenza delle uova nelle feci attraverso il metodo di diafanizzazione (tecnica che prevede decolorazione e disidratazione del campione) di Kato-Katz, il quale permette una stima quantitativa delle uova.

27 Genere Schistosoma Schistomatosi urinaria: la tipica sintomatologia è la presenza di sangue nelle urine (ematuria), legata al rilascio delle uova. Nella fase finale della malattia si osserva la calcificazione della vescica. Per osservare la presenza delle uova nelle urine bisogna concentrarle attraverso centrifugazione, così da poter avere una stima quantitativa attraverso il conteggio nel sedimento o tramite filtrazione. La presenza di sangue nelle urine può essere considerato un fattore diagnostico specialmente, nei bambini. In generale, possono essere utilizzati anche test seriologici, ma presentano bassa sensibilità e specificità. Per studi di tipo epidemiologico, sono risultati utili questionari e kit per la rilevazione del sangue nelle urine diffusi tra le popolazioni a rischio.

28 Genere Schistosoma La terapia farmacologica è possibile e molto efficace. Esposti al farmaco, i parassiti si staccano dai vasi in seguito a contrazioni del corpo e sono lisati. Il paziente può provare dei minimi effetti collaterali legati all assunzione del farmaco, ma normalmente non presentano problemi rilevanti. Può essere consigliata anche la terapia antibiotica nel caso della schistomatosi urinaria al fine di combattere eventuali infezioni batteriche che possono sopraggiungere durante la malattia. Nel caso di formazioni fibrotiche molto estese, si consiglia la risoluzione chirurgica.

29 Genere Schistosoma La prevenzione si attua attraverso l uso controllato di molluschicidi dove possibile, il controllo delle acque di uso pubblico, la pulizia dei canali d irrigazione, un adeguata educazione sanitaria (riconoscere i sintomi, evitare di bagnarsi in luoghi a rischio, evitare di diffondere feci e urine in laghi o fiumi) e il trattamento preventivo dell intera popolazione in aree in cui il numero di casi supera il 50% della popolazione. Sono stati ideati dei vaccini basati principalmente sulla proteina Sm28 che è in grado di ridurre la fertilità del parassita nell uomo, ma non è idonea a proteggere da successive infestazioni.

30 Classificazione Phylum Platyhelminthes Classe Trematoda Ordine Echinostomatida Famiglia Fasciolidae Genere Fasciola Specie Fasciola hepatica

31 Fasciola hepatica Il parassita è appiattito a livello dorso-ventrale, ha forma ovale ed è lungo circa 30 mm. A livello della parte cefalica si trova una ventosa orale, mentre sulla parte ventrale c è una ventosa ventrale. È dotato di un apparato digerente ramificato, un apparato escretore e di una cuticola con spine di chitina. Sono ermafroditi sufficienti e presentano organi maschili e femminili. Il parassita è chiamato anche distoma (per la presenza delle due ventose) e la patologia legata alla parassitosi è la distomatosi epatica.

Fasciola hepatica 32 Ciclo biologico 1. Le uova presentano sono opercolate, hanno un aspetto brunastro e sono ricche di vitellogeno. Con le feci sono espulse dalle 5.000 alle 50.000 uova al giorno. 2. Le uova sono riversate in acqua e maturano in un paio di settimane in condizioni di temperatura ideali a circa 24 C. 3. Una volta maturato, il miracidio esce dall opercolo dell uovo e comincia la ricerca dell ospite intermedio, coadiuvato dalle ciglia nel movimento.

Fasciola hepatica 33 Ciclo biologico 4. Il miracidio penetra attivamente nel mollusco (genere Limnea) attraverso il piede e, raggiunto l epatopancreas, si trasforma in sporocisti (4a). In essa si formano numerose redie (4b)che, in seguito a specifiche condizioni, diventano cercarie (4c). Un miracidio può date origine a circa 600 cercarie. 5. Dopo due mesi, le cercarie escono dal mollusco e con la loro struttura a coda si muovono per raggiungere la superficie dei vegetali. Qui perdono la coda, si incistano e diventano metacercarie.

Fasciola hepatica 34 Ciclo biologico 6. In questa forma, le metacercarie possono sopravvivere anche più di un anno. Quando vengono ingerite da un erbivoro o dall uomo, arrivano nell intestino tenue. 7. A livello del duodeno le metacercarie si aprono, attraversano la parete dell intestino e migrano verso il fegato. In questa fase il parassita, chiamato adolescaria, si nutre del parechima e provoca lesioni gravi. 8. In circa 60 giorni, il parassita adulto raggiunge i dotti biliari. Grazie alla loro ventosa ventrale, si legano ai tessuti e si nutrono di sangue grazie alla ventosa orale. Creano ulcere emorragiche a livello locale. Raggiunta la maturità sessuale, vengono prodotte le uova che sono escono tramite le feci.

Fasciola hepatica 35 Ciclo biologico

36 Fasciola hepatica A causa della sua diffusione nei prati e nei pascoli ricchi di acqua, il parassita ha una diffusione cosmopolita. Ad essere colpiti sono specialmente i ruminanti, ma accidentalmente il parassita può essere ingerito e svilupparsi in tutti i mammiferi. In Italia attualmente è presente in molti pascoli, soprattutto nella pianura padana. Il parassita può sopravvivere nell ospite umano anche per un decennio. I sintomi non sono patognomici (epatomegalia, febbre, dolori addominali). I problemi legati alle lesioni a carico del fegato sono provocati dall azione delle adolescarie. I metodi diagnostici possono basarsi su tecniche immunologiche, confermate dalla ricerca delle uova opercolate nelle feci, ma questo esame richiede più di due mesi dall inizio dell infezione e deve essere ripetuto nel tempo perché le uova sono depositate ad intervalli discontinui.

37 Classificazione Phylum Platyhelminthes Phylum Platyhelminthes Classe Trematoda Classe Trematoda Ordine Opisthorchiidae Ordine Opisthorchiidae Famiglia Opisthorchiidae Famiglia Opisthorchiidae Genere Opisthorchis Genere Clonorchis Specie Opisthorchis felineus Specie Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini

Ciclo biologico 38

39 Classificazione Phylum Platyhelminthes Classe Cestoda Ordine Pseudophyllidea Cyclophyllidea

40 Cestodi A questa classe appartengono solo parassiti in cui manca un tubo digerente e la alimentazione avviene grazie ad uno specifico tegumento. Il corpo è appiattito dorsoventralmente e prende il nome di strobilo (sottoclasse Eucestoda). Lo scolice non presenta segmenti ed è seguito da un collo allungato da cui si originano nuovi segmenti che danno vita al resto del corpo e sono chiamati proglottidi. In questo caso non si parla di metameria perchè i segmenti non sono uguali. La sottoclasse Cestodaria presenta una struttura molto più semplice. Per poter aderire all ospite, lo scolice presenta organi diversi a seconda della specie (ventose circolari, botridi, uncini).

41 Cestodi Il numero delle proglottidi varia a seconda della specie. Man mano che vengono prodotte nuove proglottidi, quelle più vecchie si staccano. I parassiti sono ricoperti di un tegumento sinciziale in cui sono presenti microvilli. A livello delle proglottidi sono presenti fibre muscolari con decorso longitudinale, obliquo e circolare. Da un plesso cefalico si dipartono due cordoni longitudinali che percorrono le proglottidi, formando delle commissure all interno. I protonefridi costituiscono l apparato escretore con dotti ecretori longitudinali che percorrono il corpo e sfociano a livello dell ultima proglottide. Non hanno un apparato circolatorio e digerente.

42 Cestodi Sono anaerobi, necessitano delle vitamine B e di ormoni sessuali presenti nell ospite. Attuano il metabolismo dello zucchero e soprattutto del glicogeno. Presentano entrambi gli apparati genitali in quanto ermafroditi. Questi sono ripetuti in ogni proglottide e ognuna di esse produce uova in maniera indipendente. Le uova sono formate da una cellula uovo e da cellule vitelline che la nutrono. Il tutto è circondato da un embrioforo e da un guscio. Nei cestodi pseudofillidei c è un poro uterino, le uova sono rilasciate direttamente all esterno e maturano in acqua. Nei cestodi ciclofillidei non c è un poro quindi le uova mature si accumulano nella proglottide fino a farla rompere.

43 Cestodi Il primo stadio larvale è detto larva esacanta (dalle 3 paia di uncini). La larva dei pseudofillidei è chiamata coracidio ed è ricoperta di ciglia. Dopo maturazione in acqua, l uovo si rompe e libera il coracidio. Questo viene ingerito da piccoli crostacei che fungono da ospiti intermedi. Nei ciclofillidei, invece, l embrioforo è spesso e il coracidio esce dall uovo solo in seguito ad ingestione. Sono per lo più parassiti eteroxeni.

44 Classificazione Phylum Platyhelminthes Classe Cestoda Ordine Famiglia Genere Specie Pseudophyllidea Diphyllobothriidae Diphyllobothriium Diphyllobothriium latum

45 Genere Diphyllobotrium Le proglottidi sono acraspedote (non si sovrappongono), lo scolice ha 2 solchi lunghi detti botrii ed è piuttosto appiattito in D. latum. L intero strobilo in questa specie può arrivare anche a 10 m. Le dimensioni possono variare in base all ospite. L utero è una struttura tubulare ripiegata che si apre verso il poro centrale. I follicoli dei testicoli e del vitellogeno sono sparsi nella proglottide, tranne che nelle zone di giunzione.

Genere Diphyllobotrium 46 Ciclo biologico 1. Le uova non embrionate sono rilasciate nelle feci dall ospite definitivo. 2. In due settimane si sviluppa un embrione provvisto di ciglia chiamato coracidio, contenuto nell oncosfera. 3. A temperature ideali di circa 19 C, il coracidio esce dalle uova e deve essere ingerito da un crostaceo entro 12 ore. 4. Attraverso l intestino, il coracidio arriva nella cavità celomatica del copepode e in un paio di settimane diventa procercoide.

Genere Diphyllobotrium 47 Ciclo biologico 5. Il copepode è ingerito da un pesce d acqua dolce e la larva procercoide evolve in plerocercode (o spargano). 6. Pesci più grandi contraggono l infezione nutrendosi di pesci più piccoli infetti: la larva perfora l intestino e si reincapsula. 7. L uomo mangia pesce crudo o poco cotto. 8. Nell intestino i plerocercoidi, estroflettendo lo scolice, si attaccano alla mucosa e diventando cestodi adulti. Successivamente, depongono le uova.

Genere Diphyllobotrium 48 Ciclo biologico

49 Genere Diphyllobotrium Alcuni dei pesci che possono ospitare D. latum sono il luccio, il pesce persico e la trota comune. L infezione può essere contratta anche mangiando uova o gonadi non cotte. Individui appartenenti alla specie sono stati ritrovati anche nel Lago Maggiore, il Lago d Iseo e il Lago di Como. L infezione è mantenuta da un solo parassita per ospite. I primi sintomi si possono avvertire dopo un paio di settimane dall infezione e si manifestano come perdita dell appetito, nausea, vomito, anoressia, aumento della sensazione di fame, anemia (assorbimento della vitamina B12).

50 Genere Diphyllobotrium Il malessere è causato dalla degenerazione delle proglottidi e dalle tossine prodotte dal parassita. La diagnosi si può effettuare con la ricerca delle uova nelle feci, ma senza identificazione della specie. Per questo si possono raccogliere eventuali proglottidi rilasciate spontaneamente dall ospite. Il trattamento farmacologico è possibile e porta all espulsione di tutto il parassita. É importante che sia rilasciato anche lo scolice, altrimenti il soggetto può tornare ad essere positivo alla parassitosi dopo la terapia farmacologica. La prevenzione prevede la cottura (a 50 C per 10 minuti i plerocercoidi vengono distrutti) o il congelamento del pesce, con appositi controlli soprattutto per i pesci destinati al commercio alimentare.