PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody

PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody 790-2991 05278368001 50 INDICAZIONI E USO Finalità d'uso Questo anticorpo è indicato per uso diagnostico in vitro. PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (PATHWAY HER2 (4B5)) di Ventana Medical Systems, Inc. (Ventana) è un anticorpo monoclonale di coniglio indicato per uso in laboratorio per il rilevamento semi-quantitativo dell'antigene HER2 in sezioni di tessuti normali e neoplastici che sono fissati in formalina e inclusi in paraffina su un dispositivo automatico di colorazione di vetrini immunocitochimici VENTANA. È indicato come un ausilio nella valutazione delle pazienti con carcinoma mammario per le quali è considerato il trattamento con Herceptin. Nota: tutte le pazienti negli studi clinici con Herceptin sono state selezionate utilizzando una sperimentazione clinica. Nessuna delle pazienti in questi studi è stata selezionata utilizzando PATHWAY anti-her-2/neu (4B5). PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) è stato confrontato con PATHWAY HER-2 (clone CB11) Primary Antibody su una serie di campioni indipendenti e i risultati sono risultati concordanti in maniera accettabile. L effettiva correlazione fra PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) e i risultati clinici non è stata stabilita. Il VIAS Image Analysis System è un sistema computerizzato di analisi delle immagini aggiuntivo e opzionale, funzionalmente collegato a un microscopio interattivo. È indicato per l'uso come ausilio al patologo nel rilevamento, nella classificazione e nel conteggio di cellule di interesse basate sull'intensità del marker, sulle dimensioni e sulla forma, utilizzando controlli adeguati per garantire la validità dei punteggi VIAS. Sommario e spiegazione PATHWAY anti-her-2/neu è un anticorpo monoclonale di coniglio (clone 4B5) che agisce contro il dominio interno dell'oncoproteina c-erbb-2 (HER2). L'oncoproteina c-erbb-2 è stata clonata e caratterizzata da Akiyama et al nel 1986. 1 È una glicoproteina transmembrana con peso molecolare di circa 185 kd che è strutturalmente simile al recettore del fattore di crescita epidermica (EGFR). La proteina è associata all'attività della tirosinchinasi, simile a quella di diversi recettori del fattore di crescita epidermica e a quella delle proteine che si trasformano della famiglia src. La sequenza di codifica è coerente con un dominio di legame extracellulare e un dominio della chinasi intracellulare. Ciò indica che HER2 può essere coinvolto nella trasduzione del segnale e nella stimolazione dell'attività mitogenica. 1 È stato dimostrato mediante gli esperimenti di Western blot che il clone 4B5 reagisce con una proteina di peso molecolare 185 kd da lisati cellulari SK-BR-3. SK-BR-3 è una linea cellulare di carcinoma mammario che ha un'espressione maggiore di 128 volte rispetto a HER2 mrna. 2 Le dimensioni della banda identificata sono in giusta correlazione con quelle riportate da Akiyama et al per la proteina HER2 (con peso molecolare 185 kd). 1 È stata utilizzata l'immunoistochimica per rilevare antigeni specifici in cellule o tessuto dal 1950. 3 L'utilizzo di enzimi e perossidasi come marker per l'immunoistochimica è stato registrato da Nakane e Pierce nel 1967. 4 L'aumentata sensibilità del sistema di rilevamento biotina-avidina-perossidasi rispetto al metodo degli anticorpi marcati con enzima è stato documentato da Hsu et al nel 1981. 5 La proteina HER2 è espressa a un livello rilevabile dall'immunoistochimica fino al 20% degli adenocarcinomi da vari siti. Fra il 15 e il 30% dei tumori duttali invasivi sono positivi per l'her2. 6 Quasi tutti i casi di malattia di Paget della mammella 7 e fino al 90% dei casi di carcinoma duttale in situ di tipo comedo sono positivi. 6 Il rilevamento immunoistochimico di iperespressione della proteina HER2 è anche utilizzato come ausilio nella determinazione di pazienti per i quali è indicata la terapia con Herceptin. 8 I risultati di colorazione nei tessuti normali, nei tessuti neoplastici e in 322 casi di carcinoma mammario con PATHWAY HER2 (4B5) sono stati valutati da Ventana. Nei tessuti normali testati, l'espressione è stata coerente con la letteratura pubblicata per il fatto che non si è verificata una colorazione inaspettata specifica del citoplasma/della membrana, con le seguenti eccezioni: due casi di tonsille con colorazione della membrana delle cellule epiteliali, un caso di paratiroide e un caso di epitelio esofageo. Tra i tessuti neoplastici testati, la colorazione del citoplasma/della membrana si è verificata nelle cellule cancerose del seno, del colon e delle ovaie. Trecentoventidue (322) carcinomi mammari sono stati valutati con VENTANA PATHWAY HER2 (4B5) in uno studio comparativo dei metodi con PATHWAY HER-2 (CB11). Esiste una correlazione significativa della colorazione tra questi due test. Consultare la sezione Sintesi dei risultati previsti per ulteriori informazioni. Per ulteriori informazioni su PATHWAY HER2 (4B5), consultare la sezione Riferimenti 25-31. VENTANA PATHWAY HER2 (4B5) in combinazione con il VENTANA iview DAB Detection Kit, utilizza anticorpi secondari biotinati per individuare l'anticorpo primario legato PATHWAY HER2 (4B5) (prodotto utilizzando un peptide sintetico corrispondente a un sito sul dominio interno della proteina HER2). Ciò è seguito dal legame di un complesso avidina/streptavidina-enzima alla biotina. Il complesso viene quindi visualizzato utilizzando un prodotto generato da enzima precipitato. L'utilizzo di VENTANA pre-diluito PATHWAY HER2 (4B5) e di iview DAB Detection Kit e ultraview Universal DAB Detection Kit pronti all'uso, in combinazione con un coloratore di vetrini automatico VENTANA, riduce la possibilità di errori umani e la variabilità intrinseca risultante dalla diluizione del reagente singolo, dal pipettamento manuale e dall'applicazione del reagente manuale. SIGNIFICATO CLINICO Il carcinoma mammario è il carcinoma più diffuso nelle donne e la seconda causa principale di decesso legato al cancro. Nel Nord America, la possibilità per una donna di contrarre un carcinoma mammario è una su otto. 9 Un rilevamento precoce, insieme a terapie di trattamento adeguate, può influenzare in modo significativo la sopravvivenza complessiva. 10 Piccoli campioni di tessuti possono essere facilmente utilizzati nell'immunoistochimica di routine (IHC), rendendo questa tecnica, in combinazione con anticorpi che rilevano antigeni importanti per l'interpretazione del carcinoma, uno strumento efficace per il patologo nella diagnosi e prognosi della malattia. Un marker importante nel carcinoma mammario oggi è l'oncoproteina c-erbb-2 (HER2). L'HER2 è una proteina di membrana intracellulare rilevata nella membrana cellulare. 11 È strettamente legata all'egfr e, come l'egfr, ha un'attività di tirosinchinasi. 1 L'amplificazione del gene e la corrispondente iperespressione del c-erbb-2 è stata rilevata in diversi tumori, inclusi i carcinomi mammari. 11,12 È stato dimostrato che il farmaco terapeutico Herceptin ha dei benefici per alcune pazienti con carcinoma mammario perché lo arresta e in alcuni casi inverte la crescita del tumore. 8 Il farmaco è un anticorpo monoclonale umanizzato che si lega alla proteina HER2 su cellule cancerose. Pertanto, solo le pazienti con carcinomi mammari positivi all'her-2/neu possono avere benefici dal trattamento con Herceptin. La diagnostica in vitro per la determinazione dello stato dell'her2 nei carcinomi mammari è importante per aiutare il medico a determinare la terapia con Herceptin. L'interpretazione dei risultati di qualsiasi sistema di rilevamento per l'her2 deve prendere in considerazione il fatto che l'her2 è espressa sia nei carcinomi mammari sia nei tessuti sani, sebbene in livelli diversi e con diverse modalità di espressione. 13 Le preparazioni di tessuto istologico hanno il vantaggio della morfologia del tessuto intatto per aiutare l'interpretazione della positività dell'her2 del campione. Tutti i test istologici devono essere interpretati da uno specialista nella morfologia del carcinoma mammario e/o della patologia, e i risultati devono essere integrati da studi morfologici e controlli appropriati e utilizzati in combinazione con altri dati clinici e di laboratorio. Principi e procedure PATHWAY HER2 (4B5) è un anticorpo monoclonale di coniglio che si lega all'her2 in sezioni di tessuto incluse in paraffina. L'anticorpo specifico può essere localizzato da una formulazione dell'anticorpo secondario coniugato con biotina che riconosce le immunoglobuline di coniglio seguite dall'aggiunta di un complesso di streptavidinaperossidasi di rafano (HRP) (iview DAB Detection Kit) o un complesso secondario anticorpo-hrp (ultraview Universal DAB Detection Kit). Il complesso specifico anticorpoenzima viene quindi visualizzato con un prodotto di reazione con enzima precipitato. Ciascun ciclo viene incubato per un tempo e a una temperatura precisi. Al termine di ciascuna fase di incubazione, le sezioni vengono lavate nel coloratore di vetrini automatico VENTANA per fermare la reazione in modo da rimuovere il materiale non legato che sarebbe da ostacolo alla reazione desiderata nelle fasi successive. Si applica anche Liquid Coverslip, che minimizza l'evaporazione di reagenti acquosi dal vetrino del campione. Devono essere valutati dei casi clinici nel contesto dell'esecuzione dei controlli appropriati. Ventana consiglia l'inclusione di un controllo dei tessuti positivo fissato ed elaborato allo stesso modo del campione del paziente (ad esempio, un carcinoma mammario debolmente positivo). Oltre alla colorazione con PATHWAY HER2 (4B5), è necessario colorare un secondo vetrino con CONFIRM Negative Control Rabbit Ig. Perché il test 2012-03-16 1 / 12 14427IT Rev F

possa essere considerato valido, il tessuto di controllo positivo deve presentare una colorazione della membrana delle cellule tumorali. Queste componenti devono essere negative quando colorate con CONFIRM Negative Control Rabbit Ig. Inoltre, si consiglia di includere un vetrino di controllo del tessuto negativo (ad esempio, un carcinoma mammario negativo HER-2/neu) per qualsiasi gruppo di campioni trattato e analizzato sul coloratore di vetrini automatico VENTANA. Questo controllo del tessuto negativo deve essere colorato con PATHWAY HER2 (4B5) per garantire che il miglioramento antigenico e le altre procedure pretrattamento non abbiano creato una colorazione falsa-positiva. Il VIAS è un dispositivo a immagini istologico interattivo che esegue l'elaborazione delle immagini utilizzando un microscopio, una videocamera digitale a colori, un computer e un software per l'analisi delle immagini per acquisire e analizzare le immagini selezionate dall'utente sui vetrini colorati PATHWAY HER-2/neu (4B5). Il dispositivo è progettato per aiutare il patologo nell'analisi, fornendo un input semiquantitativo per integrare l'interpretazione qualitativa del patologo dei vetrini PATHWAY HER-2/neu (4B5). Il patologo esegue la solita lettura manuale dei vetrini HER-2/neu per valutare l'espressione dell'her-2/neu indicata su una scala (0,1+,2+,3+) per il vetrino utilizzando il microscopio VIAS. Il patologo ha quindi l'opportunità di selezionare più campi di visualizzazione utilizzando il microscopio VIAS e il computer per l'analisi semiquantitativa. Il dispositivo VIAS elabora le immagini a colori selezionate dall'utente per valutare l'espressione dell'her-2/neu utilizzando un algoritmo del software per aiutare la lettura qualitativa del patologo. Il patologo emette una diagnosi finale in base alle informazioni sia semi-quantitative sia qualitative. Si consiglia per questa applicazione del VIAS che l'utente segua le istruzioni appropriate nel foglietto illustrativo del prodotto VENTANA PATHWAY HER-2/neu (4B5) e nella guida dei punteggi associata. Per ulteriori informazioni, consultare il manuale di istruzioni di Ventana Image Analysis System (VIAS). MATERIALI E METODI Reagenti forniti Catalogo n. 790-2991: PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) Primary Antibody contiene una quantità di reagente sufficiente per 50 test. Un erogatore da 5 ml PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) Primary Antibody contiene circa 30 µg di un anticorpo monoclonale ricombinante di coniglio che agisce contro l'antigene umano c-erbb-2. L'anticorpo è diluito in 0,05 M di soluzione salina tamponata tris, 0,01 M EDTA, 0,05% Brij-35 con 0,3% di proteina vettore e 0,05% di sodio azide, un conservante. È presente una traccia di siero di feto di vitello, circa lo 0,25%, dalla soluzione madre. La concentrazione proteica totale del reagente è di circa 16 mg/ml. La concentrazione di anticorpi specifica è di circa 6 µg/ml. PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) Primary Antibody è un IgG di coniglio diluito da supernatanti per colture tissutali. Il prodotto non presenta alcun tipo di reattività non rilevante nota degli anticorpi. Ricostituzione, miscelazione, diluizione, titolazione Questo anticorpo è ottimizzato per l'uso su un coloratore automatico di vetrini VENTANA, in combinazione con VENTANA iview DAB e compatibile con l'ultraview Universal DAB Detection Kit. Non è necessaria alcuna ricostituzione, miscelazione, diluizione o titolazione. Un'ulteriore diluizione può ridurre la colorazione dell'antigene. L'utente deve convalidare qualunque modifica di questo genere. Le differenze che esistono tra i laboratori (relativamente alla modalità di trattamento del tessuto o di esecuzione delle procedure tecniche) possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli periodici (fare riferimento alla sezione Procedure sul controllo della qualità). Materiali e reagenti necessari ma non forniti I reagenti e materiali seguenti possono essere necessari per la colorazione ma non sono forniti: 1. CONFIRM Negative Control Rabbit Ig (N. cat. 760-1029) (controllo negativo del reagente) 2. Vetrini per microscopio, Superfrost Plus [VWR N. cat. 48311-703 o equivalente] 3. Controlli dei tessuti positivi e negativi (carcinoma mammario invasivo e tessuto mammario normale) 4. Etichette con codici a barre (adeguate per il controllo negativo del reagente e l'anticorpo primario analizzato) 5. Vaschette o bagni di colorazione 6. Piattini di colorazione Tissue-Tek 7. Timer in grado di segnalare intervalli di 2-10 minuti 8. Xilene (per istologia) 9. Etanolo o alcol reagente (per istologia) 100% di soluzione: etanolo non diluito o alcol reagente 95% di soluzione: miscelare 95 parti di etanolo o alcol reagente con 5 parti di acqua deionizzata 80% di soluzione: miscelare 80 parti di etanolo o alcol reagente con 20 parti di acqua deionizzata 10. Acqua deionizzata o distillata 11. Biocare Medical s Decloaking Chamber (N. cat. DC2002) (coloratori di vetrini automatici NexES IHC) 12. Coloratori di vetrini automatici NexES IHC, BenchMark Series 13. iview DAB Detection Kit (N. cat.760-091) o ultraview Universal DAB Detection Kit (N. cat. 760-500) 14. Endogenous Biotin Blocking Kit (N. cat. 760-050) 15. APK Wash (10X)* (N. cat. 250-042) (coloratori di vetrini automatici NexES IHC) 16. Liquid Coverslip (Low Temperature) (N. cat. 250-009) (coloratori di vetrini automatici NexES IHC) 17. EZ Prep (10X)* (N. cat. 950-102) (coloratori di vetrini automatici BenchMark Series) 18. Reaction Buffer (10X)* (N. cat. 950-300) (coloratori di vetrini automatici BenchMark Series) 19. Liquid Coverslip (High Temperature) (N. cat. 650-010) (coloratori di vetrini automatici BenchMark Series) 20. Cell Conditioning 1 (Pre-dilute) (CC1) (N. cat. 950-124) 21. Colorante di contrasto Hematoxylin II (N. cat. 790-2208) 22. Bluing Reagent (N. cat. 760-2037) 23. Montante permanente (Permount, Fisher N. cat. SP15-500 o equivalente) 24. Coprioggetto (sufficiente per coprire il tessuto, come VWR N. cat. 48393-60 o equivalente) 25. Montavetrini automatico (come il montavetrino automatico Tissue-Tek SCA). 26. Garze assorbenti (se si esegue lo smascheramento manuale dell'antigene) 27. Microscopio ottico (20-80X) o Ventana Image Analysis System (VIAS).* * Se richiesto per applicazioni specifiche. Conservazione e manipolazione Conservare a 2-8 C. Non congelare. L'utente dovrà convalidare le condizioni di conservazione diverse da quanto indicato nel foglietto illustrativo. PATHWAY HER2 (4B5) dovrà essere lasciato per almeno 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Per garantire una dispensazione adeguata di reagente e la stabilità dell anticorpo dopo ciascun uso, riposizionare il tappo e riporre immediatamente l erogatore in frigorifero in posizione verticale. Ogni erogatore di anticorpi è provvisto di data di scadenza. Se conservato adeguatamente, il reagente mantiene la sua stabilità fino alla data indicata sull etichetta. Non utilizzare il reagente oltre la data di scadenza prevista per il metodo di conservazione prescritto. Il prodotto è stato progettato per avere una datazione di 18 mesi dopo la data di produzione. Non vi sono segni evidenti che indichino l'instabilità di questo prodotto. Pertanto, è consigliabile eseguire contemporaneamente controlli positivi e negativi sui campioni da testare. Se vi sono segni di instabilità del reagente, rivolgersi immediatamente al rappresentante di assistenza locale. Prelievo dei campioni e preparazione per l analisi Tessuti inclusi in paraffina e fissati in formalina che sono stati sottoposti a miglioramento antigenico sono adatti per essere utilizzati con PATHWAY HER2 (4B5) quando usati con Kit di Rilevamento VENTANA e un coloratore di vetrini automatico VENTANA (vedere Materiali e reagenti necessari ma non forniti). Il fissativo consigliato è formalina neutra tamponata al 10%. La quantità utilizzata è di 15-20 volte il volume del tessuto. Nessun fissativo penetrerà più di 2-3 mm nel tessuto solido o 5 mm nel tessuto poroso in un periodo di 24 ore. Una sezione di 3 mm o più piccola di tessuto deve essere fissata per non meno di 4 ore e non oltre 8 ore. Il fissaggio può essere eseguito a una temperatura ambiente (15-25 C). 14 I tessuti fissati e inclusi correttamente che esprimono l'antigene rimangono stabili per almeno 2 anni se conservati in un luogo fresco (15-25 C). Il Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA) del 1988, 42CFR493.1259(b), stabilisce che "il laboratorio deve conservare i vetrini colorati per almeno dieci anni dalla data dell'analisi e i blocchi di campioni per almeno due anni dalla data dell'analisi". 2012-03-16 2 / 12 14427IT Rev F

Sezioni di circa 5 m di spessore devono essere tagliate e sollevate sui vetrini. I vetrini devono essere Superfrost Plus o equivalenti. Il tessuto deve essere asciugato all'aria posizionando i vetrini a temperatura ambiente di notte. 14 Gli studi presso Ventana indicano che il tessuto tagliato asciugato all'aria e le sezioni di linee cellulari conservate a 2-8 C sono stabili per almeno 6 mesi. Ciascun laboratorio dovrà validare la stabilità dei tessuti tagliati e applicati sui vetrini per determinare le procedure e le condizioni di conservazione più appropriate. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Questo anticorpo è indicato per uso diagnostico in vitro. 2. Adottare le necessarie precauzioni durante la manipolazione dei reagenti. Utilizzare guanti monouso quando si maneggia materiale sospetto cancerogeno o tossico (ad esempio: xilene o formaldeide). Non usare in prossimità di fiamme vive. 3. Non fumare, mangiare o bere in aree in cui si maneggiano campioni o reagenti. 4. Evitare il contatto dei reagenti con gli occhi e le mucose. Se i reagenti vengono a contatto con aree sensibili, lavare con abbondante acqua corrente. 5. I campioni di pazienti e tutti i materiali a contatto con essi devono essere maneggiati come materiale biologicamente pericoloso e smaltiti con le precauzioni adeguate. Non pipettare mai con la bocca. 6. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti, poiché ciò potrebbe dar luogo a risultati non corretti. 7. Tempi di incubazione e temperature diversi da quelli indicati possono dar luogo a risultati errati. È necessario che l'utente convalidi qualunque modifica di questo genere. 8. I reagenti sono stati diluiti in modo ottimale e un'ulteriore diluizione può causare la perdita di colorazione dell'antigene. È necessario che l'utente convalidi qualunque modifica di questo genere. 9. Se utilizzato secondo le istruzioni, questo prodotto non è classificato come sostanza pericolosa. Il conservante nel reagente è la sodio azide. Tra i sintomi di una sovraesposizione alla sodio azide vi sono l'irritazione alla pelle e agli occhi e l'irritazione di membrane mucose e delle vie respiratorie superiori. La concentrazione di sodio azide in questo prodotto è lo 0,05% e non soddisfa i criteri OSHA per le sostanze pericolose. È possibile che la formazione di NaN 3 reagisca con il piombo e il rame delle tubazioni fino a formare azidi metalliche altamente esplosive. Durante lo smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l'eventuale accumulo di azide. 15 In individui sensibili sono possibili reazioni allergiche sistemiche. 10. Consultare le autorità locali o statali in relazione al metodo di smaltimento consigliato. 11. Per ulteriori informazioni sulla sicurezza, consultare la Scheda Dati di Sicurezza del prodotto e la Guida alle Frasi di Rischio situata all'indirizzo www.ventana.com. ISTRUZIONI PER L'USO Procedura passo-passo Gli anticorpi primari VENTANA sono stati sviluppati per l'uso in coloratori automatici di vetrini VENTANA, in combinazione con i Kit di Rilevamento e gli accessori VENTANA. I protocolli di colorazione consigliati per coloratori automatici di vetrini sono elencati di seguito nella Tabella 1 e nella Tabella 2. È possibile visualizzare i parametri per le procedure automatiche, stamparli e modificarli conformemente alla procedura descritta nel manuale di istruzioni. Alcuni parametri dei coloratori automatici di vetrini sono stati predefiniti in fabbrica. Tabella 1. Protocolli di colorazione raccomandati per PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) con l'iview DAB Detection Kit. Tipo di procedura Strumenti BenchMark e BenchMark XT Piattaforma o metodo BenchMark ULTRA Cottura Nessuna Nessuna Sparaffinatura Selezionata Selezionata Condizionamento delle cellule (smascheramento dell antigene) Cell Conditioning 1, standard ULTRA CC1, leggero Enzima (proteasi) Nessuno necessario Nessuno necessario Anticorpo (primario) Blocco A/B (bloccaggio della biotina) Colorazione di contrasto (ematossilina) Postcontrocolorazione 32 minuti circa, 37 C 24 minuti circa, 36 C Richiesto Hematoxylin II, 4 minuti Bluing, 4 minuti Richiesto Hematoxylin II, 4 minuti Bluing, 4 minuti Tabella 2. Protocolli di colorazione raccomandati per PATHWAY anti-her-2/neu (4B5) con l'ultraview Universal DAB Detection Kit. Tipo di procedura BenchMark XT Piattaforma o metodo BenchMark ULTRA Cottura Nessuna Nessuna Sparaffinatura Selezionata Selezionata Condizionamento delle cellule (smascheramento dell antigene) Enzima (proteasi) Anticorpo (primario) Cell Conditioning 1, leggero Nessuno necessario 16 minuti circa, 37 C ULTRA CC1, leggero Nessuno necessario 12 minuti circa, 36 C Colorazione di contrasto (ematossilina) Hematoxylin II, 4 minuti Hematoxylin II, 4 minuti Post-controcolorazione Bluing, 4 minuti Bluing, 4 minuti Le procedure per la colorazione sui coloratori di vetrini automatici VENTANA sono le seguenti. Per istruzioni più dettagliate e ulteriori informazioni sugli ulteriori protocolli disponibili, consultare il manuale d'istruzioni. Coloratori automatici di vetrini BenchMark Series 1. Applicare al vetrino l'etichetta con codice a barre che corrisponde al protocollo dell'anticorpo da eseguire. 2. Caricare sul carosello l'anticorpo principale, gli erogatori appropriati per il kit di rilevamento e i reagenti accessori necessari e mettere il carosello sul coloratore automatico di vetrini. Controllare i liquidi di carico e i rifiuti. 3. Caricare i vetrini sul coloratore automatico di vetrini. 4. Avviare la fase di colorazione. 5. Al termine del ciclo, rimuovere i vetrini dal coloratore automatico di vetrini. 2012-03-16 3 / 12 14427IT Rev F

6. Lavare con un detergente neutro per rimuovere la soluzione Coverslip. 7. Deidratare, pulire e coprire i vetrini con montanti fissi nel modo consueto. 8. I vetrini colorati devono essere letti entro due o tre giorni dalla colorazione e rimangono stabili per almeno due anni se conservati in modo adeguato a temperatura ambiente (da 15 a 25 C). Procedure di controllo qualità Controlli dei sistemi di linee cellulari Ventana fornisce a parte quattro controlli di linee cellulari fissati in formalina e inclusi in paraffina, sezionati e posizionati su un singolo vetrino caricato (catalogo n. 781-2991). PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides può essere utile per una convalida preliminare del metodo di elaborazione utilizzato per i vetrini di colorazione con PATHWAY HER2 (4B5). Questi quattro controlli di linee cellulari sono caratterizzati da ibridizzazione in situ per numero di copie geniche. Se elaborate e colorate in modo adeguato, le linee cellulari devono colorarsi come descritto nella Tabella 4. Se la colorazione indicata non è evidente nei nuclei adeguati, specialmente i controlli 1+ e 2+, è necessario ripetere la colorazione dei tessuti. Tabella 3. Caratteristiche dei PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides. Punteggio IHC HER2 Linea cellulare Rapporto HER2/Chr17* 0 MDA-MB-231 1,11 1+ T47D 1,12 2+ MDA-MB-453 2,66 3+ BT-474 5,53 * Il rapporto HER2/Chr17 è una media di tre lotti di PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides determinati utilizzando l ibridizzazione in situ per fluorescenza (FISH) Controllo del tessuto positivo Un tessuto di controllo positivo fissato ed elaborato allo stesso modo dei campioni del paziente deve essere eseguito per ciascun gruppo di condizioni di test e con qualsiasi procedura di colorazione PATHWAY HER2 eseguita. Il tessuto può contenere componenti cellule-tessuti con colorazione sia positiva sia negativa, e serve come tessuto di controllo sia positivo sia negativo. Il tessuto di controllo dovrebbe provenire da un'autopsia recente, da una biopsia o da campioni chirurgici preparati o fissati il prima possibile, in modo identico alle sezioni da testare. Tale tessuto potrebbe consentire di controllare tutte le fasi dell'analisi, dalla preparazione del tessuto fino alla colorazione. L'uso di una sezione di tessuto fissata o analizzata diversamente dai campioni da testare fornisce un controllo per tutti i reagenti e le fasi del metodo, eccetto la fissazione e la preparazione del tessuto. Un tessuto con colorazione positiva debole è più adatto di uno con colorazione positiva forte per un controllo della qualità ottimale e per rilevare livelli minori di degradazione del reagente. Idealmente deve essere selezionato un tessuto che è noto per avere una colorazione debole ma positiva per garantire che il sistema sia sensibile a piccoli quantitativi di degradazione del reagente o a problemi con la metodologia IHC. Solitamente, tuttavia, un tessuto neoplastico che è positivo per l'her-2/neu è fortemente positivo a causa della natura della patologia (iperespressione). Un esempio di un controllo positivo per PATHWAY HER2 (4B5) è un carcinoma mammario invasivo positivo debole all'her-2/neu (ad esempio duttale o lobulare). I componenti del tessuto con colorazione positiva (membrana citoplasmatica delle cellule neoplastiche) consentono di confermare che l'anticorpo è stato applicato e che lo strumento funziona correttamente. Un tessuto di carcinoma mammario invasivo positivo debole all'her-2/neu noto può contenere cellule o componenti di tessuto di colorazione sia positivi sia negativi e può servire come tessuto di controllo sia positivo sia negativo. Utilizzare i controlli positivi noti solo per monitorare le adeguate prestazioni dei tessuti trattati e dei reagenti del test, e non come aiuto per formulare una diagnosi specifica dei campioni del paziente. Controllo negativo del tessuto Lo stesso vetrino utilizzato per il controllo del tessuto positivo (carcinoma mammario invasivo duttale o lobulare) può essere utilizzato come controllo del tessuto negativo. I componenti che non si colorano (stroma circostante, cellule linfoidi e vasi sanguigni) devono dimostrare l'assenza di colorazione specifica e fornire un'indicazione della colorazione di fondo specifica con l'anticorpo primario. In alternativa, il tessuto mammario normale è un tessuto di controllo negativo adeguato. Utilizzare un tessuto noto per essere fissato, analizzato e incorporato in modo identico ai campioni della paziente, con ciascun ciclo di colorazione per verificare la specificità di PATHWAY HER2 (4B5) per dimostrazione dell'her-2/neu, e per fornire un'indicazione della colorazione di fondo specifica (colorazione falsa-positiva). Controllo negativo del reagente È necessario eseguire un controllo negativo del reagente per ciascun controllo per riuscire a interpretare meglio i risultati. Per valutare colorazioni non specifiche viene utilizzato un controllo negativo del reagente invece dell'anticorpo primario. Il vetrino va colorato con CONFIRM Negative Control Rabbit Ig. Il periodo di incubazione del controllo negativo del reagente deve essere uguale a quello dell'anticorpo primario Discrepanze inspiegabili Eventuali discrepanze inspiegabili nei controlli vanno riferite immediatamente al rappresentante di assistenza locale. Se i risultati del controllo di qualità non soddisfano le specifiche, i risultati della paziente non sono validi. Vedere la sezione Risoluzione dei problemi di questo inserto. In tal caso, è necessario identificare e correggere il problema e ripetere i campioni della paziente. Verifica del dosaggio Prima di utilizzare un anticorpo o un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, è necessario controllare la specificità dell'anticorpo effettuando l'analisi su una serie di tessuti con caratteristiche di prestazione immunoistochimiche note che rappresentano tessuti positivi e negativi noti (consultare le Procedure sul controllo della qualità precedentemente descritte in questa sezione nel foglietto illustrativo e le raccomandazioni per il controllo della qualità del College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, 15 o le linee guida approvate da CLSI 16 o entrambi i documenti). Ripetere queste procedure di controllo qualità per ciascun nuovo lotto di anticorpi o ogni volta che vengono modificati i parametri del dosaggio. I tessuti affetti da carcinoma mammario con stato HER2 noto sono adeguati per la verifica del dosaggio. Interpretazione dei risultati La procedura automatizzata di immunocolorazione VENTANA causa la precipitazione di un prodotto di reazione colorato di marrone (DAB) sui siti dell'antigene localizzati da PATHWAY HER2 (4B5). Un patologo qualificato con esperienza nelle procedure immunoistochimiche dovrà valutare i controlli e qualificare il prodotto colorato prima di interpretare i risultati. Controlli positivi Esaminare prima il controllo positivo del tessuto colorato per determinare se tutti i reagenti funzionano correttamente. La presenza di un prodotto di reazione con colorazione appropriata nella membrana delle cellule target indica una reattività positiva. A seconda della durata del periodo di incubazione e della potenza dell'ematossilina utilizzata, la controcolorazione darà luogo a una colorazione da azzurro chiaro a blu scuro nei nuclei delle cellule. Una controcolorazione eccessiva o incompleta può compromettere l'interpretazione corretta dei risultati. Se il controllo positivo del tessuto non si colora positivamente, i risultati con i campioni da esaminare non devono essere considerati validi. Controlli dei tessuti negativi Dopo il controllo positivo del tessuto, è necessario esaminare quello negativo per verificare la marcatura specifica dell'antigene target dall'anticorpo primario. L'assenza di colorazione specifica nel controllo negativo del tessuto conferma l'assenza di reattività crociata tra l'anticorpo e le cellule o i componenti cellulari. La colorazione del seno normale rappresenta un tessuto di controllo negativo adeguato. Gli elementi intatti stromali e duttali non devono mostrare nessuna colorazione intensa nella membrana, ad indicare che la colorazione non è avvenuta. Se il tessuto ha una colorazione di contrasto, può esserci colorazione intorno all'esterno della cellula, ossia negli spazi interstiziali. Se si nota una colorazione specifica nel controllo negativo del tessuto, i risultati con i campioni del paziente non devono essere considerati validi. Controlli negativi del reagente La colorazione non specifica, se presente, sarà diffusa. Sporadicamente è possibile osservare anche una lieve colorazione del tessuto connettivo nelle sezioni tissutali sottoposte a una fissazione in formalina eccessiva. Per l interpretazione dei risultati della colorazione, prendere in considerazione cellule intatte, poiché spesso le cellule necrotiche o degradate assumono una colorazione aspecifica. Tessuto della paziente I campioni della paziente devono essere esaminati per ultimi. L'intensità della colorazione positiva deve essere valutata tenendo conto di possibili colorazioni di fondo aspecifiche con il controllo negativo del reagente. Come in qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l'antigene in questione non è stato rilevato, non che l'antigene 2012-03-16 4 / 12 14427IT Rev F

è assente nelle cellule o nei tessuti esaminati. È necessario anche esaminare la morfologia di ciascun campione del tessuto utilizzando una sezione colorata con ematossilina ed eosina durante l'interpretazione dei risultati immunoistochimici. I risultati morfologici della paziente e i dati clinici pertinenti devono essere interpretati da un patologo qualificato. Un patologo qualificato con esperienza nelle procedure immunoistochimiche dovrà valutare i controlli positivi e negativi e qualificare il prodotto colorato prima di interpretare i risultati. Convenzioni di punteggio per l'interpretazione di PATHWAY HER2 (4B5) I carcinomi mammari che sono considerati positivi per la iperespressione della proteina HER-2 devono soddisfare i criteri limite per l'intensità della colorazione (2+ o superiore su una scala da 0 a 3+) e le cellule tumorali positive in percentuale (superiore al 10%). La colorazione deve inoltre localizzarsi sulla membrana cellulare. La colorazione citoplasmatica può sempre essere presente, ma questa colorazione non è inclusa nella determinazione della positività. Tre campi all'interno dell'area ben preservata e ben colorata del tessuto devono essere esaminati per quanto riguarda l'intensità della colorazione e la determinazione della completezza della colorazione della membrana citoplasmatica. La colorazione che circonda completamente la membrana circonda deve avere un punteggio di intensità pari a 2+ o 3+. Alla colorazione parziale della membrana va assegnato il punteggio "1+". Può rendersi necessario l'esame dei casi borderline con un ingrandimento 400X o superiore, per distinguere tra le intensità "1+" e "2+". A differenza dei casi a cui è stato assegnato un punteggio 3+ di intensità, la colorazione con punteggio 2+ è caratterizzata da un anello più nitido e chiaramente delineato, mentre i contorni dei casi 3+ sono molto spessi. Di seguito è riportato uno schema di riferimento rapido relativo ai criteri di colorazione. Fare riferimento alla Guida al calcolo del punteggio di VENTANA per una descrizione più dettagliata, arricchita da fotografie della colorazione con PATHWAY HER2 (4B5). Tabella 4. Criteri per l'intensità e il pattern della colorazione della membrana cellulare con PATHWAY HER2 (4B5). Pattern di colorazione Non è stata osservata alcuna colorazione della membrana Colorazione debole e parziale della membrana in proporzioni qualsiasi delle cellule tumorali Colorazione debole e completa della membrana, superiore al 10% delle cellule tumorali Colorazione intensa e completa della membrana, superiore al 10% delle cellule tumorali LIMITAZIONI Limitazioni generali Punteggio (segnalarlo al medico curante) Valutazione della colorazione HER2 0 Negativo 1+ Negativo 2+ Debolmente positivo 3+ Positivo 1. L'immunoistochimica è una procedura diagnostica in più fasi, che necessita di formazione specialistica nella scelta dei reagenti appropriati, nella selezione dei tessuti, nella fissazione, analisi, preparazione dei vetrini per immunoistochimica e nell'interpretazione dei risultati di colorazione. 2. La colorazione del tessuto dipende dalla manipolazione e dall'analisi del tessuto prima della colorazione. Una fissazione, un congelamento, uno scongelamento, un lavaggio, un asciugatura, un riscaldamento e un sezionamento inadeguati o la contaminazione con altri tessuti o fluidi può produrre artefatti, l'intrappolamento dell'anticorpo o risultati falso-negativi. Variazioni nella fissazione e nei metodi di inclusione o le irregolarità intrinseche del tessuto possono provocare risultati incoerenti. 3. Una controcolorazione eccessiva o incompleta può compromettere l'interpretazione corretta dei risultati. 4. L'interpretazione clinica di qualunque colorazione positiva o della sua assenza deve essere valutata nel contesto dell'anamnesi clinica, della morfologia e di altri criteri istopatologici. L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione o della sua assenza deve essere integrata con studi morfologici, controlli appropriati oltre che da altri test diagnostici. È responsabilità di un patologo qualificato acquisire familiarità con l'impiego degli anticorpi, dei reagenti e dei metodi utilizzati per interpretare la preparazione colorata. È necessario eseguire la colorazione in un laboratorio certificato e autorizzato, sotto la supervisione di un patologo responsabile della revisione dei vetrini colorati che garantisca l'adeguatezza dei controlli positivi e negativi. 5. Ventana fornisce anticorpi e reagenti a una diluizione ottimale per l'uso quando vengono rispettate le istruzioni. Qualsiasi deviazione dalle procedure di analisi raccomandate può compromettere i risultati previsti. È indispensabile utilizzare e documentare controlli appropriati. Gli utenti che modificano le procedure di analisi consigliate si devono assumere ogni responsabilità relativamente all 'interpretazione dei risultati. 6. Questo prodotto non è destinato all'uso nella citometria a flusso perché le caratteristiche delle prestazioni non sono state determinate. 7. I reagenti possono dare luogo a reazioni inattese in tessuti non testati precedentemente. La possibilità di reazioni inattese, anche in gruppi di tessuti già esaminati, non può essere completamente esclusa, a causa della variabilità biologica dell'espressione dell'antigene nei neoplasmi o in altri tessuti patologici. 17 Rivolgersi al rappresentante di assistenza locale in presenza di reazioni inattese documentate. 8. I tessuti di pazienti affetti dal virus dell'epatite B e che contengono l'antigene superficiale dell'epatite B (HBsAg) possono presentare una colorazione non specifica quando si utilizza la perossidasi di rafano. 18 9. I risultati falso-positivi possono essere identificati grazie al legame non immunologico delle proteine o ai prodotti di reazione del substrato. Questi risultati possono anche talvolta dipendere da un'attività di pseudo-perossidasi (eritrociti), da un'attività di perossidasi endogena (citocromo C) o dalla biotina endogena (ad es., fegato, cervello, mammella, reni) in funzione del tipo di immunostaining adottato. 19 10. Come in qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l'antigene non è stato rilevato, non che l'antigene era assente nelle cellule o nei tessuti esaminati. Limitazioni specifiche 1. L'anticorpo è stato ottimizzato come indicato nelle Tabelle 1 e 2 per le piattaforme VENTANA e le chimiche di rilevamento. A causa delle variazioni nella fissazione e nell'analisi dei tessuti, può essere necessario aumentare o ridurre il tempo di incubazione dell'anticorpo primario su determinati campioni. Per ulteriori informazioni sulle variabili di fissazione, fare riferimento a Immunohistochemistry Principles and Advances. 20 2. L'anticorpo, combinato agli accessori e ai kit di rilevamento VENTANA, rileva l'antigene che sopravvive al sezionamento, all'analisi e alla fissazione dei tessuti in formalina di routine. Gli utenti che modificano le procedure di analisi consigliate sono responsabili dell'interpretazione e della convalida dei risultati delle pazienti. 3. La specificità del midollo osseo non è stata testata. L'utente è tenuto a determinare la colorazione appropriata nei tessuti menzionati prima di procedere all'interpretazione delle informazioni sulla colorazione. SINTESI DEI RISULTATI PREVISTI Le prestazioni di PATHWAY HER2 (4B5) Primary Antibody sono state valutate grazie a studi di specificità, riproducibilità e studi metodologici comparativi. Se non diversamente specificato, tutte le colorazioni sono state eseguite utilizzando l'iview DAB Detection Kit elencato in precedenza su un coloratore di vetrini automatico Benchmark XT. 1. Specificità: la specificità di PATHWAY HER2 (4B5) è stata determinata tramite uno studio che non ha mostrato colorazione specifica della membrana per la maggior parte dei tessuti normali. Risultati della colorazione: ghiandola surrenale (0/3), mammella (0/3), cervelletto (0/3), cervello (0/3), cervice (0/3), colon (0/3), esofago (1/3), cuore (0/2), rene (0/3), fegato (0/3), polmone (0/3), cellule mesoteliali (0/3), ovaia (0/3), pancreas (0/3), ghiandola paratiroidea (1/3, colorazione focale della membrana), nervo periferico (1/3), ghiandola pituitaria (0/2), prostata (1/3), ghiandola salivare (0/3), muscolo scheletrico (0/3), cute (0/3), intestino tenue (0/3), milza (0/3), stomaco (0/3), testicolo (0/3), timo (0/2), tiroide (0/3), tonsilla (2/3 colorazione focale delle cellule epiteliali superficiali) e utero (0/3). La specificità di PATHWAY HER2 (4B5) è stata determinata inoltre tramite uno studio che non ha mostrato colorazione specifica della membrana per la maggior parte dei tessuti neoplastici. Risultati della colorazione: cancro alla mammella (1/4), carcinoide (0/2), cancro al colon (1/3), cancro epatocellulare (0/5), leiomioma (0/2), cancro ai polmoni (0/2), linfoma (0/3), melanoma (0/2), cancro alle ovaie (1/2), cancro al pancreas (0/3), cancro alla prostata (0/3), cancro alle cellule renali (0/5), sarcoma (0/2), cancro allo stomaco (0/3), cancro alla tiroide (0/3) e cancro non differenziato (0/1). 2012-03-16 5 / 12 14427IT Rev F

La colorazione positiva nell'epitelio tonsillare, esofageo, della prostata, del nervo periferico, della ghiandola paratiroidea, del cancro alla mammella, del colon, del cancro alle ovaie trovano riscontro negli studi pubblicati relativi all'espressione di HER-2/neu. 2. Sensibilità: la sensibilità dipende dalla conservazione dell'antigene. Qualsiasi operazione impropria di gestione dei tessuti durante la fissazione, il sezionamento, l'inclusione o la conservazione, che ne alteri l'antigenicità rende meno efficace il rilevamento della proteina HER-2/neu da parte di PATHWAY HER2 (4B5) e può dare origine a risultati falsi negativi. 3. La riproducibilità della colorazione all'interno dello stesso ciclo sulle piattaforme di coloratori NexES, BenchMark e BenchMark XT è stata determinata tramite la colorazione di tre vetrini, ciascuno di cinque tessuti di cancro alla mammella con un'espressione di HER-2 pari a 0, 1+, 2+ e 3+. Per ciascun caso, tre dei 3 vetrini sono stati colorati appropriatamente all'interno di un ciclo e per tutte le piattaforme di strumenti sottoposte a test. Gli utenti sono tenuti a verificare i risultati della riproducibilità all'interno dello stesso ciclo, mediante la colorazione di vari gruppi di sezioni seriali contenenti densità basse, medie ed elevate di antigeni in un solo ciclo. 4. La riproducibilità della colorazione tra un ciclo e l'altro e tra una piattaforma e l'altra è stata determinata tramite la colorazione di tre vetrini, ciascuno di cinque tessuti di cancro alla mammella con un'espressione di HER-2 pari a 0, 1+, 2+ e 3+ sui tre cicli di strumenti diversi sulle piattaforme di strumenti NexES, BenchMark e BenchMark XT. Per ciascun caso, nove dei 9 vetrini sono stati colorati appropriatamente durante i tre cicli dello strumento e su tutte le piattaforme di strumenti sottoposte a test. Gli utenti sono tenuti a verificare i risultati della riproducibilità tra un ciclo e l'altro, mediante la colorazione di vari gruppi di sezioni seriali contenenti una densità bassa, media ed elevata di antigene in giorni diversi. 5. Riproducibilità del punteggio tra un lettore e l'altro e della colorazione tra un laboratorio e l'altro con BenchMark XT: tre laboratori, appartenenti a tre diverse istituzioni degli Stati Uniti, hanno preso parte allo studio di riproducibilità tra un laboratorio e l'altro. I vetrini tagliati di 40 casi di carcinoma invasivo alla mammella fissati in tampone di formalina neutra [10 ciascuno da ciascuna categoria di binning di HER-2 (0-1+, 2+, 3+)] e sei (6) PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides sono stati spediti a ciascuno dei siti per la colorazione tramite un dispositivo per la colorazione automatica dei vetrini VENTANA BenchMark XT, adottando il protocollo di colorazione consigliato. I controlli hanno incluso PATHWAY HER-2 4 in 1 Control Slides e un secondo vetrino di ciascun caso, colorato con il reagente Ig negativo. In nessun sito si sono verificati cicli non validi in base alle prestazioni dei controlli. I risultati sono stati analizzati da Ventana. Trentaquattro vetrini su quaranta (34/40) hanno mostrato un'intensità simile della colorazione tra i siti di colorazione. Sei campioni (6/40 o il 15%) hanno mostrato una variazione che non ha superato 1 livello di intensità. Tre (3/6) campioni hanno mostrato una variazione tra 0 e 1+, considerati entrambi negativi. Due campioni (2/40 o il 5%) hanno mostrato una variazione tra 2+ e 3+, mentre un campione (1/40) ha mostrato una variazione tra 1+ e 2+. 6. BenchMark XT - Riproducibilità del punteggio tra un lettore e l'altro: in tutti i 40 casi (100%) almeno 2 patologi su 3 erano d'accordo. 7. La riproducibilità tra un lotto e l'altro è stata determinata tramite la colorazione automatica di 5 tessuti di cancro alla mammella con espressione di HER2 con punteggio pari a 0, 1+, 2+ e 3+ con 3 lotti di PATHWAY HER2 (4B5). Ai tessuti colorati è stato assegnato un punteggio su una scala tra 0 e 3+ tramite tre lettori idonei. La concordanza tra i lotti e i lettori era completa per i 3 vetrini e i 5 tessuti colorati. 8. Gli studi comparativi tra anticorpo monoclonale di coniglio PATHWAY HER2 (4B5) e anticorpo monoclonale murino PATHWAY HER-2 (CB11). Riepilogo degli studi eseguiti. È stato condotto uno studio metodologico comparativo per esaminare la correlazione tra PATHWAY HER2 (4B5) e PATHWAY HER-2 (CB11) e PathVysion Her-2 FISH, entrambi test diagnostici approvati dalla FDA. Allo studio hanno preso parte sei ricercatori. Due coorti indipendenti sono state valutate da due gruppi composti da tre ricercatori diversi (Coorte 1: n=144, Coorte 2: n=178) che hanno sfruttato casi noti di cancro alla mammella, colorati mediante HER-2 CB11 e HER2 4B5. I dati FISH sono stati ottenuti dall'anamnesi del paziente. Per ciascun caso è stato generato un punteggio di consenso tra i tre lettori per ciascun anticorpo, per ridurre la variabilità tra un lettore e l'altro, nota con il punteggio HER-2. 22, 23, 24 Sono stati valutati in totale 322 casi. I vetrini colorati con PATHWAY HER-2 (CB11) sono stati processati e colorati in conformità alle istruzioni del produttore, riportate nel foglietto illustrativo di VENTANA CB11. È trascorso in media circa un anno tra la colorazione e la lettura dei vetrini colorati CB11. Poiché i punteggi di uno dei sei lettori non rientravano nell'intervallo di confidenza, i dati delle due coorti sono stati presentati nel modo seguente. Riproducibilità tra un patologo e l'altro dei campioni dello studio comparativo Tabella 5. Coorte 1 - Punteggi IHC di consenso dei tre patologi. Punteggio CB11 Punteggio 4B5 3+ 2+ 0, 1+ Totale 3+ 29 24 5 58 2+ 2 13 17 32 0, 1+ 0 0 53 53 Totale 31 37 75 143 Coorte 1: caratteristiche delle prestazioni per la presentazione 3 x 3. La concordanza complessiva è pari a 29+13+53/143=66,4% (95% I.C. = 38,6%, 59,7%). Coorte 1: caratteristiche delle prestazioni per la presentazione 2 x 2 (positivo all'anticorpo HER-2 (2+ e 3+) e negativo (0+ e 1+) i punteggi sono stati combinati). La percentuale di concordanza positiva è pari a 29+2+24+13/31+37 =100% (95% I.C. = 97,5% - 100%). La percentuale di concordanza negativa è pari a 53/75 = 70,7% (95% I.C. = 58,5% - 80,1%). La concordanza complessiva è pari a 29+24+2+13+53/143=84,7% (95% I.C. = 78,2%, 90,0%). Tabella 6. Coorte 2 - Punteggi IHC di consenso dei tre patologi. Punteggio 4B5 Punteggio CB11 3+ 2+ 0, 1+ Totale 3+ 72 1 0 73 2+ 1 12 5 18 0, 1+ 0 7 80 87 Totale 73 20 85 178 Coorte 2: caratteristiche delle prestazioni per la presentazione 3 x 3. La concordanza complessiva è pari a 72+12+80/178=92,1% (95% I.C. = 80,1%, 93,1%). Coorte 2: caratteristiche delle prestazioni per la presentazione 2 x 2 (positivo all'anticorpo HER-2 (2+ e 3+) e negativo (0+ e 1+) i punteggi sono stati combinati). La percentuale di concordanza positiva è pari a 72+12+1+1/73+20 =92,5% (95% I.C. = 85,2% - 96,9%). La percentuale di concordanza negativa è pari a 80/85 = 94,1% (95% I.C. = 86,8% - 98,1%). La concordanza complessiva è pari a 72+12+1+1+80/178=93,3% (95% I.C. = 88,5% - 96,4%). Tabella 7. Coorte 1 - Punteggi di consenso IHC CB11 dei tre patologi rispetto a FISH. Punteggio CB11 Positivo Risultati FISH Negativo Totale 3+ 32 0 32 2+ 32 5 37 0, 1+ 22 53 75 Totale 86 58 144 Coorte 1: caratteristiche delle prestazioni per CB11 e FISH, presentazione 2 x 2 (in cui i punteggi 2 e 3 sono considerati positivi). La percentuale di concordanza positiva è pari a 32+32/ 86 = 74,4% (95% I.C. = 63,8% - 83,2%). La percentuale di concordanza negativa è pari a 53/58 = 91,4% (95% I.C. = 80,9% - 97,1%). La concordanza complessiva è pari a 32+32+53/144 = 81,2% (95% I.C. = 73,9% - 87,2%). 2012-03-16 6 / 12 14427IT Rev F