ZytoLight SPEC CMYC/CEN 8 Dual Color Probe

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1 ZytoLight SPEC CMYC/CEN 8 Dual Color Probe Z (0.2 ml) Per la rilevazione del gene umano CMYC e degli alfa-satelliti del cromosoma 8 mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH).... Dispositivo per uso diagnostico in vitro in base alle direttive EU 98/79/EC

2 Sonda polinucleotide marcata in fluorescenza per il rilevamento del gene umano CMYC e degli alfa-satelliti del centromero del cromosoma 8. Pronto all uso. Descrizione Prodotto: Contenuto: Prodotto: Specificità: Stabilità/Conservazione: Utilizzo: Sonda ZytoLight SPEC CMYC/CEN 8 Dual Color Probe (PL51) in tampone di ibridazione. La sonda contiene polinucleotidi coniugati con un fluorocromo verde (ZyGreen, analogo alla FITC, eccitazione a 503 nm ed emissione a 528 nm) che marcano il gene CMYC e polinucleotidi coniugati con un fluorocromo arancio (ZyOrange, analogo alla Rodamina, eccitazione a 547 nm ed emissione a 572 nm) che marcano gli alfasatelliti del cetromero del cromosoma 8. Z : 0.2 ml (20 reazioni considerando 10 μl di dispensazione per campione) La sonda ZytoLight SPEC CMYC/CEN 8 Dual Color Probe (PL51) è progettata per rilevare il gene CMYC e gli alfa-satelliti del cromosoma 8 in tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina, o apposizioni di cellule, tramite ibridazione in situ fluorescente. La sonda ZytoLight SPEC CMYC/CEN 8 Dual Color Probe (PL51) deve essere stoccata a -16/-22 C al buio ed è stabile fino alla data indicata sull etichetta. Questo prodotto è un dispositivo per uso diagnostico in vitro (in base alle direttive EU 98/79/EC). L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da personale qualificato tenendo conto degli altri dati

3 Precauzioni: clinici e patologici del paziente nel contesto dell'anamnesi clinica. Leggere il manuale d uso prima dell utilizzo! Non usare i reagenti dopo la data di scadenza riportata sull etichetta. Questo prodotto contiene sostanze (in piccoli volumi e piccole concentrazioni) dannose per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Prendere le appropriate misure protettive (guanti monouso, occhiali protettivi, abbigliamento da laboratorio). Se i reagenti vengono in contatto con la pelle lavare abbondantemente con acqua. Principio del Metodo: La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. La formazione del duplex (con sequenze del gene CMYC e con gli alfa satelliti del cromosoma 8 presenti nel campione) può essere visualizzata attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza con filtri appropriati

4 Istruzioni: Il pretrattamento (sparaffinatura, proteolisi, post fissazione) piuttosto che l allestimento del campione dovrebbero essere ottimizzati dall utilizzatore a seconda della natura del campione e dei propri bisogni. Denaturazione e ibridazione 1. Utilizzare 10µl di ZytoLight SPEC CMYC/CEN 8 Dual Color Probe (PL51) per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitare la formazione di bolle, coprire il campione con un vetrino copri oggetto (22 mm x 22 mm a seconda della dimensione del campione). Sigillare il vetrino copri oggetto con fixogum o con colla analoga. 3. Denaturare a 75 C (± 2 C) per 10 minuti utilizzando una piastra calda La temperatura di denaturazione può dipendere da vari fattori come la fissazione o l età del campione pertanto potrebbe essere necessaria l ottimizzazione di tale temperatura (73 C-77 C) 4. Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37 C in una stufa ventilata E importante che il campione (cellule o tessuto) non si asciughino durante l ibridazione E possibile condurre le fasi di denaturazione/ibridazione mediante l utilizzo di piastre a controllo automatico della temperatura come il ThermoBrite StatSpin.

5 Risultati Mediante l utilizzo di filtri appropriati, i segnali di ibridazione del gene CMYC appaiono verdi mentre i segnali di ibridazione degli alfa-satelliti del centromero del cromosoma 8 appaiono arancioni. In interfase, le cellule normali o le cellule senza aberrazioni del cromosoma 8 si distingueranno due segnali verde due segnali arancione distinti tra loro. In cellule con amplificazione genica si avrà un aumento dei segnali o la formazione di cluster di segnali. I polinucleotidi contenuti nella sonda ZytoLight SPEC CMYC/CEN 8 Dual Color Probe (PL51) che riconoscono le sequenze degli alfa-satelliti del centromero del cromosoma 8 fungono anche da controllo interno per certificare che l ibridazione è riuscita e dimostrano anche l integrità del DNA. Al fine di valutare la specificità del segnale, ogni ibridazione dovrebbe essere effettuata assieme a dei controlli. Si consiglia l utilizzo di almeno un campione in cui il numero di cromosomi 8 e geni CMYC sia noto. Particolare attenzione si deve prestare nella valutazione di cellule sovrapposte onde evitare falsi risultati tipo amplificazione del gene. A causa della de condensazione della cromatina, singoli segnali FISH possono apparire come piccoli cluster, comunque due o tre segnali della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di un segnale, devono essere considerati come un unico segnale.

6 Bibliografia Kievits T, et al. (1990) Cytogenet Cell Genet 53: Schraml P, et al. (1999) Clin Cancer Res 5: Taub R, et al. (1982) PNAS 79: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN Ultima versione: 1 Gennaio 2010 (4.5) Marchi di fabbrica: ZytoVision e ZytoLight sono marchi di fabbrica della ZytoVision

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