Kit di Implementazione per metodica FISH su campioni istologici e citologici

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1 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Kit di Implementazione per metodica FISH su campioni istologici e citologici Codice riassuntivo dei prodotti: Z PA (40 test: 20 campioni istologici e 20 campioni citologici) Contenuto del kit:. Descrizione Codice Quantità Kit di implementazione per campioni istologici Z Kit di implementazione per campioni citologici Z Mastice sigillante per l ibridazione E Vetrini porta oggetto a carica positiva 09-OPLUS 1 Vetrini coprioggetto 18 x 18 (piccoli, per ibridazione) Vetrini coprioggetto 24 x 24 (grandi, per ibridazione) Vetrini coprioggetto 24 x 40 (per montaggio DAPI) Revisione del 03/07/14 Pagina 1 di 1

2 ZytoLight FISH tissue implementation Kit Z Per metodiche di ibridazione in situ fluorescente (FISH) utilizzando qualsiasi sonda per FISH della ZytoVision.... Dispositivo per uso diagnostico in vitro in base alle direttive EU 98/79/EC

3 Ultima versione: 5 ottobre, 2009 (4.1) Marchi di fabbrica ZytoVision e ZytoLight sono marchi di ZytoVision GmbH.

4 Contenuto 1. Finalità d'uso Principio del metodo Informazioni su sicurezza e smaltimento Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit Componenti Conservazione e validità Campioni Materiale supplementare necessario Informazioni importanti Protocollo ZytoLight tissue implementation Kit Preparazione Pretrattamento (sparaffinatura/proteolisi) (1 giorno) Denaturazione e ibridazione (1 giorno) Post-ibridazione e rilevazione (2 giorno) Interpretazione dei risultati Bibliografia Problemi e possibili cause... 11

5 1. Finalità d'uso Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit è stato studiato per rilevare sequenze di DNA umano di tessuti inclusi in paraffina o cellule, fissati in formalina attraverso ibridazione in situ fluorescente (FISH) utilizzando una sonda per FISH ZytoVision. L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da un patologo qualificato tenendo conto degli altri dati clinici e patologici del paziente nel contesto dell'anamnesi clinica. 2. Principio del metodo La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit può essere usato con una qualsiasi sonda ZytoLight FISH venduta separatamente. La formazione del duplex con la sonda marcata con fluoro cromi può essere visualizzata attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza dotato degli adeguati filtri. 1

6 3. Informazioni su sicurezza e smaltimento Leggere attentamente le istruzioni prima dell'uso! Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza! Evitare contaminazioni incrociate e microbatteriche dei reagenti! Alcuni componenti del sistema contengono (a basse concentrazioni e volumi ridotti) sostanze nocive per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Adottare adeguate misure di sicurezza (utilizzo di guanti monouso, occhiali protettivi e indumenti da laboratorio)! In caso di contatto con i reagenti, risciacquare immediatamente la pelle con acqua corrente! Non mettere in bocca le pipette per le soluzioni! Smaltire i reagenti in base alle disposizioni locali! La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta per l'utilizzatore professionale! 2

7 4. Il ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit 4.1 Componenti Il kit comprende i seguenti componenti: Code Componenti Quantità Contenitore PT1 Tampone citrato per pretrattamento termico 500 ml Flacone con tappo a vite (grande) ES1 Pepsina 4 ml Flacone contagocce, tappo bianco WB1 Tampone di lavaggio SSC 500 ml Flacone con tappo a vite (grande) WB2 Tampone di lavaggio A, 25X 2x 50 ml Flacone con tappo a vite MT1 Dapi/antifade solution 0,8 ml Provetta con tappo blu Manuale d istruzioni 1 La sonda ZitoLight FISH non è compresa nel kit e deve essere acquistata separatamente. I componenti (ES1)e (MT1) sono sufficienti per 20 reazioni. I componenti (WB2) sono sufficienti per allestire 10 set di 3 vaschette di capacità di 80 ml. I componenti (PT1) e (WB1)sono sufficienti per allestire 6 vaschette da 80 ml. 4.2 Conservazione e validità I componenti del kit devono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2-8 C, eccetto il DAPI/Antifade solution (MT1) che deve essere conservata al buio a C; è possibile conservare il reagenti a 2-8 C per un breve periodo. Osservando tali condizioni di conservazione, è possibile utilizzare il kit almeno fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. 4.3 Campioni Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit è stato ottimizzato per l'utilizzo su cellule e tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina. L'impiego di materiale fissato o incluso diversamente (es. strisci di sangue o cellule fissate con metanolo-acido acetico glaciale) può richiedere modifiche del protocollo da parte dell'utilizzatore. I nostri esperti sono a disposizione per eventuali suggerimenti. 3

8 Si consiglia di preparare il tessuto nel modo seguente: Fissazione in formalina neutra tamponata al 10% per 24 h a temperatura ambiente. Per ottenere una fissazione ed un'inclusione in paraffina ottimali ed uniformi, la grandezza del campione non deve essere superiore a 0,5 cm 3. Procedimento standard e inclusione in paraffina Utilizzare paraffina di alta qualità. L'infiltrazione e l'inclusione devono avvenire ad una temperatura inferiore a 65 C. Preparare sezioni con spessore di 2-5 µm Utilizzare vetrini rivestiti di silano oppure altre sostanze, fissare per 2-16 h a C. 4.4 Materiale supplementare necessario I seguenti reagenti, materiali e strumenti non sono contenuti nel kit: Sonda ZytoLight FISH Xilene Bagno termostatato (37 C, 98 C) Piastra calda Stufa per ibridazione Vaschette di colorazione, ml Camera umida Micropipetta (10 µl, 30 µl) Pistola per incollaggio con adesivo a caldo o mastice(fixogum Etanolo 100% denaturato Acqua distillata o deionizzata Microscopio a fluorescenza 4

9 4.5 Informazioni importanti Occorre tenere presente che: Le sezioni non devono disidratarsi durante l'ibridazione ed i lavaggi! Le sonde DNA e il DAPI/Antifade solution (MT1) non devono essere esposti alla luce, specialmente alla luce diretta, per un lungo periodo di tempo. Operare quindi, ove possibile, al buio e utilizzanto contenitori opachi! Le temperature di denaturazione e lavaggio descritte nel protocollo devono essere utilizzate come guida. In base alla fissazione dei campioni, una variazione di tali temperature potrebbe produrre risultati migliori! Questo protocollo è stato sviluppato per la denaturazione simultanea di campione e sonda. Protocolli per denaturazioni separate sono disponibile all homepage 5

10 5. Protocollo ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit 5.1 Preparazione 1 giorno: Preparazione della scala di etanolo (70%, 90% e 100% etanolo): diluire 7, 9 e 10 parti di 100% etanolo con 3, 1 e 0 parti di acqua deionizzata o distillata. Le soluzioni possono essere conservate in appositi contenitori e riutilizzate. Tampone citrato per pretrattamento termico (PT1) Riscaldare il tampone in una vaschetta di colorazione coperta in acqua bollente ad almeno 95 C. Tampone di lavaggio SSC (WB1): Portare a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. 2 giorno: Preparazione del Tampone di lavaggio A 1x: Diluire 1 parte di Tampone di lavaggio A, 25X (WB1), con 24 parti di acqua distillata o deionizzata. Riempire tre vaschette di colorazione con la soluzione ottenuta e preriscaldare a 37 C. Dapi/antifade solution (MT1): portare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. 5.2 Pretrattamento (sparaffinatura/proteolisi) (1 giorno) 1. Incubare i vetrini per 10 min a 70 C (es. su una piastra riscaldante.) 2. Incubare 2x 10 min in xilene 3. Incubare 100%, 100%, 90% e 70% etanolo, per 5 minuti ciascuno 4. Lavare 2x 2 min in acqua deionizzata o distillata. 5. Incubare i vetrini per 15 min in Tampone citrato per pretrattamento termico (PT1) precedemente riscaldato a 98 C. Si raccomanda di non utilizzare più di sei vetrini per vaschetta. 6. Trasferire direttamente i vetrini in acqua distillata e deionizzata, lavare 2x 2min e asciugare il vetrino. 6

11 7. Applicare tramite gocciolamento la Pepsina incubare per 10 min a 37 C in camera umida. (ES1)sul preparato e Il tempo di incubazione dipende dal tipo di campione, dallo spessore della sezione e dal relativo tempo di fissazione. Come valore indicativo, si può considerare un'incubazione di min per campioni di tessuto e di 5-10 min per le cellule. In generale, si consiglia di determinare il tempo di proteolisi ottimale eseguendo un test preventivo. 8. Lavare per 5 min in Tampone di lavaggio SSC (WB1) e per 1 min in acqua distillata. 12. Disidratare in etanolo 70%, 90% e 100%, ciascuno per 1 min. Asciugare all'aria. 5.3 Denaturazione e ibridazione (1 giorno) 1. Vortexare la sonda Zytolight FISH e pipettare 15 µl per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (22 mm x 22 mm; 24 mm x 32 mm). Sigillare il coprioggetto con adesivo o mastice. 3. Denaturare i campioni a 75 (±2 C) per 10 min, es. su una piastra riscaldante. 4. Trasferire i vetrini in una cameretta umida e ibridare overnight a 37 C (es. in un fornetto.) E' indispensabile mantenere umido il campione durante l'ibridazione. 5.4 Post-ibridazione e rilevazione (2 giorno) 1. Rimuovere con cura il mastice o la colla 2. Rimuovere il coprioggetto immergendo il vetrino in Tampone di lavaggio A 1x a 37 C per 5 min. Il Tampone di lavaggio A deve essere pre-riscaldato. Verificare con un termometro se necessario. 4. Lavare 3x 2 min in acqua deionizzata o distillata. 5. Disidratare in etanolo 70%, 90% e 100%, ciascuno per 1 min. 6. Asciugare i vetrini all aria. 7

12 7. Applicare 30 µl di Dapi/antifade solution (MT1) sui vetrini evitando la formazione di bolle, coprire il campione con un coprioggetto e incubare per 15 min al buio. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto; l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. Evitare l esposizione alla luce 8. Rimuovere gentilmente l eccesso di Dapi/antifade solution (MT1) 9. Conservare i vetrini al buio; per l archiviazione di lungo periodo conservare a 2-8 C 10. Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza utilizzando l adeguato set di filtri. 8

13 6. Interpretazione dei risultati Tramite l uso dell appropriato set di filtri, i segnali di ibridazione delle sonde marcate ZyGreen appariranno verdi, i segnali di ibridazione delle sonde ZyOrange appariranno arancioni. Nell interfase di cellule normali o di cellule prive di aberrazioni cromosomiali, verrano visualizzati due segnali per sonda/segnale fluorescente eccetto per le sonde che devono marecare i cromosomi X e/o Y in cui si possono ottenere uno o due segnali a seconda del sesso. In cellule con aberrazioni cromosomiali un diverso pattern di segnale verrà visualizzato. I polinucleotidi contenuti nella sonda possono essere considerati come controllo interno della avvenuta ibridazione, così come la prova dell integrità del DNA. Per valutare la specificità del segnale, ogni ibridazione dovrebbe essere accompagnata da vetrini di controllo. Si raccomanda l utilizzo di almeno un campione in cui si conosca il numero di copie di cromosomi della regione bersaglio della sonda FISH in uso. Particolare attenzione si deve prestare nella valutazione di cellule sovrapposte onde evitare falsi risultati tipo amplificazione del gene. A causa della de condensazione della cromatina, singoli segnali FISH possono apparire come piccoli cluster, comunque due o tre segnali della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di un segnale, devono essere considerati come un unico segnale. Un risultato negativo aspecifico può essere causato da diversi fattori, fare riferimento al capitolo 8. 9

14 7. Bibliografia Kievits T, et al. (1990) Cytogenet Cell Genet 53: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN

15 8. Problemi e possibili cause La mancata osservanza delle indicazioni contenute nelle istruzioni per l'uso può produrre risultati deboli o mancanza di segnale. Problema Possibile causa Azione Crepe nel tessuto in seguito al trattamento con pepsina Segnale scarso o nullo Colorazione irregolare e molto debole in alcune zone Segnali di crossibridazione, intensa colorazione di fondo Distacco delle sezioni dal vetrino Formazione di precipitato Nessuna sequenza target nel materiale analizzato Fissazione non ottimale delle cellule o dei tessuti Tessuto iper- o ipo- digerito Temperatura di denaturazione non appropriata Temperatura di ibridazione non corretta Microscopio a fluorescenza non correttamente configurato Sonda e vetrini esposti a luce intensa Le sezioni non sono correttamente sparaffinate Eccessivo volume di sonda per area Eccessivo trattamento proteolitico Disidratazione delle sezioni durante i passaggi di incubazione Temperatura dei lavaggi postibridazione troppo bassa Eccessivo pre-trattamento proteolitico Rivestimento dei vetrini inappropriato Lavare immediatamente i vetrini in acqua deionizzata o distillata Utilizzare controlli Ottimizzare i tempi di fissazione Ottimizzare I tempi di trattamento proteolitico Verificare la temperatura; aggiustare la temperatura, se necessario. Verificare la temperatura; aggiustare la temperatura, se necessario. Regolare lo strumento Evitare l esposizione alla luce ove possibile Utilizzare etanolo e xylene freschi; utilizzare solo xylene puro. Verificare i tempi di sparaffinatura. Ridurre il volume della sonda per area, distribuire in modo uniforme la sonda per evitare che si concentri localmente Ottimizzare i tempi di incubazione Impedire disidratazione Verificare la temperatura Diminuire i tempi di incubazione Utilizzare vetrini appropriati 11

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17 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite K i t d i I m p l e m e n t a z i o n e F I S H p e r C i t o l o g i a IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Produttore: ZytoVision GmbH Codice: Z (20 test) Per l ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) su campioni citologici mediante sonde FISH ZytoLight. Dispositivo Medico Diagnostico In Vitro In ottemperanza alla direttiva UE 98/79/EC Revisione del 24/03/14 Pagina 1 di 12

18 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite A partire dal: 7 luglio 2010 (4.5) Marchi registrati: ZytoVision e ZytoLight sono marchi registrati di ZytoVision GmbH. Revisione del 24/03/14 Pagina 2 di 12

19 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Contenuto 1 Scopo dell applicazione Principi di base Precauzioni di sicurezza e smaltimento Kit d implementazione FISH ZytoLight per Citologia Componenti Conservazione e validità Campioni Ulteriori Materiali Informazioni Importanti Protocollo del kit d implementazione FISH ZytoLight per Citologia Passaggi preparatori Pretrattamento (Proteolisi/Post-Fissazione) [giorno 1] Denaturazione e Ibridazione [giorno 1] Post Ibridazione e Visualizzazione [giorno 2] Interpretazione dei risultati Letteratura Revisione del 24/03/14 Pagina 3 di 12

20 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Scopo dell applicazione Il kit d implementazione ZytoLight per Citologia è designato per la determinazione della presenza di sequenza umane in campioni citologici mediante ibridazione in situ in fluorescenza (FISH). L interpretazione dei risultati deve essere effettuata in un contesto di storia clinica del paziente rispetto ad ulteriori informazioni relative a dati clinici e patologici del paziente da un patologo qualificato. 2. Principi di Base La presenza di determinate sequenze di acidi nucleici nelle cellule o nei tessuti può essere determinata mediante ibridazione in situ utilizzando sonde a DNA marcate. I risultati dell ibridazione corrispondono ad una duplice presenza di sequenze presenti nel campione in analisi e nella sonda a DNA. Il kit d implementazion e per FISH Zyt olight per Citologia è destinato all uso con qualsiasi sonda FISH ZytoLight disponibile separatamente. La formazione di segnali doppi delle sonde marcate in fluorescenza può essere visualizzata utilizzando un microscopio in fluorescenza con appositi filtri. Revisione del 24/03/14 Pagina 4 di 12

21 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Precauzioni di sicurezza e smaltimento Leggere le istruzioni per l'uso prima dell utilizzo! Non utilizzare i reagenti dopo che la data di scadenza è stata raggiunta! Evitare ogni contaminazione incrociata e contaminazione batterica dei reagenti! Alcuni dei componenti del sistema contengono sostanze (a basse concentrazioni e volumi) che sono dannose per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Adottare idonee misure protettive (utilizzo di guanti monouso, occhiali protettivi e indumenti da laboratorio)! Se i reagenti vengono a contatto con la pelle, lavare immediatamente la pelle con abbondante quantità di acqua! Mai pipettare soluzioni con la bocca! Lo smaltimento dei reagenti deve essere effettuato in conformità con i regolamenti locali! La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta dell utilizzatore professionale! Revisione del 24/03/14 Pagina 5 di 12

22 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Kit d implementazione FISH ZytoLight pe r Citologia 4.1 Componenti Il kit è costituito dai seguenti componenti: Codice Componente Quantità Confezionamento ES2 Soluzione Pepsina Citologica 4 ml Flacone contagocce, tappo trasparente WB5 Buffer di lavaggio TBS 20X 50 ml Bottiglia con tappo a vite PT4 MgCl2 10X 50 ml Bottiglia con tappo a vite PT5 PBS 10X 50 ml Bottiglia con tappo a vite WB7 Tampone di lavaggio stringenza 500 ml Bottiglia con tappo a vite (grande) SSC per citologia WB8 Tampone di lavaggio 500 ml Bottiglia con tappo a vite (grande) SSC per citologia MT1 Soluzione DAPI / antifade 0,8 ml Provetta con tappo blu Manuale di istruzioni 1 I componenti (ES2) e (MT1) sono sufficienti per 20 reazioni. Componenti (PT4), (PT5), (WB7) e (WB8) sono sufficienti per 7 contenitori per lavaggi da 70 ml ciascuno. Il componente (WB5) è sufficiente per 14 contenitori per i lavaggi da 70 ml ciascuno. 4.2 Conservazione e validità I componenti del kit devono essere conservati a C ad eccezione della soluzione DAPI / Antifade (MT1) che deve essere conservata a C al buio; una conservazione di breve durata a C è possibile. Osservando tali condizioni di conservazione, il kit funzionerà, senza perdita di prestazioni, almeno fino alla data di scadenza stampata sull'etichetta. Revisione del 24/03/14 Pagina 6 di 12

23 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Campioni Il Kit di implementazione ZytoLight FISH per la Citologia è stato ottimizzato per l'uso su metafasi e cellule in interfase da sangue periferico, colture, o direttamente su preparati ottenuti con metodi citogenetici standard, vedere ad esempio: Beatty B, Mai S, Squire J (a cura di): FISH a practical approach, Oxford University Press (2002). I nostri specialisti sono a vostra disposizione per supportare qualsiasi messa a punto necessaria. Si consiglia la seguente preparazione del campione: Incubare i campioni durante la notte (12-16 h) a 37 C per l'invecchiamento In alternativa, l'invecchiamento di campioni può essere realizzato mediante incubazione dei vetrini per 2 min in 2X SSC a 73 ± 1 C immediatamente prima della proteolisi. 4.3 Ulteriori Materiali I seguenti reagenti e materiali non sono inclusi nel kit: - sonda FISH ZytoLight - Bagnomaria (72 ± 1 C) - Piastra calda - Fornetto per ibridazione - Vaschette di colorazione, ml - Camera umida - Pipette (10 ml, 30 ml) - Pistola per incollaggio con adesivo a caldo o mastice (Fixogum) - Formaldeide, neutra tamponata - Etanolo 100%, denaturato - Acqua deionizzata o distillata - Blocco di asciugatura - Coprivetrini (22 millimetri x 22 mm, 24 mm x 60 mm) - Microscopio a fluorescenza Revisione del 24/03/14 Pagina 7 di 12

24 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Informazioni Importanti Le seguenti informazioni devono essere tenute a mente: - I campioni citologici non devono asciugare durante l ibridazione ed i lavaggi! - La soluzione di formaldeide all 1% deve essere preparata prima dell'uso e dovrebbe essere eliminata dopo l utilizzo. Le soluzioni non utilizzate possono essere conservate a C fino a 6 mesi. - Sonda di DNA e la soluzione DAPI / Antifade (MT1) non dovrebbero essere esposti alla luce, luce particolarmente forte. Tutti i passaggi dovrebbero essere realizzati, ove possibile, al buio! - La temperatura ed i tempi per i lavaggi descritti nel protocollo, devono essere seguiti con precisione in quanto condizioni di lavaggio errate possono portare a nessun segnale o a segnali deboli. - Questo protocollo è progettato per la denaturazione simultanea di sonda e campione. Protocolli per la denaturazione separata sono disponibili sulla nostra homepage ( Revisione del 24/03/14 Pagina 8 di 12

25 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Protoc ollo del kit d implemen tazione FISH Zy tolight per Citologia 5.1 Passaggi preparatori giorno 1 Preparazione di una serie di alcoli (70%, 90%, e 100%): Diluire 7, 9, e 10 parti di etanolo al 100% con 3, 1 e 0 parti di acqua deionizzata o acqua distillata, rispettivamente. Queste soluzioni possono essere conservate in idonei contenitori e riutilizzate. Preparazione di 1X Wash Buffer TBS: diluire 1 parte di 20x Wash Buffer TBS (WB5) con 19 parti di acqua deionizzata o distillata. Preparazione della soluzione di formaldeide 1%: per 100 ml 1% formaldeide Soluzione mix di 2,7 ml di formaldeide al 37% neutra tamponata o 10 ml del 10% di formaldeide neutra tamponata con 10 ml di 10x MgCl2 (PT4) e 10 ml di PBS 10x (PT5) e regolare il volume a 100 ml con acqua deionizzata o acqua distillata. Mescolare accuratamente. giorno 2 Wash Buffer di stringenza per citologia SSC (WB7): Preriscaldare a 73 ± 1 C. Wash Buffer SSC per citologia (WB8): Portare a temperatura ambiente. Soluzione DAPI / Antifade (MT1): Portare a temperatura ambiente prima dell'uso, proteggere dalla luce. 5.2 Pretrattamento (Proteolisi/Post-Fissazione) [giorno 1] 1. Applicare (a gocce) la soluzione di pepsina per Citologia (ES2) ai campioni citologici e incubare per 10 min a 37 C in una camera umida. A seconda di molteplici fattori, ad esempio tipo e durata della fissazione nonché tipo di cellule, possono essere richiesti diversi tempi di incubazione. Si consiglia un tempo di incubazione di 5-15 min per campioni citologici. Come regola generale, si consiglia di determinare il tempo di proteolisi ottimale eseguendo un test preventivo. 2. Incubare i vetrini per 5 min in 1x Wash Buffer TBS 3. Incubare i vetrini per 5 min in soluzione di formaldeide 1% 4. Incubare i vetrini per 5 min in 1x Wash Buffer TBS Revisione del 24/03/14 Pagina 9 di 12

26 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Disidratazione: etanolo 70%, 90% e 100%, 1 min per ciascuno. Fare asciugare all'aria i campioni. 5.3 Denaturazione e Ibridazione [giorno 1] 1 Pipettare 10 ml di sonda ZytoLight su ciascun campione Un leggero riscaldamento della sonda, come anche l utilizzo di un puntale a cui è stata tagliata la punta per aumentare la dimensione della apertura, può rendere il processo di pipettaggio facile. Evitare la lunga esposizione della sonda alla luce. 2 Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (22 mm x 22 mm). Sigillare il coprioggetto, ad esempio con uno strato di colla a caldo da una pistola adesivo o con mastice 3 Denaturare a 72 ± 1 C per 2 min, ad esempio su una piastra calda 4 Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37 C (ad esempio in un fornetto) E 'essenziale che i campioni citologici non si asciugano durante l'ibridazione. 5.4 Post Ibridazione e Visualizzazione [giorno 2] Rimuovere con cura il mastice o la colla Rimuovere con attenzione il vetrino Lavare, utilizzando il tampone di stringenza SSC (WB7) per 2 min a 72 ± 1 C Il buffer di stringenza SSC deve essere preriscaldato a 72 ± 1 C. Verificare con un termometro se necessario. Si consiglia di non utilizzare più di quattro vetrini per vaschetta di colorazione. Quando necessario, usare vetrini vuoti per portare il numero a quattro. Lavare, utilizzando il Wash Buffer SSC (WB8) per 1 minuto a temperatura ambiente. Il Wash Buffer SSC deve essere portato a temperatura ambiente. Verificare con un termometro se necessario. Si consiglia di non utilizzare più di quattro vetrini per vaschetta di colorazione. Quando necessario, usare vetrini vuoti per portare il numero a quattro. Asciugare i campioni al riparo dalla luce. Pipettare 30 µl di soluzione DAPI / Antifade (MT1) sui campioni. Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (24 mm x 60 mm). Incubare al buio per 15 minuti. Revisione del 24/03/14 Pagina 10 di 12

27 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Usare un puntale a cui è stata tagliata la punta per aumentare la dimensione della apertura può rendere il processo di pipettaggio più semplice. Evitare l'eccessiva esposizione alla luce. Rimuovere l'eccesso di soluzione DAPI / Antifade (MT1) premendo delicatamente il vetrino tra strati di carta. Conservare i vetrini al buio. Per periodi di conservazione lunghi mettere a 2-8 C. Osservare il campione mediante microscopia a fluorescenza usando filtri appositi. 6 Interpretazione dei risultati Con l'utilizzo di appositi set di filtri, in cellule interfasiche e metafasiche normali o cellule senza aberrazioni cromosomiche, verranno osservati due segnali per ciascuna sonda marcata in fluorescenza, eccetto per sonde che ibridino con il cromosoma X e / o Y. Nelle cellule con aberrazioni cromosomiche, diversi pattern di segnale possono essere visibili. Per una descrizione più dettagliata di pattern di segnali attesi consultare il manuale relativo a ciascuna sonda. I polinucleotidi contenuti in sonde FISH possono funzionare come controllo interno che dimostri se è avvenuta l ibridazione, nonché dimostrare l'integrità del DNA cellulare. Per valutare la specificità dei segnali, ogni ibridazione dovrebbe essere corredata da controlli. Si consiglia di utilizzare almeno un campione di controllo in cui sia noto il numero di copie di regioni cromosomiche riconosciute dalla sonda FISH. Si deve prestare attenzione a non valutare erroneamente le cellule sovrapposte, in modo da evitare falsi risultati, ad esempio una amplificazione genica. A causa della cromatina decondensata, singoli segnali possono apparire come cluster. Due o tre segnali con le stesse dimensioni, separati da una distanza uguale o inferiore al diametro di un segnale, devono essere considerati un singolo segnale. Un risultato negativo o aspecifico può essere causato da molteplici fattori. Revisione del 24/03/14 Pagina 11 di 12

28 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Letteratura Revisione del 24/03/14 Pagina 12 di 12

29 Scheda tecnica Fixogum F i x o g u m, R u b b e r C e m e n t Notizie generali Distributore: Codice prodotto: Descrizione: Produttore: BIO OPTICA Milano S.p.A. Milano Italy E formato da 125g Collante per sigillare il copri oggetto al vetrino portaoggetti, durante ibridazione in situ. Compatibile con metodiche CISH e FISH. Zytovision GmbH Note di utilizzo Campi di applicazione Utilizzo CISH e FISH Aggiungere poche gocce di Fixogum per sigillare il copri oggetto al vetrino portaoggetti. Lasciare asciugare. Procedere come da metodica per ibridazione in situ (denaturazione e ibridazione). Fixogum, Rubber Cement Codice E Descrizione Fixogum, Rubber Cement, 125g Pagina 1 di 1 Bio Optica Milano s.p.a. via San Faustino 58 I Milano tel fax

30 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Ve t r ini p orta ogget t o S u p erfrost P l u s IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Codice CND: W Notizie generali Vetrini portaoggetto a carica positiva, di dimensioni 25 mm x 75 mm e 1 mm di spessore (ISO Norm 8037/I), molati a 90. Il rivestimento superficiale migliora l adesione del tessuto al vetrino. Codice Confezionamento Colore banda 09-OPLUS 72 pezzi in scatola protettiva di plastica Bianco Produttore: Gerhard Menzel, Glasbearbeitungswerk GmbH Saarbrückener Str D Braunschweig Germany Distributore: Bio-Optica Milano S.p.A. Caratteristiche chimiche e tecniche Materiale: extra white glass Indice di rifrazione: (misurato tra λ= nm e λ= nm) Densità: (2.47 ± 0.01) kg/dm 3 I vetrini portaoggetto Menzel sono puliti e sgrassati, trasparenti e privi di qualsiasi tipo di assorbimento selettivo. La loro produzione è completamente automatizzata per eliminare sporcizia, polvere, incrinature e rotture; garantisce inoltre vetri regolari nelle dimensioni e uniformemente piani. L elevata qualità delle materie prime garantisce lunga durata e stabilità nel tempo. I portaoggetto Menzel sono resistenti a trattamenti enzimatici e al microonde (potenza consigliata: watt). Revisione del 10/06/10 Pagina 1 di 2

31 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Composizione chimica SiO 2 (biossido di silicio): 72.20%; Na 2O (ossido di sodio): 14.30%; K 2O (ossido di potassio): 1.20%; CaO (ossido di calcio): 6.40%; MgO (ossido di magnesio): 4.30%; Al 2O 3 (ossido di alluminio): 1.20%; Fe 2O 3 (ossido di ferro): 0.03%; SO 3 (triossido di zolfo): 0.30%. Caratteristiche funzionali I vetrini Superfrost Plus sono prodotti con un processo che: riveste con una carica positiva permanente i vetrini standard; attrae elettrostaticamente le sezioni criostatate e i preparati citologici, legandoli al vetrino; induce la formazione di legami covalenti tra i campioni fissati in formalina e il vetrino. Il trattamento elettrostatico, che carica positivamente e in modo permanente la superficie del vetrino, garantisce l adesione del campione. Con i vetrini Superfrost Plus, non rimane la colorazione di fondo dovuta alla carica positiva del vetro: Assenza di fondo blu o rosso con ematossilina ed eosina, che si forma invece utilizzando normali vetrini con film adesivo. Assenza di fondo marrone con immunoperossidasi e procedure di ibridazione in-situ. Ottima adesione delle sezioni con trattamenti di digestione enzimatica, denaturazione di DNA e ibridazione di RNA. I vetrini Superfrost Plus sono RNAsi-free. Modalità di conservazione e stoccaggio Conservare i vetrini in luogo fresco e asciutto. Evitare i grandi sbalzi di temperatura durante lo stoccaggio e l uso. Un raffreddamento del prodotto può causare condensazione con formazione di acqua condensata tra i vetrini. Proteggere dall umidità. Validità del prodotto: 1 anno. Si consiglia di controllare sempre la validità del prodotto sulla confezione. Smaltimento: da smaltire in conformità con la normativa vigente. Se non utilizzati, smaltire come vetro comune. Revisione del 10/06/10 Pagina 2 di 2

32 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Ve t r ini C opri ogget t o IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Codice CND: W Notizie generali Vetrini coprioggetto per microscopia. Codice Dimensioni (mm) Confezionamento x pz. (5 scatole da 200 vetrini l una) x pz. (5 scatole da 200 vetrini l una) x pz. (5 scatole da 200 vetrini l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (5 scatole da 200 vetrini l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (5 scatole da 200 vetrini l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) x pz. (10 scatole da 100 vetri l una) Ø pz. (10 scatole da 100 vetri l una) Revisione del 11/04/12 Pagina 1 di 2

33 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Produttore: Distributore: Menzel Gläser Gerhard Menzel, Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG Saarbrückener Str. 248 D Braunschweig Germany Bio-Optica Milano S.p.A. Caratteristiche funzionali Materiale: vetro idrolitico classe 1 Indice di rifrazione: Spessore dei vetrini: (misurato tra λ= nm e λ= nm) mm I vetrini coprioggetto BIO-OPTICA sono uniformemente piani, esenti da rigature, bolle o striature, garantendo un elevata qualità ottica. La loro produzione è completamente automatizzata per eliminare sporcizia, polvere, incrinature e rotture L elevata qualità delle materie prime garantisce inoltre lunga durata e stabilità nel tempo. I vetrini coprioggetto sono confezionati in scatole di plastica antiurto che ne preserva l integrità fino all utilizzo. Modalità di conservazione e stoccaggio Conservare i vetrini in luogo fresco e asciutto. Evitare i grandi sbalzi di temperatura durante lo stoccaggio e l uso. Un raffreddamento del prodotto può causare condensazione con formazione di acqua condensata tra i vetrini. Proteggere dall umidità NB: E possibile, su richiesta, preparare vetrini di dimensioni particolari. Revisione del 11/04/12 Pagina 2 di 2