ALLflow Elution Technologies Gluten Rapid Test Lateral Flow kit Cat. N. ETGLTN-1005 Kit per la rilevazione rapida del glutine in campioni alimentari ed ambientali AOAC-PTM certification #0116011 Manuale d uso Leggere attentamente il manuale prima di procedere all uso del kit Via San Geminiano, 4 41030 San Prospero (MO)- Italy (: +39 059 8637161 : +39 059 7353024 *: laboratorio@generon.it : www.generon.it [1] User Manual - ALLflow Gluten Rapid Kit Rev. 1 04/01/2016
1 Principio del test e suo utilizzo Il test si basa sulla tecnologia Lateral Flow Device (LFD) utilizzando un metodo analitico immunocromatografico in cui un anticorpo policlonale specifico per l identificazione di gliadina in frumento, segale e orzo è immobilizzato su un supporto solido. Questo test è stato progettato per lo screening di residui di glutine fino a 5 ppm in materie prime, prodotti finiti, acque di lavaggio industriale (CIP - Clean in Place Solution), campionamenti da superficie mediante tamponi. Il test è utilizzato per identificare residui di glutine in grano, orzo e/o farine di segale o loro varietà con intervalli compresi tra 2.5 ppm e 100,000 ppm. La metodica di analisi non necessita di ulteriori controlli interni, il test applicato su grano, orzo e/o segale non produce falsi positivi. Gli anticorpi utilizzati in questo test non evidenziano reattività incrociata con: Avena, Soia, Riso, Miglio, Mais, Sorgo, Uova, Semi di Lino, Amaranto, Spezie, Erbe Aromatiche e Patata. La lettura del risultato è semplice e non necessita di strumentazione specifica, la presenza di una linea più scura indica un elevata presenza di glutine. Come tutti i metodi di analisi per il settore alimentare anche questo test deve essere testato sulla specifica matrice di interesse per escludere la presenza di inibitori che possono determinare risultati non attendibili. Materiale Il kit include: 25 ml di soluzione di estrazione (Extraction Buffer), 25 Lateral Flow Devices (LFD), 26 provette da microcentrifuga da 2 ml. II kit non include: tamponi per il prelievo del campione, pipette. Istruzioni di conservazione Le soluzioni possono essere conservate a temperatura ambiente per 90 giorni. Per tempi superiori conservare a 4-8 C. Non congelare nessun componente nel kit. I reagenti non devono essere esposti alla luce ultravioletta o a fonti di calore prolungato. Conservare in luogo pulito e asciutto. Strumenti richiesti per l esecuzione dell analisi Matrice Centrifuga Vortex Bilancia Timer Liquida Non richiesta Non richiesto Non richiesta Richiesto Solida Non richiesta Non richiesto Richiesta Richiesto Liquida contenente cioccolata Richiesta Non richiesto Non richiesta Richiesto Solida contenente cioccolata Richiesta Non richiesto Richiesta Richiesto Indicazioni generali Ogni lotto di soluzione viene validata in modo specifico per ciascun lotto LFD e non è intercambiabile con altri lotti. Per evitare problemi di contaminazioni non utilizzare la stessa pipetta per analizzare più campioni. Attendere che tutti i reagenti e il materiale siano a temperatura ambiente prima di effettuare l analisi. Utilizzare la quantità richiesta di reagente e aver cura di conservare il rimanente in un luogo refrigerato. Quattro gocce prelevate con una pipetta corrispondono a 100 µl circa. Per assistenza consultare i tecnici Generon (www.generon.it - email: laboratorio@generon.it) o in alternativa il sito www.elutiontechnologies.com dove sono disponibili istruzioni video per il corretto utilizzo del test. [2] User Manual - ALLflow Gluten Rapid Kit Rev. 1 04/01/2016
2 Preparazione dei campioni ambientali 2.1 Preparazione di campioni utilizzando la Cleaning Place Solution (CIP solution) Questo passaggio consente di preparare la soluzione di estrazione per la successiva analisi per l identificazione del glutine. 1. Prelevare 800 µl di soluzione di estrazione (Extraction Buffer) e deporli in una provetta da microcentrifuga. 2. Utilizzando la stessa pipetta aggiungere 200 µl di soluzione CIP, mescolare bene per circa 30 secondi. 3. Vedi procedure specifiche per l esecuzione del test LFD. Per ottenere i migliori risultati il ph del campione dovrebbe essere compreso tra 5 e 10. Se il ph è al di sopra o al di sotto di questi livelli, effettuare una diluizione mantenendo la proporzione 1:1 (100 µl di campione e 100 µl di soluzione) fino a che il ph non rientra in questi parametri. Questo può ridurre la sensibilità fino a 1 ppm. Se si analizza più di un campione, assicuratevi di non utilizzare la stessa pipetta per ciascun campione per evitare contaminazione incrociata. 2.2 Preparazione di campioni utilizzando un prelievo mediante tampone 1. Prelevare dal kit e siglare una microprovetta da centrifuga. 2. Aggiungere 500 µl di soluzione di estrazione (Extraction Buffer) nella provetta da microcentrifuga. 3. Imbibire un tampone pulito nella soluzione contenuta nella provetta da microcentrifuga avendo cura nell estrazione di eliminare la soluzione in eccesso. 4. Appoggiare il tampone bagnato sulla superficie da analizzare e strofinare la superficie di interesse (vedi figura sottostante). 5. Inserire il tampone nella provetta da microcentrifuga e mescolare diverse volte in modo da rilasciare il campione nella soluzione di estrazione. 3. Vedi procedure specifiche per l esecuzione del test LFD. [3] User Manual - ALLflow Gluten Rapid Kit Rev. 1 04/01/2016
2 Preparazione dei campioni alimentari 2.3 Preparazione di campioni liquidi (prodotto finito e ingrediente crudo) 1. Prelevare dal kit e siglare una microprovetta da centrifuga. 2. Aggiungere 900 µl di soluzione di estrazione (Extraction Buffer) nella microprovetta da centrifuga. 3. Aggiungere 100 µl del campione dopo averlo mescolato. 4. Mescolare bene. 5. Vedi procedure specifiche per l esecuzione del test LFD. Se il campione si presenta troppo viscoso prima di procedere diluire ulteriormente il campione mantenendo il rapporto 1:1 tra campione e soluzione. 2.4 Preparazione di campioni solidi (prodotto finito e ingrediente crudo) 1. Prelevare un campione rappresentativo del vostro ingrediente/prodotto e macinarlo fino a ottenere una miscela omogenea. 2. Prelevare 0.2 g del campione macinato trasferendolo in una microprovetta da centrifuga. 3. Aggiungere 1.8 ml di soluzione di estrazione (Extraction Buffer). 4. Mescolare per almeno per tre minuti per favorire la sospensione del campione nella soluzione 5. Lasciare riposare fino a quando il colore risulta chiaro, questo passaggio favorisce la precipitazione del particolato, in alternativa centrifugare per 20-30 secondi a 5000-7000 rpm. 6. Vedi procedure specifiche per l esecuzione del test LFD. [4] User Manual - ALLflow Gluten Rapid Kit Rev. 1 04/01/2016
3 Preparazione dei campioni contenenti cioccolata 2.5 Preparazione del campione liquido e solido contenente cioccolata Fase 1 Istruzioni per campioni liquidi 1. Misurare 500 µl del campione liquido ben mescolato in una microprovetta da centrifuga. 2. Aggiungere 500 µl di soluzione di estrazione (Extraction Buffer) riscaldata a 60 C. Mescolare bene. Istruzioni per campioni solidi 1. Prelevare un campione rappresentativo del vostro ingrediente/prodotto e macinarlo fino a ottenere una miscela omogenea. 2. Pesare 1 g di campione in una microprovetta da centrifuga. 3. Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione (Extraction Buffer), Fase 2 riscaldato a 60 C. Mescolare bene fino alla fusione del cioccolato. Istruzioni comuni per entrambi i tipi di campione. 1. Prelevare dal kit una microprovetta da centrifuga avendo cura di indicare il nome del campione 2. Aggiungere 900 µl soluzione di estrazione (Extraction Buffer) nella microprovetta da centrifuga. 3. Aggiungere 100 µl del campione ben miscelato nella stessa microprovetta da centrifuga. 4. Centrifugare per 15 secondi a 5000-7000 rpm. 5. Vedi procedure specifiche per l esecuzione del test LFD. [4] User Manual - ALLflow Gluten Rapid Kit Rev. 1 04/01/2016
4 Procedure specifiche per l esecuzione del test Prima dell uso attendere che il test LFD raggiunga la temperature ambiente. 1. Prelevare la strip LFD dalla confezione e posizionarla su di una superficie pulita, piatta ed asciutta. 2. Prelevare 100 µl dallo strato centrale della soluzione, utilizzando la stessa pipetta di trasferimento utilizzata per la preparazione del campione. Depositare 100 µl del campione nell area di applicazione (apertura rotonda, sample application well) ad una estremità del supporto LFD e attendere, dopo aver avviato il timer, 11 minuti. Interpretazione dei risultati ottenuti Disporre il test seguendo i seguenti riferimenti: La linea superiore (linea di controllo o control line), sarà alla sinistra della lettera C. La linea inferiore (linea del test o test line), apparirà a fianco della lettera T sul LFD. Tabella riassuntiva dei risultati Tempo di lettura Linea Controllo Linea Test Risultato Test Concentrazione 5 minuti Assente Presente o Assente 5 minuti Presente Assente Test non valido Test non completato attendere 11 minuti - 5 minuti Presente Presente Valido Maggiore di 10 ppm 11 minuti Presente Assente Valido Minore di 5 ppm 11 minuti Presente Presente Valido Maggiore di 5 ppm Dopo 15 minuti Lettura non attendibile Due linee presenti a 11 minuti e non a 5 minuti possono indicare una concentrazione di glutine tra 5 e 10 ppm. [5] User Manual - ALLflow Gluten Rapid Kit Rev. 1 04/01/2016
5 Domande frequenti Domanda: il campione non riesce a migrare lungo la strip entro i primi 5 minuti. Risposta: potrebbe essere necessario centrifugare il campione se questo non è stato già fatto durante la preparazione. Se il campione è già stato centrifugato diluire ulteriormente il campione mantenendo la proporzione 1:1 con il tampone. Questo potrebbe ridurre la sensibilità a 10 ppm per alcune matrici. Domanda: sulla linea del test compare un punto rosso ma tutto il resto è chiaro. Risposta: centrifugare il campione e ripetere utilizzando un nuovo test. La causa potrebbe essere il particolato contenuto nel campione stesso. Domanda: le farine o gli ingredienti che contengono una elevata concentrazione di gomma possono non scorrere efficacemente lungo il test. Risposta: per ovviare al problema prelevare 0.3 grammi di campione e diluirlo con 600 ul di etanolo al 60%, mescolare per 30 secondi e centrifugare per 20 secondi, successivamente proseguire seguendo le istruzioni per la preparazione dei campioni liquidi. 6 Dichiarazione di non responsabilità Generon srl non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti si compongono sono di qualità standard. In caso di materiale difettoso, Generon srl si impegna a fornire un prodotto sostitutivo. Generon srl non è tenuta a rispondere per qualunque danno, inclusi danni speciali o consequenziali o spese che derivano direttamente o indirettamente dall`uso di questo prodotto. L acquirente può duplicare questo documento, in tutto o in parte, solo per scopi interni, a condizione che questa nota venga riportata in tutte le copie. Nella duplicazione l acquirente si impegna a compiere ogni ragionevole sforzo per impedire l'uso non autorizzato e la distribuzione delle informazioni sulla proprietà. Questo manuale è la semplice traduzione in lingua italiana del manuale in lingua straniera presente nel kit. [6] User Manual - ALLflow Gluten Rapid Kit Rev. 1 04/01/2016