Noradrenalin ELISA RE C. Istruzioni per l Uso

Istruzioni per l Uso Noradrenalin ELISA Saggio immunoenzimatico manuale ed automatico per la determinazione diagnostica in vitro quantitativa di noradrenalina (norepinefrina) in plasma e urina umana. RE59261 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com

1. USO PREVISTO Saggio immunoenzimatico manuale ed automatico per la determinazione diagnostica in vitro quantitativa separata di noradrenalina (norepinefrina) in plasma e urina umana. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Le catecolamine adrenalina, noradrenalina e dopamina sono sintetizzate nella midollare adrenergica, nel sistema nervoso simpatico e nel cervello. Esse influenzano virtualmente tutti i tessuti e sono coinvolte assieme ad altri sistemi ormonali e neuronali nella regolazione di una gran varietà di processi fisiologici. Poiché le catecolamine ed i loro metaboliti, metanefrina e normetanefrina, sono secreti in quantità in eccesso in un certo numero di patologie, possono essere utilizzate a scopo diagnostico. In tale contesto la diagnosi ed il monitoraggio di tumori del sistema nervoso hanno notevole importanza. Ciò vale in primo luogo per il feocromocitoma, ma anche per il neuroblastoma e per il ganglioneuroma. Grazie alla fase di estrazione all inizio del dosaggio, si possono usare tutti i tipi di materiali di specie animali. Funziona per ratti, topi ed altri. La struttura chimica delle catecolamine è identica in tutti gli animali. 3. PRINCIPIO DEL TEST Test immunoenzimatico assorbente su fase solida (ELISA) basato sul principio sandwich. I pozzetti sono rivestiti con anticorpi di capra anti-coniglio. L anticorpo liquido aggiunto, diretto verso l epitopo di una molecola di antigene, si lega alla piastra entro il tempo d incubazione. L antigene del campione viene incubato nel pozzetto rivestito assieme al secondo anticorpo coniugato all enzima (E-Ab) diretto verso una differente regione della molecola antigenica. Dopo reazione con il substrato l intensità del colore sviluppato è proporzionale alla quantità di antigene presente. I risultati dei campioni possono essere determinati direttamente usando la curva standard. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle. 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. L informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. Version 2014-12 1 / 9

6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Il rilascio in-vivo di catecolamine e metanefrine è influenzato da diversi cibi e farmaci. Vitamina B, caffè e banane, alfa-metildopa, MAO e COMT inibitori e la somministrazione di tutti i farmaci collegati all ipertensione dovrebbero essere interrotta per almeno 72 ore prima della raccolta del campione dal paziente. Plasma (EDTA) I campioni di sangue vanno conservati a 2-8 C fino al momento della centrifugazione per separare il plasma che deve avvenire entro 2 ore dalla raccolta del sangue. Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Conservazione: 2-8 C -20 C (Aliquote) Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. Stabilità: 6 ore 1 mese Spedire i campioni dopo loro congelamento. Urina È possibile usare campioni freschi e campioni delle 24 ore. Il volume totale delle urine delle 24 ore deve essere raccolto in un unico recipiente con aggiunta di 10-15 ml di HCl 6 N come conservante. Segnare il volume totale per il calcolo dei risultati. Mescolare e centrifugare i campioni prima di usare nel saggio. Conservazione: -20 C (Aliquote) Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Stabilità: 6 mesi Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. 7. MATERIALE FORNITO I reagenti forniti in questo kit sono sufficienti per eseguire fino a 48 determinazioni singole nella procedura di estrazione (6 standard, 2 controlli, 40 campioni pazienti) e fino a 48 duplicati nell ELISA per ogni adrenalina e noradrenalina in plasma ed urina. Ulteriori reagenti sono disponibili su richiesta. Quantità Simbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 6 x 2.5 ml CAL A-F 1 x 2 x 2.5 ml CONTROL 1+2 1 x 400 µl ENZCONJ CONC 2 x EXTRPLATE 1 x 60 ml EXTRBUF 2 x 1.25 ml COMT LYO 2 x 1.25 ml COENZ 1 x 3 ml ENZBUF 2 x 13 ml RELEASEBUF 1 x 3 ml ACYLREAG Micropiastra Strisce separabili. Coniugato con anti-coniglio IgG. (capra, policlonale). Standard A-F Adrenalina: 0; 1.5; 5.0; 15; 50; 150 ng/ml (0; 8; 27; 82; 273; 819 nmol/l) Noradrenalina: 0; 5.0; 15; 50; 150; 500 ng/ml (0; 30; 89; 296; 887; 2955 nmol/l) Dopamina: 0; 60; 180; 585; 2300; 11470 ng/ml (0; 392; 1175; 3819; 15014; 74876 nmol/l) Pronto/a all uso. Contiene: [-] Adrenalina, [-] Noradrenalina, [-] Dopamina (biologicamente attiva), e 0.1 M HCl. Controllo 1+2 Pronto/a all uso. Contiene: [-] Adrenalina, [-] Noradrenalina, [-] Dopamina (biologicamente attiva), 0.1 M HCl. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato CQ. Coniugato Enzimatico Concentrato (50x) Contiene: streptavidina fosfatase alcalina, Tampone Tris, HCl, 0.01 % NaN 3. Piastra di Estrazione (Piastra Macrotiter) 24 pozzetti ciascuno. Rivestito con gel di affinità di borato. Tampone di Estrazione Di colore rosa. Pronto/a all uso. Contiene: 0.016 % NaN 3. COMT liofilizzato Contiene: Catecol-O-metiltransferasi (fegato di porco), NaN 3. Soluzione Coenzimatica Pronto/a all uso. Contiene: S-Adenosil-L-Metionina, stabilizzatori. Tampone Enzimatico Pronto/a all uso. Contiene: Tampone Tris, HCl, stabilizzatori. Tampone di Rilascio Di Colore Giallo. Pronto/a all uso. Contiene: 0.1 M HCl, indicatore. Reagente di Acilazione Pronto/a all uso. Contiene: dimetilformamide, Etanolo. Attenzione! Tossico. Altamente infiammabile. Version 2014-12 2 / 9

Quantità Simbolo Componente 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 2 ml COMT ADD 1 x 8.0 ml ANTISERUM NAD 1 x 25 ml PNPP SUBS Tampone Lavaggio Concentrato (10x) Contiene: Tampone Tris, HCl, Tween, 0.2 % NaN 3. COMT Additivo Contiene: plasma umano, stabilizzatori, 0.01 % Thimerosal. Noradrenalina Antisiero Di colore blu. Pronto/a all uso. Contiene: anticorpi contro Noradrenalina (coniglio), Tampone, stabilizzatori. Soluzione Substrato PNPP Pronto/a all uso. Contiene: p-nitrofenil fosfato (PNPP). 1 x 15 ml PNPP STOP Soluzione Stop PNPP Pronto/a all uso. Contiene: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA. 3 x FOIL Pellicola Adesiva 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 10; 10-100; 100-1000 µl 2. Agitatore orbitale (200-900 rpm) (p.e. EAS 2/4, SLT) 3. Vortex mixer 4. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 5. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 6. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 405 nm (lunghezza d onda di riferimento 600-650 nm) 7. Acqua bidistillata o deionizzata 8. Carta assorbente, puntali per pipette e timer 9. Provette usa e getta per diluizione dei campioni 10. 0.1 M HCl, per la diluzione dei campioni (Urina) 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Alcuni componenti contengono un volume 250 µl di soluzione. Assicurarsi che la soluzione sia sul fondo del flacone prima di aprirlo. 5. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 6. Usare uno schema di pipettamento per realizzare una appropriata distribuzione sulla piastra. Uno schema di pipettamento per campioni e pretrattamento è disponibile al sito IBL-Homepage. 7. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere manipolati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 8. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare via e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 9. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. Version 2014-12 3 / 9

10. PROCEDURA MANUALE 10.1. ISTRUZIONI PRE-TEST Il contenuto del kit vale per 96 determinazioni e può essere suddiviso in 2 dosaggi separati. Durante l estrazione notevoli quantità di gel si possono separare dalla superficie della piastra di estrazione. Questo non influenza i risultati del test. Si deve evitare in ogni caso la contaminazione dell aria da parte di disinfettanti in polvere o in soluzione, usati per la pulizia di superfici o attrezzature, che contengano perossigeno, come ad esempio il VIRKON. Queste sostanze sono di notevole disturbo ai fini dell esecuzione. VIRKON è un marchio registrato di DuPont. 10.1.1. Diluizione dei Campioni I campioni con concentrazioni superiori al piú alto degli standard devono essere diluti secondo lo schema seguente: Campione da diluire con Note Plasma > standard più elevato acqua bidist. prima del processo di estrazione Urina > standard più elevato 0.1 N HCl prima del processo di estrazione 10.1.2. Estrazione di Campioni, Standards e Controlli (Piastra per Estrazione) (versione manuale) 1. Pipettare 20 µl di ogni Standard, Controllo e campione di urine e 500 µl di ogni campione di plasma nei rispettivi pozzetti della piastra di estrazione. Aggiungere 500 µl di acqua bidistillata in tutti I pozzetti eccetto quelli dei campioni di plasma per correggere le differenze di volume. 2. Pipettare 1000 µl di Tampone di Estrazione in ogni pozzetto. 3. Coprire la piastra con pellicola adesiva. Estrarre per 30 min a TA (18-25 C) su agitatore orbitale (600-900 rpm). Durante l agitazione il liquido può bagnare il foglio adesivo ma il livello non deve superare mai i 2/3 del pozzetto. Gli schizzi non influenzano i risultati. 4. Rimuovere la pellicola adesiva. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. 5. Pipettare 2 ml di acqua bidistillata in ogni pozzetto. 6. Coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva. Agitare 5 min a TA (18-25 C) su agitatore orbitale (600-900 rpm). Gli schizzi non influenzano i risultati. 7. Rimuovere la pellicola adesiva. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. Rimuovere completamente il fluido. 8. Pipettare 150 µl di Tampone di Estrazione in ciascun pozzetto. Aggiungere per ciascun pozzetto 50 µl di Reagente di Acilazione. Mescolare immediatamente dopo la pipettatura. 9. Estrarre per 20 min a TA (18-25 C) (senza foglio adesivo) su agitatore orbitale (400 600 rpm). 10. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. Rimuovere completamente il fluido. 11. Pipettare 2 ml di acqua bidistillata in ogni pozzetto. 12. Coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva. Agitare 5 min a TA (18-25 C) su agitatore orbitale (600-900 rpm). Gli schizzi non influenzano i risultati. 13. Rimuovere la pellicola adesiva. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. Rimuovere completamente il fluido. 14. Pipettare 300 µl di Tampone di Rilascio in ogni pozzetto. 15. Agitare 30 min a TA (18-25 C) (senza foglio adesivo) su agitatore orbitale (400 600 rpm). I campioni preparati devono essere dosati il giorno stesso. Se non è possibile, coprire la piastra di estrazione con foglio adesivo durante la notte mantenla ad una temperatura di 2-8 C. Version 2014-12 4 / 9

10.1.3. Preparazione di componenti concentrati Diluire / dissolvere I volumi indicati di seguito si riferiscono a un esecuzione con 6 strisce (48 determinazioni). Componente con Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità 25 ml WASHBUF CONC 225 ml acqua bidist. 1:10 Mescolare energicamente. 2-8 C 4 settimane 120 µl ENZCONJ CONC 6 ml WASHBUF (diluito) 10.2. PROCEDURA DEL TEST (versione manuale) 1:51 10.2.1. Preparazione della Soluzione Enzimatica COMT Preparare freschi ed utilizzare solo una volta. Mescolare senza formare schiuma. 18-25 C La Soluzione Enzimatica COMT dev essere preparata sul momento direttamente (max. 15 min) prima dell uso. Sciogliere ogni componente di COMT liofilizzato in 1.25 ml di acqua bidist. e mescolare il COMT sciolto.* Quindi pipettare 1.25 ml di Soluzione Coenzima seguiti da 1.25 ml di Tampone Enzima e 0.40 ml di COMT Additivo in ciascune delle fiale di COMT mischiato fino a raggiungere un volume finale di 4.15 ml di Soluzione Enzima COMT per fiala. Usare 1 fiala per 48 determinazioni di adrenalina. Se si misurano sia l adrenalina, sia la noradrenalina, abbinare due (2) fiale per 48 determinazioni di adrenalina e 48 determinazioni di noradrenalina. La soluzione può essere torbida. Mescolare senza formare schiuma. Se è necessaria solo una parte della soluzione COMT, il resto della soluzione dev essere immediatamente congelata alla temperatura di -20 C. La soluzione COMT è stabile a queste condizioni per 1-2 mesi. 10.2.2. Derivatizzazione Enzimatica di Campioni, Standard e Controlli (Micropiastra) Se si misurano sia l adrenalina, sia la noradrenalina, è raccomandabile iniziare con la misurazione dell adrenalina. Se usate pipette a spostamento positivo, pipettate il fluido residuo nei pozzetti corrispondenti della piastra d estrazione, altrimenti gli estratti potrebbero non essere sufficienti per la determinazione della noradrenalina. E utile tenere la piastra d estrazione in posizione obliqua. Prima di usare i vassoi per microprovette, definire ed etichettare i pozzetti per Adrenalina e per Noradrenalina. 10.2.2.1. Per l uso ai fini della ricerca di omogenati di tessuti e supernatanti di colture cellulari raccomandiamo genericamente: Il lavoro con supernatanti di colture cellulari dipende dalla matrice e dalle concentrazioni previste. Secondo il protocollo dell urina (estrazione di almeno 20 µl di supernatante) si può prevedere una sensibilità all adrenalina di 0.3 ng/ml, alla noradrenalina di 0.6 ng/ml ed alla dopamina di 5 ng/ml per ogni campione diluito. Nel caso di una matrice con aggiunta di siero (FCS), il protocollo del plasma (estrazione di 500 µl di supernatante) si può applicare con le sensibilità corrispondenti al protocollo del plasma (vedi punto 16. PERFORMANCE). Per omogenati di tessuti, in fase di omogeneizzazione non si deve usare acido perclorico. Per ulteriori dettagli chiedere ad IBL. 10.2.2.2. Noradrenalina per urina e plasma 1. Pipettare 25 µl di Soluzione Enzimatica COMT preparata sul momento in ogni pozzetto della Piastra Microtiter. Agitare brevemente la piastra. 2. Pipettare 25 µl di Standard, Controllo e campione estratti nei rispettivi pozzetti. Durante questa fase immergere la punta del contagocce direttamente nella soluzione COMT. Il colore dventa rosa. Agitare brevemente la piastra. 3. Pipettare 50 µl di Antisiero Noradrenalina (di color azzurro) in ogni pozzetto. 4. Coprire la piastra con pellicola adesiva. Incubare per 120 min a TA (18-25 C) su un oscillatore orbitale (400 600 rpm). 5 ore Version 2014-12 5 / 9

5. Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 4 volte con 250-300 µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 6. Pipettare 100 µl di Coniugato Enzimatico appena preparato in ogni pozzetto. 7. Coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva. Incubare 60 min a TA (18-25 C) su un agitatore orbitale (400 600 rpm). 8. Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 4 x con 250-300 µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 9. Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali. Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento positivo ed evitare la formazione di bolle d aria. 10. Pipettare 200 µl di Soluzione Substrato PNPP in ogni pozzetto. 11. Incubare 40 min a TA (18-25 C) (senza foglio adesivo) su un agitatore orbitale (400 600 rpm). 12. Bloccare la reazione del substrato aggiungendo 50 µl di Soluzione Stop PNPP in ogni pozzetto. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 13. Misurare la densità ottica con fotometro a 405 nm (lunghezza d onda di riferimento: 620-650 nm) entro 60 min dopo aver dispensato la Soluzione Stop PNPP. Non si dovrebbero vedere bolle d aria. 11. PROCEDURA AUTOMATIZZATA 11.1. ISTRUZIONI PRE-TEST (versione automatizzata) Il contenuto del kit vale per 96 determinazioni e può essere suddiviso in 2 dosaggi separati. Durante l estrazione notevoli quantità di gel si possono separare dalla superficie della piastra di estrazione. Questo non influenza i risultati del test. Si deve evitare in ogni caso la contaminazione dell aria da parte di disinfettanti in polvere o in soluzione, usati per la pulizia di superfici o attrezzature, che contengano perossigeno, come ad esempio il VIRKON. Queste sostanze sono di notevole disturbo ai fini dell esecuzione. VIRKON è un marchio registrato di DuPont. 11.1.1. Diluizione dei Campioni I campioni con concentrazioni superiori al piú alto degli standard devono essere diluti secondo lo schema seguente: Campione da diluire con Note Plasma > standard più elevato acqua bidist. prima del processo di estrazione Urina > standard più elevato 0.1 N HCl prima del processo di estrazione 11.1.2. Estrazione di Campioni, Standard e Controlli (Piastra per Estrazione) (versione automatizzata) 1. Pipettare 30 µl di ogni Standard, Controllo e campione di urina e 750 µl di ogni campione di plasma nei rispettivi pozzetti della piastra di estrazione. Aggiungere 750 µl di acqua bidistillata in tutti I pozzetti eccetto quelli dei campioni di plasma per correggere le differenze di volume. 2. Pipettare 1000 µl di Tampone di Estrazione in ogni pozzetto. 3. Coprire la piastra con pellicola adesiva. Estrarre per 30 min a TA (18-25 C) su un agitatore orbitale (600-900 rpm). Durante l agitazione il liquido può bagnare il foglio adesivo ma il livello non deve superare mai i 2/3 del pozzetto. Gli schizzi non influenzano i risultati. 4. Rimuovere la pellicola adesiva. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. 5. Pipettare 2 ml di acqua bidistillata in ogni pozzetto. 6. Coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva. Agitare 5 min a TA (18-25 C) su un agitatore orbitale (600-900 rpm). Gli schizzi non influenzano i risultati. 7. Rimuovere la pellicola adesiva. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. Rimuovere completamente il fluido. 8. Pipettare 150 µl di Tampone di Estrazione in ogni pozzetto. Aggiungere per ciascun pozzetto 50 µl di Reagente di Acilazione. Mescolare immediatamente dopo la pipettatura. 9. Estrarre per 20 min a TA (18-25 C) (senza foglio adesivo) su un agitatore orbitale (400 600 rpm). Version 2014-12 6 / 9

10. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. Rimuovere completamente il fluido. 11. Pipettare 2 ml di acqua bidistillata in ogni pozzetto. 12. Coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva. Agitare 5 min a TA (18-25 C) su un agitatore orbitale (600-900 rpm). Gli schizzi non influenzano i risultati. 13. Rimuovere la pellicola adesiva. Svuotare immediatamente la piastra ed eliminare il liquido residuo su una salvietta di carta. Rimuovere completamente il fluido. 14. Pipettare 450 µl di Tampone di Rilascio in ogni pozzetto. 15. Agitare 30 min a TA (18-25 C) (senza foglio adesivo) su un agitatore orbitale (400 600 rpm). I campioni preparati devono essere dosati il giorno stesso. Se non è possible, coprire la piastra di estrazione con pellicola adesiva durante la notte mantenla ad una temperatura di 2-8 C. 11.1.3. Preparazione di componenti concentrati (versione automatizzata) Diluire / dissolvere I volumi indicati di seguito si riferiscono a un esecuzione con 6 strisce (48 determinazioni). Componente con Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità 50 ml WASHBUF CONC 450 ml acqua bidist. 1:10 Mescolare energicamente. 2-8 C 4 settimane 190 µl ENZCONJ CONC 9.5 ml WASHBUF (diluito) 1:51 11.2. PROCEDURA DEL TEST (versione automatizzata) 11.2.1. Preparazione della Soluzione Enzimatica COMT Preparare freschi ed utilizzare solo una volta. Mescolare senza formare schiuma. 18-25 C La Soluzione Enzimatica COMT dev essere preparata sul momento direttamente (max. 15 min) prima dell uso. Sciogliere ogni componente di COMT liofilizzato in 1.25 ml di acqua bidist. e mescolare il COMT sciolto.* Quindi pipettare 1.25 ml di Soluzione Coenzima seguiti da 1.25 ml di Tampone Enzima e 0.40 ml di COMT Additivo in ciascune delle fiale di COMT mischiato fino a raggiungere un volume finale di 4.15 ml di Soluzione Enzima COMT per fiala. Usare 1 fiala per 48 determinazioni di adrenalina. Se si misurano sia l adrenalina, sia la noradrenalina, abbinare due (2) fiale per 48 determinazioni di adrenalina e 48 determinazioni di noradrenalina. La soluzione può essere torbida. Mescolare senza formare schiuma. Se è necessaria solo una parte della soluzione COMT, il resto della soluzione dev essere immediatamente congelata alla temperatura di -20 C. La soluzione COMT è stabile a queste condizioni per 1-2 mesi. 11.2.1.1. Per l uso ai fini della ricerca di omogenati di tessuti e supernatanti di colture cellulari raccomandiamo genericamente: Il lavoro con supernatanti di colture cellulari dipende dalla matrice e dalle concentrazioni previste. Secondo il protocollo dell urina (estrazione di almeno 20 µl di supernatante) si può prevedere una sensibilità all adrenalina di 0.3 ng/ml, alla noradrenalina di 0.6 ng/ml ed alla dopamina di 5 ng/ml per ogni campione diluito. Nel caso di una matrice con aggiunta di siero (FCS), il protocollo del plasma (estrazione di 500 µl di supernatante) si può applicare con le sensibilità corrispondenti al protocollo del plasma (vedi punto 16. PERFORMANCE). Per omogenati di tessuti, in fase di omogeneizzazione non si deve usare acido perclorico. Per ulteriori dettagli chiedere ad IBL. 11.2.1.2. Noradrenalina per urina e plasma 1. Pipettare 25 µl di Soluzione Enzimatica COMT preparata sul momento in ogni pozzetto della Micropiastra. Scuotere piastra 1 min. 2. Pipettare 25 µl di Standard, Controllo e campione estratti nei rispettivi pozzetti. Scuotere piastra 1 min. 3. Pipettare 50 µl di Antisiero Noradrenalina (di colore azzurro) in ogni pozzetto. 4. Coprire la piastra. Incubare per 120 min a TA (18-25 C) su un oscillatore orbitale (400 600 rpm). 5 ore Version 2014-12 7 / 9

5. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 6 volte con 250-300 µl di Tampone Lavaggio diluito. 6. Pipettare 100 µl di Coniugato Enzimatico in ogni pozzetto. 7. Coprire la piastra. Incubare 60 min a TA (18-25 C) su un agitatore orbitale (400 600 rpm). 8. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 6 volte con 250-300 µl di Tampone Lavaggio diluito. 9. Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Substrato e Stop. 10. Pipettare 200 µl di Soluzione Substrato PNPP in ogni pozzetto. 11. Incubare 40 min a TA (18-25 C) su un agitatore orbitale (400 600 rpm). Se la temperatura del sistema automatico supera 25 C, abbreviare il tempo d incubazione a 30 minuti per evitare il superamento del segnale. 12. Fermare la reazione substrato aggiungendo 50 µl di Soluzione Stop PNPP in ogni pozzetto. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 13. Misurare la densità ottica con fotometro a 405 nm (lunghezza d onda di riferimento: 620-650 nm) entro 60 min dopo aver dispensato la Soluzione Stop PNPP. 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l uso. L utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d incubazione e metodi di lavaggio. 13. CALCOLO DEI RISULTATI Le DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messi in grafico contro la loro concentrazione (asse-x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard. Le concentrazioni dei campioni di urine e dei controlli del kit possono essere ricavate direttamente dalla curva standard. Poiché il volume del plasma pipettato è di 500 µl (versione automatizzata: 750 µl) contro i 20 µl (versione automatizzata: 30 µl) degli standard, i risultati dei campioni di plasma devono essere divisi per 25. Per le unità in pg/ml moltiplicare per 1000. In caso di campioni diluiti i valori devono essere moltiplicati per il corrispondente fattore di diluizione. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati. Calcolare l escrezione a 24 ore per ciascun campione: µg/24 h = µg/l x L/24 h Conversione: 1000 pg/ml = 1 ng/ml Noradrenalina (µg/l) x 5.911 = nmol/l Tipica Curva di Calibrazione (Noradrenalina) (Esempio. Non usare per il calcolo!) Standard Noradrenalin a (ng/ml) DO Media DO/DO max (%) A 0 0.223 0.0 B 5 0.322 6.7 C 15 0.539 21.3 D 50 0.984 51.2 E 150 1.438 81.8 F 500 1.708 100 (OD) 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 Noradrenalin ELISA 1 10 100 1000 (ng/l) Version 2014-12 8 / 9

14. VALORI ATTESI I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori: (5 % - 95 % percentile) Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento. Urina Plasma µg/giorni nmol/giorni pg/ml nmol/l Noradrenalina < 90 < 535 < 600 < 3.55 15. LIMITI DELLA PROCEDURA La raccolta dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli. Per le reazioni crociate vedere la sezione PERFORMANCE. I seguenti componenti del sangue non hanno effetto significativo (+/-20%) sui risultati del test fino ai livelli di concentrazione riportati in tabella: Emoglobina 2.0 mg/ml Bilirubina 1.0 mg/ml Trigliceridi 91 mg/ml 16. PERFORMANCE Sostanza Noradrenalina Adrenalina < 0.02 Specificità Analitica Cross-reattività di altre sostanze Noradrenalina 100 (Reattività Crociate) esaminate < 0.02 % Metanefrina < 0.002 Normetanefrina < 0.005 Sensibilità Analitica Urina 0.6 ng/ml (Limite di Rilevazione) Plasma 20 pg/ml Media (Zero-Standard) + 2SD Precisione Intervallo (ng/ml) CV (%) Intra-Saggio Urina 16 256 7.3 Plasma 0.560 12.83 7.4 Inter-Saggio Urina 15.4 391.5 12.1 Plasma 0.569 1.945 12.5 Intervallo (ng/ml) Diluizioni Seriali fino a Intervallo (%) Linearità Urina 5.1-423 1:32 85 115 Plasma 0.02 8.2 1:32 89-111 Non si rileva effetto gancio. Media (%) Intervallo (%) Recupero Urina 100.9 81 116 % Recupero dopo i picchi Plasma 97.5 83 111 Metodo di Paragone verso HPLC IBL = 0.75 x HPLC + 4.8 r = 0.945; n = 134 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Creces J., Appleton Ch.: Catecholamines and their Metabolites: Evaluation of a commercial ELISA. Clin. Biochem., QML Pathology, Brisbane QLD (2004) 2. Westermann J, Hubl W, Kaiser N, Salewski L, Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. Clin. Lab., 48: 61-71 (2002) Version 2014-12 9 / 9

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Tel.: +1 (416) 645-1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20