Studio sull ibridazione tra le specie Anisakis simplex s.s. e Anisakis pegreffii in aree di simpatria

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Timoteo Boscolo
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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PALERMO SCUOLA DELLE SCIENZE DI BASE ED APPLICATE CORSO DI LAUREA IN BIODIVERSITA ED EVOLUZIONE Studio sull ibridazione tra le specie Anisakis simplex s.s. e Anisakis pegreffii in aree di simpatria Relazione di tirocinio: Dott.ssa Giuseppa Musso RELATORE Prof. Mirella Vazzana CORRELATORE Dott. Vincenzo Ferrantelli Anno Accademico

2 Sommario Sommario... 1 Abstract... 2 Riassunto Introduzione Il phylum Nematoda Anisakiasi Legislazioni e regolamenti inerenti la tematica Anisakis Classificazione e caratteristiche della famiglia Anisakidae La presenza di ibridi nel Mediterraneo Scopo della tesi Materiali e metodi Aree di campionamento e metodologia Fasi di ricerca ed identificazione delle larve della famiglia Anisakidae Identificazione morfologica Identificazione biomolecolare Estrazione del DNA PCR Elettroforesi PCR-RFLP Sequenziamento Qualità della sequenza Risultati Verificare la presenza di ibridazione Frequenza di ibridi Frequenza di ibridi nella specie ospite Presenza di ibridi nella sub-zona FAO Presenza di ibridi nella sub-zona FAO Discussioni Bibliografia Ringraziamenti

3 Abstract Main purpose of this study is to check the presence of recombinant genotypes belonging to species Anisakis simplex s.s. and Anisakis pegreffii in a possible area of sympatry between the Mediterranean and the Atlantic Ocean. (sub-zone FAO and FAO ). Anisakis pegreffii and Anisakis simplex sensu stricto (s.s.) are two species of nematodes that despite belonging to the same complex (A. simplex latu sensu) within the family Anisakidae showed genetic differences, that not manifested morphologically, may be due to the ecological difference and geographical distribution. Anisakis pegreffi nematode is the most present in the Mediterranean, while A. simplex s.s. is distributed in a wider distribution area which includes the North Sea. This study has as its first objective an acknowledgment in health, highlighting the differences between the two species in the field of migration from the coelomic cavity to the muscle of the host and emphasizing this characteristic as a possible character for the risk analysis associated with eating raw fish. The presence of these parasites in migrant host fishes such as mackerel, it has determined the spread of Anisakis simplex s.s. from the Atlantic to Mediterraneo, resulting in a greater risk of Anisakiasis contamination as described by Cipriani and collaborators (2015). The term Anisakiasi refers to the parasitic zoonosis that the human contracts after accidental ingestion of third stage larvae of Anisakis spp., eating fishery products raw or subjected to processes such as salting, smoking and pickling. Furthermore another aim of this study will be the detection of recombinant genotype A. simplex/ pegreffii in analyzed fishes and evaluation of their possible migration from the Atlantic to the Mediterranean. Several studies have shown that the region ITS (ITS1 5.8S ITS2) of rdna it provides genetic markers for the accurate identification of Anisakis nematode. The samples that we analyzed are subjected to enzymatic restriction (PCR-RFLP) with two different restriction enzymes (HhaI e HinfI). The sequences recognized by the restriction enzymes are the following: HhaI: GCG C CGC G; HinfI: GANTC CTNA G. The digestion of the amplification ITS of nematodes larvae with HhaI shows the same pattern of restriction, while digestion with the enzyme HinfI is discriminant. The results were confirmed by sequence analysis, showing the presence of heterozygotes C/T at position 240 and 256 (C in A. pegreffii and T in A. simplex s.s.). 2

4 Riassunto Lo scopo principale di questo studio è stato quello di verificare la presenza e frequenza di ibridi Anisakis simplex s.s / Anisakis pegreffi in un area di simpatria tra Mediterraneo e Oceano Atlantico (sub-zona FAO e FAO ). Anisakis pegreffii e Anisakis simplex sensu stricto (s.s.) sono due specie di parassiti nematodi che, seppur appartenenti allo stesso complex (A. simplex sensu latu) all interno della famiglia Anisakidae, presentano delle marcate differenze genetiche. Tali differenze genetiche, non manifestate morfologicamente, possono essere riconducibili alla differente ecologia e distribuzione geografica. Anisakis pegreffi, è il nematode maggiormente presente in Mediterraneo; mentre A. simplex s.s. si distribuisce su un areale più ampio comprendente anche il Mar del Nord. Tale studio vuole avere in primis un riscontro in campo sanitario, poiché sono state evidenziate differenze nella migrazione delle due specie dalla cavità celomatica al muscolo negli ospiti ittici e tale caratteristica è ritenuta rilevante per l analisi del rischio associata al consumo di pesce crudo. La presenza di nematodi Anisakidi in ospiti ittici migranti come lo sgombro, ha determinato la diffusione di Anisakis simplex s.s. dall Atlantico al Mediterraneo, con un conseguente maggiore rischio di contrarre l Anisakiasi secondo quanto descritto da Cipriani e collaboratori (2015). Con il termine Anisakiasi viene indicata la zoonosi parassitaria che l uomo contrae a seguito dell ingestione di larve di terzo stadio di Anisakis spp., presenti in svariati prodotti della pesca consumati crudi, poco cotti o sottoposti a processi quali salagione, affumicatura e marinatura. La ricerca inoltre sarà utile nella rilevazione di genotipi ricombinanti A. simplex/ A. pegreffii nelle specie ittiche analizzate e nella valutazione di una loro possibile migrazione dall Atlantico al Mediterraneo. Diversi studi, infatti, hanno dimostrato che la regione ITS (ITS1 5.8S - ITS2) dell rdna fornisce marcatori genetici per l'identificazione accurata delle specie dei nematodi appartenenti al genere Anisakis. I campioni da noi analizzati sono stati sottoposti a restrizione enzimatica (PCR-RFLP) con due diversi enzimi di restrizione (HhaI e HinfI). Le sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione sono le seguenti: HhaI: GCG C CGC G; HinfI: GANTC CTNA G. La digestione con HhaI dell amplificato ITS mostra lo stesso pattern di restrizione, mentre la digestione con l enzima HinfI è discriminante. I risultati sono stati confermati con l analisi di sequenza, mostrando la presenza di eterozigosi in posizione 240 e 256 nei genotipi ricombinanti, i quali presentano un doppio picco corrispondente ai nucleotidi C/T, la citosina 3

5 in queste due posizioni è presente nella specie A. pegreffii, mentre la timina nella specie A. simplex s.s. 4

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