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1 3. METODOLOGIE UTILIZZATE 3.1 Riferimenti ai metodi utilizzati. Le metodiche che sono state utilizzate nello studio, sono le seguenti: Per le indagini biologiche è stato applicato l Indice Biotico Esteso, metodo Ghetti 1997; per le analisi chimiche e fisiche sono state impiegate le metodiche descritte in tab ; per le analisi microbiologiche sono state utilizzate le metodiche riportate in tab ; per le analisi citometriche è stato applicato un protocollo d analisi sviluppato nel laboratorio Chimico Biologico del S.O.I.S. Per le analisi della microfauna presente nelle vasche di ossidazione è stato seguito il metodo proposto da Madoni nel manuale d uso pubblicato nell ultima edizione del Per le portate è stato utilizzato il metodo area-velocità secondo le prescrizioni delle norme I.S.O. 748, e per il calcolo è stato utilizzato il software Q della Quantum Hydrometrie. Parametro ricercato Metodica utilizzata Matrice ph IRSA CNR Refluo impianto + acqua superficiale Materiali grossolani ---- Refluo impianto Materiali sedimentabili IRSA CNR Refluo impianto Materiali in sospensione IRSA CNR Refluo impianto + acqua superficiale Richiesta chimica di ossigeno IRSA CNR Refluo impianto + acqua superficiale (C.O.D.) Fosforo totale APHA S.M b4 d 1998 Refluo impianto + acqua superficiale Fosforo ortofosfato IRSA CNR Acqua superficiale Azoto ammoniacale IRSA CNR 4010 d 1994 Refluo impianto Azoto ammoniacale Kit Merck Acqua superficiale Richiesta biochimica di ossigeno APHA S.M b 1198 Refluo impianto + acqua superficiale (B.O.D. 5 ) Azoto nitrico APHA S.M NO 3 -b 1998 Acqua superficiale Azoto nitrico IRSA CNR Suppl. a Q 100 Refluo impianto Azoto nitroso IRSA CNR Suppl. a Q 100 Refluo impianto Conducibilità a 20 C IRSA CNR Acqua superficiale Temperatura aria Strum: Termometro Digitale Testo Acqua superficiale Temperatura acqua Strum: Sonda YSI 556MPS Acqua superficiale Ossigeno disciolto Strum: Sonda YSI 556MPS Acqua superficiale Tabella Metodiche relative alle analisi chimiche e fisiche. Parametro ricercato Metodica utilizzata Matrice Coliformi totali IRSA CNR 7010 B 1994 Coliformi fecali IRSA CNR 7020 B 1994 Refluo impianto + acqua superficiale Refluo impianto + acqua superficiale Escherichia coli IRSA CNR 7010 B Refluo impianto + acqua superficiale Streptococchi fecali IRSA CNR 7040 B 1994 Refluo impianto + acqua superficiale Tabella Metodiche relative alle analisi microbiologiche. 18

2 Per quanto riguarda i parametri chimici, fisici e batteriologici, la quantificazione della portata e le analisi della microfauna, sono stati eseguiti prelievi e relative analisi con frequenza mensile, mentre il rilevamento delle caratteristiche di qualità biologica dei corsi d acqua interessati, secondo l applicazione dell Indice Biotico Esteso, è stato effettuato con cadenza trimestrale secondo il D.Lgs. 152/99 e successive modifiche. Le analisi chimiche sono state effettuate sui reflui in ingresso ed in uscita all impianto, quelle chimiche e fisiche sulle acque superficiali che scorrono a monte ed a valle (circa m. dall uscita) rispetto allo scarico dell impianto di depurazione, mentre la ricerca dei parametri microbiologici elencati nella tabella , è stata eseguita rispettivamente, nei reflui di ingresso ed uscita e nelle acque superficiali presenti a monte ed a valle dello scarico del depuratore. Nelle tabelle e sono stati elencati anche i parametri macrodescrittori previsti dal D.Lgs. 152/99 e successive modifiche, per la definizione di qualità ambientale dei corsi d acqua, ed il conseguimento degli obiettivi sanciti dallo stesso decreto. La determinazione della portata dei corsi d acqua considerati, è stata effettuata misurando la velocità dell acqua in corrispondenza di sezioni (poste a monte o a valle rispetto allo scarico dell impianto) adeguate per la misura stessa, quali briglie artificiali o transetti convenienti. Le analisi per la determinazione della microfauna per il controllo della qualità degli impianti biologici di depurazione, sono state eseguite prelevando il fango attivo direttamente dalla vasca di ossidazione, nei pressi del ripartitore, e sottoponendolo ad analisi entro le cinque ore dal prelievo, secondo le prescrizioni del metodo seguito. In taluni casi, dal momento che veniva prelevato il fango direttamente dalla vasca di ossidazione, è stata eseguita anche l analisi microscopica dei batteri filamentosi presenti in quantità maggiore, che creavano problemi di foaming, anche leggeri, negli impianti di depurazione considerati Analisi chimiche e fisiche. Come è stato descritto nella tabella , molti sono stati i parametri chimici da noi considerati nell indagine in oggetto. Le analisi chimiche sono state condotte sia sui reflui in ingresso ed in uscita dall impianto, che sulle acque superficiali, considerando i punti a monte ed a valle rispetto all immissione, nel corso d acqua recettore, dello scarico del depuratore. I parametri chimici da noi considerati per ottenere una visione qualitativa sufficientemente approfondita delle possibili situazioni di inquinamento organico, sono stati i seguenti: B.O.D. 5 (Biochemical Oxygen Demand = Richiesta Biochimica di Ossigeno necessaria per ossidare le sostanze biodegradabili grazie all azione di microrganismi presenti): il suo elevato tenore indica la presenza di notevoli quantità di sostanze organiche biodegradabili; Conducibilità elettrica specifica: esprime la presenza di sali disciolti nell acqua, indipendentemente dall origine naturale (substrati geologici, copertura vegetale), od antropica (attività agricola, industriale); Azoto ammoniacale: presenze discrete di questo elemento nelle acque, sotto forma dello ione NH 4 +, avvengono generalmente per effetto di scarichi fognari o di acque provenienti da attività agricole; poiché l ammoniaca è il prodotto iniziale della decomposizione dei rifiuti organici contenenti azoto, la sua presenza indica che è in atto un evento inquinante vicino o recente; Fosfati: sono legati strettamente alle attività umane, il cui effetto si traduce in un aumento del tenore di ortofosfati, fisiologicamente assimilabili dalle piante e quindi responsabili del processo di eutrofizzazione; 19

3 ph = unità di misura dell attività idrogenionica: esso si calcola come il logaritmo negativo della concentrazione degli ioni idrogeno (H + ) liberi presenti nell acqua. La corrispondenza fra ph e ioni H + permette di definire campi corrispondenti, di acidità e basicità della soluzione misurata. Materiali grossolani: sono oggetti di dimensione lineare superiore ad 1 cm, qualsiasi sia la loro natura. Devono essere assenti in uno scarico in uscita da un impianto di depurazione. Materiali in sospensione: sono le sostanze presenti nell acqua sotto forma di particelle sospese e colloidali, che non sono filtrabili, cioè che hanno dimensioni tali da non permettere il passaggio attraverso membrana filtrante di porosità 0.45 µm. I solidi sospesi sono causa della torbidità dell acqua (inquinamento visibile). Materiali sedimentabili: rappresentano la frazione dei materiali in sospensione che, in tempi sufficientemente brevi (convenzionalmente 2 ore) possono raccogliersi sul fondo di un contenitore (cono Imhoff). C.O.D. (Chemical Oxygen Demand = Richiesta Chimica di Ossigeno): indica la quantità di ossigeno richiesta per ossidare chimicamente, con particolari modalità operative standardizzate, le sostanze ossidabili presenti nell acqua (reflua e non). Tale parametro individua non solo le sostanze organiche ossidabili biologicamente, ma anche le sostanze organiche non biodegradabili ossidabili solo chimicamente. Azoto nitrico: lo ione nitrato rappresenta lo stato di ossidazione finale dell azoto, in presenza di ossigeno. Esso è importante nei processi di eutrofizzazione, in quanto è un nutriente per le alghe e può contribuire ad una loro eccessiva crescita. Azoto nitroso: lo ione nitrito è uno stato di ossidazione intermedio dell azoto, e la sua presenza è indicativa di processi ossidativi in atto. E una specie tossica, perché interferisce con l emoglobina del sangue trasformandola in metemoglobina, che non funziona più come trasportatore di ossigeno. Sembra inoltre che lo ione nitrito sia implicato nella formazione delle nitrosamine, composti cancerogeni. Ossigeno disciolto: rappresenta la concentrazione di ossigeno molecolare che si trova allo stato di soluzione nell acqua. Tale concentrazione, a saturazione, varia fra 14.1 e 7.6 mg/l, con temperature variabili fra 0 e 30 C. Si tratta di una grandezza molto importante, in quanto la vita di tutti gli organismi aerobi presenti nell acqua è da essa condizionata. Temperatura dell acqua: è un parametro molto importante per i processi biologici, in quanto, entro certi limiti massimi di temperatura, tutte le reazioni biologiche, sia aerobiche che anaerobiche, sono accelerate da un suo aumento. Inoltre influenza la solubilizzazione dell ossigeno atmosferico nelle acque. Le indagini chimiche risultano utili in quanto in grado di fornire indicazioni precise e relativamente rapide sul tipo e sulle concentrazioni di vari inquinanti presenti in un determinato punto e momento nel corso d acqua, o nel refluo considerato. Purtroppo però la loro validità, come per le analisi batteriologiche, è limitata alle caratteristiche presenti in quel determinato punto e momento, senza nulla riuscire a dirci di un possibile inquinamento pregresso. Solo le analisi chimiche eseguite sui campioni medi in ingresso (sulle 24 ore), possono veramente dare una reale indicazione del carico inquinante che arriva ai diversi impianti di depurazione considerati. L utilizzo dell indagine biologica da un lato e la raccolta di un numero sempre più elevato di dati relativi ai parametri chimici sotto un altro profilo, permettono però di superare questo limite ed offrire un quadro più completo della qualità globale del corso d acqua indagato. 20

4 3.3. Analisi microbiologiche. L'indagine microbiologica di un corso d'acqua si pone sempre come presupposto iniziale per una valutazione del rischio igienico-sanitario a cui può andare incontro la popolazione che per motivi di lavoro o di svago abbia un contatto diretto con il corpo idrico. E'così entrato a far parte della comune pratica analitica l'impiego degli "indici batterici di inquinamento", di quei microrganismi cioè in grado di segnalare con la loro presenza i fenomeni di inquinamento di origine antropica o zoologica. Coliformi fecali, Escherichia coli, coliformi totali e streptococchi fecali, gli indicatori maggiormente utilizzati, non sono di norma germi patogeni ma si rinvengono costantemente ed in quantità elevatissime nel materiale fecale di origine umana ed animale, principale veicolo di diffusione degli agenti infettivi (i liquami domestici, per dare un esempio, possiedono cariche sull'ordine di 10 5 /10 7 U.F.C./100 ml o anche maggiori): sono quindi stati adottati come indicatori di inquinamento di origine fecale. La quantità di questi indicatori nelle acque permette quindi di avere un'idea sull'entità degli scarichi civili e/o zootecnici versati nel corso d'acqua e di valutare, mediante le stazioni poste longitudinalmente lungo l'asse del fiume, la capacità di persistenza di questi microrganismi qualora non sussistano nel frattempo ulteriori sversamenti. Per tali motivi in questo studio, analogamente alla qualità biologica e chimica delle acque, si è deciso di considerare i parametri microbiologici precedentemente descritti sia per valutare l inquinamento batteriologico delle acque superficiali, che per determinare l abbattimento batterico presente nei diversi impianti monitorati, considerando la carica batterica rilevata nello scarico in ingresso ed in quello in uscita dal depuratore. I coliformi fecali sono tipici del tratto intestinale degli animali a sangue caldo e soprattutto dell uomo: vengono eliminati con le feci e ritrovandosi in un ambiente, quello esterno, lontano dalle condizioni ottimali di crescita e riproduzione sono soggetti a fattori repressivi quali quelli di predazione, aggressione fisica (adsorbimento, flocculazione, sedimentazione, ecc.) e chimica che determinano una riduzione naturale della carica enterobatterica. Pertanto il rinvenimento in acque superficiali di questi microrganismi dà una sicura conferma di contaminazione fecale. Anche l indagine microbiologica, analogamente a quella chimica, risente dell istantaneità del campionamento e della eventuale disomogenea distribuzione dei batteri dovuta ad esempio alla presenza di materiale particolato in sospensione. E quindi necessario tener presente, nella valutazione dei risultati, la limitazione insita nei campioni di tipo istantaneo. La presenza in un acqua superficiale di coliformi fecali, infine, è da valutare come indice di fecalizzazione dell ambiente, con implicazioni di tipo igienico-sanitario piuttosto che di valenza ambientale, anche se per altri versi i due aspetti sono strettamente correlati Indice Biotico Esteso. Il mappaggio biologico di qualità, eseguito sui corsi d acqua appartenenti al bacino del Sarca, è stato realizzato mediante l'applicazione dell Indice Biotico Esteso (Ghetti, 1997). Scopo di tale indice è quello di formulare diagnosi della qualità di corsi d acqua, basate sullo studio delle modificazioni della composizione delle comunità di macroinvertebrati presenti nell acqua stessa, causate da fattori d inquinamento delle acque e dei sedimenti, o da significative alterazioni fisiche dell alveo bagnato. Poiché i macroinvertebrati considerati dall Indice, legati ai substrati degli alvei di acque correnti, sono composti da numerose popolazioni con diversi livelli di sensibilità alle variazioni ambientali, con differenti ruoli ecologici e trofici, e con cicli vitali relativamente lunghi, ne deriva che l I.B.E. rileva nel tempo lo stato di qualità dei tratti esaminati dei corsi d acqua, integrando gli effetti perturbanti di differenti cause (fisiche, 21

5 chimiche, biologiche). Infatti, la grande importanza nell'uso degli indicatori biologici, al fine di valutare lo stato qualitativo dei corpi idrici, sta nel fatto che gli altri indicatori (chimici, fisici e microbiologici), riescono sì a fornire una definizione dello stato dell'acqua in funzione soprattutto del suo uso antropico, ma questa serie di dati numerici ben difficilmente fornisce una precisa sequenza fotografica sullo stato di salute del corso d'acqua, salute intesa soprattutto come capacità, nel tempo, di consentire la vita nel fiume di tutti gli elementi costitutivi della sua biocenosi. Ciò è stato anche ribadito nel D.Lgs. 25/1/1992, n 130, in attuazione della Direttiva 78/659/CEE, sulla qualità delle acque dolci che richiedono protezione o miglioramento per essere idonee alla vita dei pesci. Tale Decreto infatti ha per oggetto tutte le acque dolci superficiali, correnti o stagnanti naturali, in cui vivono o possono vivere, qualora l'inquinamento fosse ridotto od eliminato, pesci appartenenti a specie indigene che presentano una diversità naturale o a specie la cui presenza è giudicata auspicabile per la gestione delle acque (art. 2). L'art. 8 contempla, ai fini di una più estesa valutazione della loro qualità, l'utilizzo dell'indice Biotico Esteso. La stessa importanza è stata ripresa dal D.Lgs. 152/99: ai fini della determinazione della qualità dei corsi d acqua vanno eseguite determinazioni sulla matrice acquosa e sul biota Sul biota le analisi di base per la valutazione degli impatti antropici sono valutati attraverso l Indice Biotico Esteso (I.B.E.). Tale analisi va eseguita obbligatoriamente stagionalmente (4 volte l anno). L'I.B.E si basa sullo studio delle comunità di macroinvertebrati bentonici, quegli invertebrati cioè che abitualmente popolano un corso d'acqua e appartengono principalmente ai gruppi faunistici degli INSECTA, CRUSTACEA, MOLLUSCA, IRUDINEA, TRICLADIDA e OLIGOCHETA. Fra alcuni degli evidenti vantaggi dell'uso degli indicatori biologici di qualità si possono evidenziare i seguenti: permettono una valutazione nel tempo degli effetti prodotti dall'inquinamento su un corso d'acqua; permettono di giungere a giudizi sintetici e facilmente comprensibili anche ai "non addetti ai lavori", con una semplice rappresentazione cartografica. Per eseguire i campionamenti si è fatto uso di retino immanicato con raccoglitore svitabile e rete in monofilo di nylon a 21 maglie/cm., occasionalmente integrato da prelievo manuale. I prelievi sono stati effettuati su transetti diagonali fra le due sponde; il materiale raccolto è stato separato direttamente in campo, dove si effettua una prima valutazione della struttura macrobentonica presente, in modo da procedere, se il caso lo richiede, ad ulteriori verifiche con altri prelievi. Terminate le operazioni di prelievo, tutto il materiale raccolto è stato stoccato in soluzione alcolica al 70% e trasportato in laboratorio per procedere alla classificazione dei macroinvertebrati raccolti, mediante l'uso dello stereomicroscopio ottico. Ottenuta la classificazione dei vari taxa presenti, il valore di I.B.E. è stato estrapolato mediante l'uso della tabella (tab ) a doppia entrata proposta dal metodo; ad ogni valore di indice infine viene fatta corrispondere una classe di qualità biologica che viene visualizzata in cartografia mediante colori diversi come indicato nella tabella

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7 , ! 44 52, !A B 0>!+!?+20?! +!*+0!>! ==** 2! A 0>!+!20!*++0?0!++!*=! ;!*! 2! A 0>!+!?+20?!+!*+ / 2!CA 0>!+!0+?+20?! 0++!*+ *2! 2!CA 0>!+!6*+!0!+!?+! 6*+!0!+!+!*+ * Tabella onversione dei valori di I.B.E. in Classi di Qualità con relativo giudizio e colore per la rappresentazione cartografica Le principali comunità macrobentoniche. I macroinvertebrati viventi nelle acque dolci rappresentano una componente della fauna acquatica estremamente importante, non soltanto per il numero di specie presenti, ma anche per il ruolo fondamentale che essi ricoprono in questi ecosistemi. Con il termine macroinvertebrati s intende quella componente animale bentonica la cui taglia supera il millimetro, rendendoli quindi ben osservabili senza l ausilio di strumenti ottici magnificatori, distinguendoli quindi dalla componente microscopica peraltro molto importante. I principali gruppi di macroinvertebrati presenti nelle acque correnti sono di seguito elencati: PLECOTTERI EFEMEROTTERI TRICOTTERI COLEOTTERI ODONATI DITTERI ETEROTTERI CROSTACEI GASTEROPODI BIVALVI TRICLADI IRUDINEI OLIGOCHETI 24

8 Plecotteri. I Plecotteri sono insetti emimetaboli (con metamorfosi graduale), fase larvale acquatica e stadio immaginale aericolo. Il corpo delle larve è allungato e depresso dorso-ventralmente, di dimensioni variabili comprese fra mm 5-50; il colore è bruno-grigio, talvolta rivestito di peli evidenti. Il capo presenta lateralmente due occhi composti e dorsalmente tre ocelli disposti a triangolo; l apparato boccale è di tipo masticatore. La parte terminale dell addome è munito di due sole lunghe appendici (cerci); la respirazione è cuticolare, spesso coadiuvata da tracheobranchie toraciche o anali. Trascorrono lo stadio larvale in ambienti acquatici caratterizzati da acque relativamente fredde e ben ossigenate. Vivono nascosti fra i ciottoli e la ghiaia dei fondali dei corsi d'acqua con particolare preferenza per le insenature oppure per le zone coperte da detriti vegetali e comunque in prossimità di microambienti dove la corrente è meno forte; popolano quasi esclusivamente la parte rhitrale dei fiumi e solo poche specie si rinvengono nelle zona potamale. All'interno dell'ecosistema possono ricoprire diversi ruoli trofici: a seconda delle specie possono essere carnivori, erbivori, o detritivori. Sono, fra tutti i macroinvertebrati, con pochissime eccezioni i più sensibili ai fenomeni dell'inquinamento e quindi indicatori di buona qualità dell'ambiente acquatico. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti ai generi Leutra, Protonemura, Nemoura, Anphynemura, Isoperla, Dinocras Efemerotteri. Sono insetti di piccole e medie dimensioni, aericoli allo stadio adulto e acquatici allo stadio larvale. Le ninfe hanno corpo subcilindrico, appiattito o affusolato, di colore estremamente variabile. Il capo presenta due occhi composti ben sviluppati, tre ocelli disposti a triangolo, antenne molto corte e sottili ed apparato boccale masticatore; la respirazione avviene attraverso tracheobranchie lamellari o filamentose disposte generalmente in posizione addominale. La principale caratteristica distintiva che ne permette il riconoscimento dai Plecotteri è rappresentata dalla presenza di tre prolungamenti caudali (due cerci ed un paracerco, tranne per Epeorus che è privo di paracerco). Le larve hanno ampia diffusione nella maggior parte degli ambienti d acqua dolce; colonizzano, infatti, grazie alla grande varietà di specie a diversa preferenza ecologica, laghi, stagni, paludi, grandi fiumi di pianura e rapidi torrenti di montagna. Nell'ecosistema fluviale ricoprono i ruoli trofici dei detritivori e degli erbivori, solo occasionalmente quelli dei carnivori; costituiscono una frazione consistente della biomassa animale dei corsi d'acqua, rivestendo una certa importanza nel bilancio energetico complessivo del sistema. Rappresentano inoltre un importante anello nella catena alimentare dell'ambiente fluviale essendo una delle componenti fondamenta1i della dieta di numerose specie ittiche. Gli Efemerotteri sono ottimi indicatori della qualità delle acque e molti taxa, in modo particolare quelli appartenenti alla famiglia degli Heptageniidae, si rivelano particolarmente sensibili all'inquinamento; meno sensibili si rivelano invece i taxa inclusi nelle famiglie dei Baetidae e Caenidae. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti ai generi Baetis, Ephemerella, Ecdyonurus, Rhithrogena, Epeorus, Habroleptoides. 25

9 Tricotteri. I Tricotteri costituiscono uno degli ordini più importanti fra gli insetti acquatici per ampiezza di diffusione in tutti gli ambienti d'acqua dolce sia correnti sia lacustri. Le larve presentano un capo con antenne poco sviluppate e un apparato boccale armato di denti e mandibole robuste; il torace è costituito da tre segmenti, diversamente sclerificati, con numero, estensione e forma variabili a seconda delle diverse famiglie; l'addome, per lo più cilindrico, può essere provvisto di filamenti respiratori. Le zampe sono ben sviluppate, presentano setole, speroni e spinale, munite di un'unghia che permettono alla larva di ancorarsi ai substrati. La caratteristica più nota della maggior parte dei Tricotteri è la costruzione di astucci; queste particolari strutture che fungono da rifugio e protezione delle larve, sono costruiti nelle più disparate forme e fogge, cementando con secrezione sericee i più svariati materiali presenti nell'alveo del fiume (sabbia, pietruzze, conchiglie ed anche materiali vegetali). I Tricotteri si distribuiscono lungo i corsi d'acqua secondo una tipica zonazione longitudinale, con specie orofile e stenoterme fredde, esclusive del tratto superiore, e specie del corso intermedio e inferiore; alcune specie, euriecie, possono trovarsi indifferentemente in biotopi diversi. Lo spettro della specializzazione ecologica è molto ricco e differenziato, con altrettanti ruoli trofici: esistono infatti taxa detritivori, carnivori ed erbivori. La sensibilità all'inquinamento è mediamente elevata, per cui questi insetti sono validi indicatori biologici. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti alle famiglie HYDROPSYCHIDAE, LIMNEPHILIDAE, RHYACOPHILIDAE, SERICOSTOMATIDAE, ODONTOCERIDAE Coleotteri. I Coleotteri sono i soli insetti olometaboli che possono avere vita sia larvale sia adulta nell'ambiente acquatico. Gli adulti sono facilmente riconoscibili per la presenza di elitre, ali rigide chitinose, che formano una sorta di astuccio protettivo che ricopre il dorso, proteggendo anche le ali posteriori di natura membranosa. Vivono in immersione e, in generale, prediligono le acque stagnanti, con velocità di corrente ridotta e bassa profondità, soprattutto dove abbondano la vegetazione acquatica e i detriti vegetali dove, a seconda dei vari taxa, possono muoversi nuotando (Dytiscidae, Haliplidae) o camminando saldamente ancorati al fondo del fiume, grazie alla presenza di robuste unghie (Dryopidae, Elmidae). Le forme larvali sono molto diverse rispetto all'adulto; presentano un capo ben differenziato, occhi semplici, antenne corte e pluriarticolate ed inoltre integrano la respirazione cutanea mediante lamelle branchiali assenti nelle forme adulte. La riproduzione avviene generalmente nel periodo primaverile ma in taluni casi prosegue sino ad estate inoltrata; a seconda delle diverse famiglie le uova possono essere deposte direttamente nel corso d'acqua oppure in luoghi limitrofi, in ambienti riparati e spesso ricoperte con foglie morte. I ruoli trofici occupati dai coleotteri sono vari: carnivori, erbivori (raschiatori, collettori, tagliuzzatori), onnivori e detritivori. I coleotteri sono discretamente sensibili all'inquinamento anche se il loro valore di indicatori è nettamente inferiore a quello dei gruppi descritti in precedenza. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti alle famiglie DYTISCIDAE, ELMIDAE, HYDRAENIDAE. 26

10 Odonati. Sono insetti emimetaboli di medie o grandi dimensioni genericamente conosciuti con il nome di libellule. Le larve, come gli adulti, si distinguono da qualsiasi altro insetto acquatico per la presenza di una maschera boccale, organo derivato dalla modificazione del labbro inferiore ed articolato, terminante ad uncini con funzione di afferrare le prede. Il capo è molto grande con occhi composti ben sviluppati, un torace e un addome con appendici fortemente sclerificate; le larve, a differenza degli adulti, hanno colori poco vivaci che variano dal gialloverde al bruno; la lunghezza varia da cm 1,5-5,5. Le larve vivono preferenzialmente in acque tranquille, caratterizzate da bassa velocità di corrente; alcuni generi vivono affossati nel fango oppure si muovono lentamente sulla superficie del fondo del corso d'acqua mentre altri prediligono nascondersi fra la vegetazione acquatica. Gli Odonati sono predatori: si appostano immobili e attendono le vittime costituite principalmente da Gasteropodi, Crostacei, Insetti, girini, avannotti ed anche consimili. La fase larvale negli Odonati può durare a lungo; esistono infatti specie caratterizzate da ciclo univoltino (una generazione all'anno), semivoltino (una generazione ogni due anni) ed addirittura, nel caso di alcune specie di Anisotteri che colonizzano corsi d'acqua alpini, una generazione può condurre vita larvale anche per un periodo di quattro o cinque anni (poliannuale). Generalmente la presenza di Odonati si collega a situazioni intermedie di inquinamento, essendo assenti sia nelle acque oligotrofe sia in quelle fortemente inquinate Ditteri. Sono insetti olometaboli, con ali membranose ed apparato boccale atto a pungere o a lambire allo stadio adulto; sono generalmente vermiformi, privi di zampe articolate ma con organi di locomozione o adesione quali pseudopodi, cuscinetti ambulacrali, uncini, setole e dischi allo stadio larvale. Le larve di questi insetti non somigliano affatto all adulto e la loro vita si svolge in habitat del tutto diversi. Occupano una vastissima gamma di ambienti, dai corsi d'acqua con alta concentrazione di ossigeno, a quelle stagnanti o semiterrestri, fino alle acque sporche di tipo cloacale o addirittura liquami. La tendenza ad occupare una gamma molto vasta di biotopi non dipende solo dal regime alimentare ma anche dai meccanismi di respirazione. Le larve dei ditteri che respirano l'ossigeno disciolto nell'acqua (Simuliidae) occupano un numero minore di ambienti di quelle che respirano direttamente l'aria atmosferica o che utilizzano pigmenti respiratori atti a sopravvivere in condizioni di carenza di ossigeno (sono tipici indicatori di inquinamento organico). I Ditteri coprono i ruoli trofici dei carnivori, degli erbivori e dei detritivori, vivono quindi in zone diverse del corpo idrico. Trattandosi di un gruppo sistematico molto vasto esistono al suo interno famiglie con caratteristiche diverse dal punto di vista della sensibilità agli inquinamenti: alcune famiglie vivono esclusivamente su substrati consistenti e duri in acque correnti fredde molto ossigenate, necessariamente di buona qualità (Blephariceridae), altre specie invece prosperano su substrati molli in condizioni di forte polluzione e la loro presenza è sintomo di profonda alterazione ambientale (Syrphidae, Chironomidae genere Chironomus). Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti ai generi ATHERICIDAE, CERATOPOGONIDAE, CHIRONOMIDAE, EMPIDIDAE, LIMONIIDAE, SIMULIIDAE, TIPULIDAE Crostacei. I Crostacei sono artropodi presenti nelle acque dolci con un numero limitato di famiglie. Nelle acque correnti colonizzano acque sia superficiali che sotterranee, prediligono corsi d'acqua con velocità di corrente lenta o moderata ed a seconda delle famiglie dimostrano predilezione per ambienti dal fondo ghiaioso o 27

11 fangoso. Sono caratterizzati generalmente dalla presenza del carapace e da un'organizzazione del corpo a segmenti; i segmenti cefalici sono sempre fusi tra di loro, spesso anche con quelli toracici, che portano inoltre numerose appendici. Il capo presenta antenne, antennule e tre paia di appendici orali; gli occhi sono composti peduncolati o sessili. Alla classe dei Crostacei, ordine Isopoda, appartiene la famiglia degli Asellidae, l'unica presente nelle acque correnti. Gli Asellidae risultano in grado di sopravvivere anche in presenza di forti carichi inquinanti di natura organica dove, anzi, prosperano e formano popolazioni particolarmente abbondanti. All'ordine Anphipoda appartiene invece la famiglia dei Gammaridae. Le specie d'acqua dolce di questa famiglia colonizzano, oltre a laghi e stagni ricchi di alghe e macrofite, i tratti medio-inferiori dei corsi d'acqua con velocità di corrente non eccessiva. I Gammaridae sono discreti indicatori di qualità, anche se sopportano moderati carichi inquinanti, soprattutto se di natura organica. All'ordine Decapoda appartengono le famiglie Atyidae, Palaemonidae, Astacidae, Potamidae; fra queste particolarmente valida come indicatrice di qualità è Astacidae, che esige acque correnti, limpide e ben ossigenate e priva di polluzione. Alla famiglia degli Astacidae appartiene il gambero di fiume molto abbondante fino a qualche decennio fa in molti corsi d'acqua della Provincia. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti alle famiglie ASELLIDAE, GAMMARIDAE Gasteropodi. I Gasteropodi sono molluschi diffusi in moltissimi ecosistemi terrestri ed acquatici. Sono provvisti di una conchiglia con un caratteristico avvolgimento a spirale in cui alloggia il corpo dell'animale composto da un capo, che porta i tentacoli, gli occhi e la bocca, il piede che è l'organo della locomozione, il sacco viscerale ed il mantello che delimita la cavità palleale e secerne la conchiglia. Il ruolo trofico dei molluschi è quello tipico di organismi erbivori, spesso brucatori che raspano il periphyton o le macrofite dai ciottoli grazie alla loro lingua chitinosa detta radula, provvista di denti simili ad una lima. I Gasteropodi di acqua dolce sono organismi bentonici che colonizzano un'ampia varietà di ambienti; si rinvengono infatti sia in ambienti tipicamente lotici che in ambienti lentici di fondovalle o di pianura; alcuni generi prediligono vivere adesi a substrati solidi (Ancylus) mentre altri prediligono ambienti nettamente fangosi (Viviparus). I Gasteropodi sono buoni indicatori in virtù delle caratteristiche biologiche: cicli vitali relativamente lunghi e scarsa mobilità, rendono loro impossibile sottrarsi alle cause esterne di alterazione. Sono decisamente sensibili all'inquinamento di tipo chimico ed in particolar modo ai fenomeni di polluzione che alterano il ph delle acque: tale modificazione può comportarne la scomparsa o quantomeno l'inibizione dell'attività riproduttiva; sono inoltre molto sensibili agli inquinamenti dovuti a metalli pesanti in particolar modo a cadmio, mercurio, argento, piombo, zinco e soprattutto rame (entra a far parte della composizione di molti erbicidi e pesticidi). Per quanto riguarda l'inquinamento di natura organica la loro sensibilità si rivela invece minore ed alcune specie possono trarre giovamento, ovviamente fino ad un certo limite, da un aumentata disponibilità di materia organica Bivalvi. I Bivalvi sono molluschi il cui corpo compresso lateralmente (si notano i lobi del mantello, le lamine branchiali e il sacco viscerale col piede) è protetto da una conchiglia formata da due pezzi o valve, spesso simmetriche e articolate da una cerniera. 28

12 La conchiglia si presenta in varie forme, ma generalmente è tondeggiante oppure ovoidale; le dimensioni variano da qualche millimetro a qualche decimetro di lunghezza. I Bivalvi, il cui ruolo trofico è principalmente erbivoro o detritivoro, sono animali filtratori: le particelle organiche sospese vengono filtrate dalle branchie, agglutinate in boli mucosi e avviati alla bocca. Molto diffusi nell'ambiente marino, popolano anche le acque dolci dove vivono generalmente affossati nel fango da cui lasciano fuoriuscire solo l'estremità posteriore con le aperture inalante ed esalante. Le famiglie presenti nelle acque dolci italiane sono quattro e comprendono in tutto solamente sette generi. Fra queste gli Unionidae, famiglia che comprende i generi Unio e Anodonta, colonizza laghi e fiumi in corrispondenza di zone con fondali fangosi; presenta un alto grado di adattabilità ecologica potendo sopravvivere anche in ambienti molto inquinati come corsi d'acqua che accolgono scarichi industriali: sono quindi ottimi indicatori per svelare la presenza di inquinamenti dovuti a metalli pesanti che vengono concentrati nelle loro cellule. I Pisidium (famiglia Pisidiidae) prediligono invece i fondali sabbiosi-fangosi di sorgenti, laghi e torrenti con acque molto limpide e tranquille, mentre gli Sphaerium (famiglia Sphaeridae) abitano preferibilmente le acque correnti Tricladi. I Tricladi, conosciuti genericamente come planarie, sono organismi caratterizzati dall'avere un corpo fortemente appiattito, ovale e molle, non segmentato e privo di arti. Sono organismi carnivori, si nutrono di piccoli invertebrati come larve di Insetti, Gammaridi, Asellidi, Gasteropodi e Anellidi. Colonizzano un gran numero di ambienti, dalle sorgente montane in quota sino alle acque lentiche della pianura dove, a seconda dei generi, soggiornano sotto le pietre, tra il fango o fra i detriti vegetali. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti ai generi Dugesia, Crenobia e Policelis Irudinei. Gli Irudinei (conosciuti comunemente con il nome sanguisughe ) vivono prevalentemente in acque dolci anche se possono tuttavia essere presenti in ambienti marini o terrestri. La maggioranza delle specie si trattiene in acque poco profonde in microhabitats a velocità di corrente ridotta e ricche di sostanza organica. Hanno un corpo allungato, appiattito o cilindrico di lunghezza variabile fra cm 1-20, suddiviso in segmenti, in genere privo di appendici e setole. La parte anteriore del corpo è trasformata in ventosa boccale, che serve come apparato succhiatore, mentre l'estremità posteriore forma una ventosa più ampia e discoidale destinata all'adesione. Sul dorso sono frequenti serie trasversali di minuscole papille sensoriali; a circa un terzo del corpo si trova la regione clitellare sul cui lato ventrale si aprono i gonopori: la distanza tra essi è un carattere molto importante per la determinazione sistematica. Le sanguisughe abbondano in acque con fondali ciottolosi, ghiaiosi o con detriti coperti di vegetazione sommersa, anziché sabbiosi o fangosi, poco adatti al funzionamento delle ventose, da cui dipende la locomozione. Molti Irudinei sono comunque abili nuotatori, come ed esempio i generi Erpobdella e Piscicola. Tutti gli Irudinei sono carnivori; la maggior parte delle specie si nutre di alimenti liquidi come fluidi corporei di molluschi, crostacei, altri invertebrati, pesci oppure sono predatrici di larve di insetti, Oligocheti e molluschi. La resistenza all'inquinamento è generalmente elevata: alcune specie possono vivere a lungo in carenza di ossigeno e con condizioni di elevata trofia dell'ambiente acquatico. 29

13 In ambienti lentici caratterizzati da forte inquinamento organico si rinvengono spesso popolazioni numerosissime di Irudinei associate ad enormi popolazioni di Crostacei Asellidae che costituiscono una delle basi della loro dieta alimentare. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti ai generi Dina, Glossiphonia ed Elobdella Oligocheti. Gli Oligocheti sono vermi di corpo cilindrico a simmetria bilaterale, molto allungato, con segmentazione ben visibile. Gli Oligocheti, ad eccezione di poche specie carnivore, sono detritivori e si nutrono di materiale organico in decomposizione. Alcune specie, dette fossorie, vivono con la parte anteriore infossata nel fango che ingeriscono in gran quantità e di cui utilizzano la parte organica come nutrimento. Vivono praticamente in tutti gli ambienti dalle acque stagnanti ai laghi, dai fiumi lentici con fondali fangoso-sabbiosi ed abbondante vegetazione acquatica ad acque francamente correnti con substrati litici. Certe specie tollerano livelli elevati di inquinamento ed addirittura se ne avvantaggiano formando colonie numerosissime in ambienti molto degradati. Nelle acque della Provincia si rinvengono con una certa regolarità taxa appartenenti alle famiglie LUMBRICIDAE, LUMBRICULIDAE, NAIDIDAE, TUBIFICIDAE Gruppi minori. Oltre a quelli illustrati nelle pagine precedenti altri gruppi di macroinvertebrati, presenti nelle acque interne, sono oggetto di studio nell'analisi della qualità biologica delle acque; fra questi i più importanti sono gli ETEROTTERI ed i MEGALOTTERI. Gli ETEROTTERI sono insetti paurometaboli, dove le neanidi, fin dal primo stadio larvale sono simili agli adulti atteri. Gli Eterotteri acquatici prediligono le acque stagnanti vivendo nelle paludi, nelle pozze, nei laghi, nei punti con velocità di corrente ridotta dei torrenti e nelle anse calme dei fiumi; sono per la maggior parte zoofagi, predando ragni, acari, comprese le uova e le larve. Da un punto di vista ecologico gli Eterotteri non sono mai rilevanti come indicatori di qualità; la loro presenza assume importanza solamente quando associata ad altri gruppi sistematici maggiormente significativi nei termini di sensibilità agli inquinanti, nel qual caso gli Eterotteri contribuiscono al numero totale delle unità sistematiche considerate nella definizione della struttura di comunità. I MEGALOTTERI sono insetti che trascorrono lo stadio larvale in ambiente acquatico; le larve presentano un capo grosso ben differenziato, occhi semplici con mandibole ricurve e dentate; il torace sclerificato e di colore rossastro ha zampe articolate; l'addome, senza pigopodi, evidenzia oltre alle tracheobranchie laterali, un lungo filamento respiratorio terminale. Non sono molto frequenti Analisi della microfauna del fango attivo. La comunità biotica degli impianti biologici di depurazione è composta da diversi gruppi tassonomici quali batteri, protozoi (flagellati, amebe, ciliati), funghi, alghe, rotiferi, nematodi ed altri metazoi. Tuttavia la taxocenosi costituita dai Protozoi ciliati è comunemente ritenuta la più adatta a rappresentare, con buona sensibilità, le variazioni di equilibrio indotte nella vasca di ossidazione dell impianto. Questo perché: numerose specie sono sensibili alle variazioni ambientali e reagiscono prontamente; esiste una conoscenza abbastanza approfondita del ruolo svolto dai protozoi nella rete trofica di questi ecosistemi; 30

14 i Protozoi, predando essenzialmente i batteri, non sono condizionati in questi ambienti dal cibo come fattore limitante; le loro cisti possono essere trasportate a grandi distanze e ciò li rende organismi potenzialmente cosmopoliti; gli indici basati sui Protozoi ciliati hanno avuto in letteratura più ampia diffusione rispetto ad altri indici. Le numerose ricerche effettuate sulla biologia della depurazione negli ultimi anni, hanno chiarito l importante ruolo svolto dai Protozoi in questi sistemi biotecnologici, ed hanno permesso di dividere i componenti della microfauna in gruppi positivi e negativi. Ma prima di descrivere in dettaglio i gruppi costituenti la microfauna stessa, ed addentrarci nel significato e nell applicazione del metodo previsto dall Indice Biotico dei Fanghi, approfondiamo la nostra conoscenza dei Protozoi I Protozoi. Con il termine Protozoi (più corretto sarebbe chiamarli Protisti) si indicano organismi eucariotici unicellulari che, pur non rappresentando un gruppo naturale, mostrano strutture cellulari tipiche. Essi, da taluni trattati come unico Phylum del regno Animalia, mentre da altri suddivisi in un numero variabile di Phyla all interno del regno dei Protisti, sono stati divisi dalla Società Internazionale di Protozoologia nel 1980 in quattro gruppi principali: Flagellati, Sarcodini, Sporozoi e Ciliati. I Protozoi, appunto perché unicellulari, hanno dimensioni che vanno dai 10 ai 100 µm. In molti Flagellati e nei Ciliati il corpo è rivestito da una resistente cuticola, che costituisce la membrana cellulare. Inoltre vi sono degli organelli (organiti) di movimento che sono i flagelli nel caso dei Flagellati e le ciglia nel caso dei Ciliati. I primi, presenti in una o poche unità per organismo, sono lunghi e mobili prolungamenti protoplasmatici con movimenti paragonabili a quelli di una frusta quando viene agitata. Le ciglia sono invece corte appendici protoplasmatiche che sporgono come sottili setole sul corpo dei Ciliati e si muovono come tanti piccoli remi. Alcuni Protozoi, come i Sarcodini, presentano un corpo nudo, che può emettere e retrarre degli speciali prolungamenti citoplasmatici (pseudopodi), atti alla locomozione. I Protozoi si riproducono, di regola, agamicamente per scissione; tuttavia esistono per molti di essi, soprattutto per i Ciliati, fenomeni sessuali. Essi sono organismi la cui cellula è dotata di uno o più nuclei di un solo tipo (nei Flagellati e nei Sarcodini) o di due tipi (micro- e macronuclei nei Ciliati), aventi diverse funzioni. La maggior parte dei Protozoi svolge attività eterotrofica, predando altri organismi o alimentandosi di sostanze organiche disciolte o particellate; tuttavia vi sono diversi Flagellati (Fitoflagellati) nel cui citoplasma si trovano numerosi plastidi che consentono loro di svolgere attività autotrofica. I Protozoi eterotrofici si nutrono per osmosi (molti Flagellati), per mezzo di pseudopodi (amebe) o per mezzo di un apertura nella membrana cellulare (Ciliati) che consente loro di predare altri organismi. Si accennava prima alla distinzione, per quanto riguarda la qualità depurativa negli impianti biologici di depurazione, fra gruppi positivi e negativi. I gruppi positivi sono rappresentati dai Ciliati mobili di fondo, dai sessili e dalle amebe con teca. I gruppi negativi sono i piccoli Flagellati, i Ciliati natanti ed i peritrichi Vorticella microstoma ed Opercularia spp. Densità e diversità della microfauna, inoltre, sono risultate essere correlate con la performance dell impianto (Madoni P., 1994) Densità e diversità. E stato dimostrato che il numero di Protozoi Ciliati che vivono in un impianto funzionante in modo adeguato, è dell ordine di 10 6 individui per litro. Quando il loro numero scende al di sotto di 10 4 per litro, 31

15 siamo in una situazione di insufficiente depurazione, e si osserva un intensa proliferazione di batteri dispersi che provocano un aumento di B.O.D. e di torbidità nell effluente. Un alto numero di Ciliati (>10 7 /litro), al contrario, indica una buona depurazione ed un ottima performance. La microfauna di un impianto che funziona in modo ottimale, è sempre altamente diversificata, cioè composta da differenti gruppi di organismi, ciascuno dei quali presenti con diverse specie. Nessun gruppo o specie domina sugli altri componenti della microfauna, anche se i rapporti tra i vari gruppi o specie possono variare. Al contrario, una microfauna che è dominata da una specie o gruppo, è quasi sempre indice di disfunzioni trofiche dovute all azione di fattori limitanti che impediscono lo sviluppo della maggior parte di specie, favorendo quello delle forme più tolleranti a quei fattori. I comuni fattori limitanti sono generalmente la presenza di sostanze tossiche nel liquame in ingresso, un carico organico troppo forte o troppo debole, forte estrazione o perdita di fango, carenza di ossigenazione. Infatti, analisi statistiche applicate allo studio dei Ciliati ed alle variabili fisico-chimiche in impianti a fanghi attivi, hanno dimostrato che il numero e la diversità delle comunità ciliate cambia in relazione alla qualità del liquame in ingresso all impianto ed alle condizioni gestionali Ciliati mobili di fondo e sessili. Questi due gruppi di Ciliati normalmente co-dominano la microfauna dei fanghi attivi. Ciò è dovuto alla diversa nicchia ecologica da loro occupata che previene una loro possibile competizione. Tuttavia il rapporto di abbondanza tra i due gruppi tende a cambiare con il carico del fango. I mobili di fondo diminuiscono, infatti, all aumentare del carico organico, tanto che oltre i 0.6 kgb.o.d./kgmlss x d, molte specie di questo gruppo scompaiono. I Ciliati mobili di fondo sembrano essere inversamente correlati anche allo SVI Amebe con teca. Nei fanghi attivi le amebe con teca sono presenti normalmente, con tre generi: Arcella, Difflugia ed Euglypha. Questi Protozoi colonizzano il fango di impianti funzionanti a basso carico del fango, in particolare essi caratterizzano normalmente il fango delle vasche di aerazione di impianti che operano la rimozione dell azoto. Le amebe con teca sono molto abbondanti o dominanti nei fanghi caratterizzato da basso carico, lungo tempo di ritenzione ed alta concentrazione di ossigeno disciolto in vasca, condizioni che permettono di ottenere una completa nitrificazione. Sotto tali condizioni, la qualità dell effluente è eccellente e la performance biologica dell impianto raggiunge i massimi valori. Diversi studi hanno dimostrato un alta correlazione fra la presenza ed abbondanza di amebe con teca ed alcuni parametri gestionali, compresi quelli caratterizzanti la nitrificazione (Madoni P., 1994). Queste specie sono infatti associate a bassi valori di ammoniaca, alte concentrazioni di ossigeno disciolto, basso carico del fango e modesti valori di SVI Ciliati sessili (>80%). I Ciliati peritrichi sono normalmente co-dominanti nei fanghi attivi. Tuttavia, in occasione di condizioni transitorie dell impianto che riducono l efficienza depurativa, questi Ciliati possono incrementare repentinamente la loro densità numerica e rappresentare oltre l 80% dell intera microfauna. Tali condizioni transitorie sono: rapido aumento del carico del fango dovuto a perdite o ad estrazioni del fango; carico organico immesso in modo molto discontinuo. 32

16 I Ciliati sessili sono in grado di svilupparsi entro un largo spettro di carico di fango; tuttavia, a valori compresi fra 0.3 e 0.6 KgB.O.D./kgMLSS x d, questi Ciliati spesso dominano la microfauna e, fra 0.6 e 0.9 KgB.O.D./kgMLSS x d, essi co-dominano assieme ai Flagellati. Il rapporto di abbondanza tra Ciliati mobili di fondo e sessili sembra essere associato alla performance dell impianto. La migliore qualità dell effluente finale sembra infatti essere ottenuta in occasione di valori di tale rapporto superiore a 0.5. Tra i Ciliati sessili vi sono alcune specie come Vorticella microstoma ed Opercularia spp., che possono sopravvivere e crescere in fanghi attivi sottoposti a condizioni ambientali critiche (carenza di ossigenzione, input di sostanze tossiche, ecc.). Quando queste specie sono presenti in densità elevate, esse devono essere considerate separatamente dalle altre forme sessili Opercularia spp. E abbastanza normale rinvenire modeste quantità di questi Ciliati sessili nel fango attivo, ma tuttavia, Opercularia spp. mostra una stretta associazione con le variabili concernenti la qualità del fango attivo, confermando che tale Ciliato è un valido indicatore biologico, in quanto il suo numero aumenta quando il fango è in cattive condizioni. Infatti, è stato osservato che Opercularia spp. è associata ad effluenti con alte concentrazioni di B.O.D., e che queste specie sono tra le forme più abbondanti osservate in fanghi sottoposti ad alti carichi. Inoltre, tale Ciliato è in grado di sopravvivere meglio di altri Protozoi, in ambienti stressati (bassa concentrazione di ossigeno, presenza di sostanze tossiche) Vorticella microstoma. Questa specie, indicata come polisaprobica, è frequentemente presente nel fango attivo durante la prima fase di colonizzazione, e viene poi sostituita da altre specie (es. Vorticella convallaria) che diventano le forme dominanti durante la fase stabile. In caso di drastiche e prolungate riduzioni nella concentrazione di ossigeno in vasca di aerazione, si osserva l alternanza fra queste due specie, dovuta al loro differente gradi di tolleranza alla carenza di ossigeno. Vorticella microstoma perciò, è un valido indicatore di carenza di ossigeno in vasca di ossidazione. Massiccie crescite di questo Ciliato sessile sono state osservate in vasche di aerazione anche in occasione di alti flussi di liquame in ingresso e di effluenti di scarsa qualità. E stata osservata anche una elevata abbondanza di Vorticella microstoma in occasione di bassi valori di DO, MLSS, ed alti valori del carico del fango e di SVI Ciliati natanti. I Ciliati batteriofagi natanti sono normalmente molto abbondanti nel liquame e colonizzano la vasca di aerazione durante la fase iniziale di messa in funzione dell impianto, quando i batteri fiocco formatori sono ancora scarsamente presenti e conseguentemente i Ciliati sessili sono ancora assenti. Quando questi ultimi compaiono, si instaura una competizione per la predazione dei batteri dispersi nel mixed liquor. I Ciliati sessili, infatti, sono dei filtratori molto più efficienti dei Ciliati natanti nel convogliare i batteri dispersi nella regione orale per mezzo delle correnti ciliari. Un impianto a fanghi attivi produce un effluente di alta qualità quando il fango è dominato dalle forme sessili e mobili di fondo; quando dominano i Ciliati natanti, tuttavia, la qualità dell effluente è scarsa, e diventa pessima quando i Ciliati sono del tutto assenti. Piccoli Ciliati natanti (come Colpidium, Cyclidium, Tetrahymena ed Uronema) talvolta dominano la microfauna di impianti che operano ad età del fango troppo breve oppure ad alti carichi del fango in carenza di ossigenazione. Questi Ciliati batteriofagi rivhiedono alte concentrazioni di batteri dispersi per 33

17 sopravvivere ma resistono meglio di altri componenti la microfauna agli affluenti tossici ed alla carenza di ossigenazione. I piccoli Ciliati natanti si osservano sempre insieme ai piccoli Flagellati e talvolta questi due gruppi dominano la microfauna. Deve essere sottolineato che a questo gruppo appartengono solo i Ciliati batteriofagi; forme natanti carnivore, quali Amphileptus, Litonotus, ecc. non devono essere inseriti in questo gruppo Flagellati. I piccoli Flagellati eterotrofici (come Bodo, Tetramitus e Polytoma) normalmente dominano la microfauna durante la fase di avvio dell impianto quando i batteri fiocco formatori sono ancora scarsamente presenti. Questi Flagellati si nutrono di batteri dispersi e nel tempo sono sostituiti dai Ciliati batteriofagi. Al contrario, la massiccia presenza di questi Protozoi in un fango maturo è associata ad una cattiva performance biologica dell impianto, dovuta a fango poco aerato, o a carico troppo alto o ad ingresso di sostanze in fermentazione. I Flagellati risultano essere i solo Protozoi presenti nei fanghi fortemente caricati (>0.9 KgB.O.D./kgMLSS x d). Essi entrano continuamente nell impianto attraverso il liquame in cui si trovano in elevate quantità. Normalmente nei fanghi attivi questi Protozoi subiscono la competizione da parte dei Ciliati batteriofagi, inoltre sono fortemente sottoposti a predazione da parte di altri Ciliati, e la loro presenza nei fanghi attivi è limitata a pochi individui (<10 individui contati lungo la diagonale nella camera di Fuchs- Rosenthal). In caso di disfunzioni dell impianto, il loro numero può aumentare (>10 individui) e ciò indica un abbassamento di efficienza depurativa. La loro dominanza diventa evidente quando raggiungono la densità di oltre 100 individui contati lungo la diagonale nella camera di Fuchs-Rosenthal. In questo caso essi devono essere considerati come gruppo dominante della microfauna. I Flagellati di taglia più grande come Euglena e Peranema, si osservano meno frequentemente nei fanghi attivi, dove raggiungono difficilmente alte densità di popolazione. La loro presenza è associata a liquami caratterizzati da sostanza organica molto diluita Descrizione dell Indice Biotico del Fango (S.B.I.). L Indice Biotico del Fango (Madoni P., 1994) che è stato applicato nella nostra indagine, è un metodo che si basa sia sulla differente sensibilità mostrata da alcuni gruppi della microfauna ai principali parametri fisici, chimici e gestionali dell impianto, che sull abbondanza e diversità in specie della stessa microfauna. Per mezzo di una tabella a due entrate, è possibile calcolare l Indice Biotico del Fango (S.B.I.), che consente di definire la qualità biologica del fango stesso, mediante valori numerici convenzionali. Lo S.B.I. si basa anche sulle considerazioni seguenti: La ricchezza in specie tende a cambiare normalmente con il carico del fango. Il più alto numero di specie è stato osservato a carichi del fango compresi fra 0.2 e 0.3 KgB.O.D./kgMLSS x d. La densità della microfauna diminuisce con il decrescere del carico del fango. Nella vasca di aerazione di impianti che attuano la nitrificazione, è attesa una microfauna meno abbondante rispetto ai fanghi attivi convenzionali. L indice da assegnare al fango attivo in esame, come precedentemente indicato, si ottiene mediante l uso di una tabella a due entrate. Nelle righe vengono presi in considerazione i gruppi dominanti o 34

18 prevalenti che, a partire dalla parte alta della tabella, sono associati ad una qualità biologica del fango via via decrescente. Nella parte alta delle colonne viene considerata, invece, la diversità della microfauna in cui il numero delle unità sistematiche è raggruppato in quattro diverse classi. La tabella a due entrate inoltre, considera l abbondanza della microfauna (esclusi i Flagellati) e dei Flagellati. Per la determinazione dei valori di SBI è necessario selezionare l ingresso orizzontale in tabella scegliendo prima la riga corrispondente al gruppo dominante e poi tenendo in considerazione la densità totale della microfauna (minore o maggiore di 10 6 ind./l).in caso di due o più gruppi dominanti, la scelta cadrà sul gruppo che occupa la posizione più bassa. L ingresso verticale in tabella è invece determinato dal numero totale delle unità sistematiche di cui è composta la microfauna e dalla densità dei piccoli Flagellati. Il valore dell Indice Biotico del Fango (S.B.I.) può così essere determinato all intersezione della riga e della colonna selezionati. La tabella a due entrate permette di assegnare valori da 0 a 10 alla qualità biologica del fango, sulla base di due criteri: la differente sensibilità mostrata dai gruppi della microfauna alle condizioni ambientali e l effetto che tali condizioni producono sia sulla densità che sulla ricchezza in specie della microfauna. Infine, i valori di S.B.I. sono raggruppati in quattro classi di qualità evidenziate da numeri romani. Queste classi permettono di rappresentare la qualità biologica del fango attivo mediante quattro giudizi piuttosto ampi. Gruppi della microfauna e sua densità che determinano l'ingresso orizzontale in tabella. Numero totale di specie che costituiscono la microfauna (esclusi i Flagellati) del fango e densità dei Flagellati (F) contati nella diagonale della camera Fuchs-Rosenthal. Gruppo dominante Densità n specie >10 n specie fra 8 e 10 n specie fra 5 e 7 n specie <5 o prevalente. (ind./l) F<10 10<F<100 F<10 10<F<100 F<10 10<F<100 F<10 10<F<100 Ciliati mobili + sessili* > o = e/o amebe con teca < Ciliati sessili*>80% > o = < Opercularia spp. > o = < Vorticella microstoma > o = < Ciliati natanti > o = < Piccoli Flagellati > o = (>100)Y < * = Opercularia e Vorticella microstoma non abbondanti. Y = n di Flagellati nella diagonale della camera di Fuchs-Rosenthal Tab Tabella a due entrate per il calcolo dell Indice Biotico del Fango (S.B.I.). 35

19 Valore di S.B.I. Classe Giudizio 8 10 I Fango ben colonizzato e stabile, ottima attività biologica; alta efficienza depurativa. 6 7 II Fango ben colonizzato e stabile, attività biologica sub-ottimale; discreta efficienza depurativa. 4 5 III Insufficiente depurazione biologica dell impianto; mediocre efficienza depurativa. 0-3 IV Cattiva depurazione biologica dell impianto; bassa efficienza depurativa. Tab Conversione dei valori di S.B.I. in classi di qualità del fango con relativo giudizio Quantificazione della biomassa mediante citometria a flusso. Accanto alle tradizionali metodiche analitiche descritte in precedenza, nel presente studio condotto sul bacino del fiume Sarca è stata applicata anche una tecnica innovativa, per la quantificazione e la determinazione della vitalità, attività e mortalità delle cellule batteriche costituenti le biomasse di alcuni degli impianti di depurazione monitorati. La biomassa di un impianto a fanghi attivi viene normalmente espressa mediante la concentrazione di solidi sospesi volatili (SSV) e/o di C.O.D. particolato. Tuttavia tale metodo di misura non è completamente corretto, in quanto gli SSV comprendono, oltre alla biomassa cellulare, anche le frazioni di sostanza organica, quali i composti organici particolati inerti o lentamente biodegradabili, provenienti dal liquame in ingresso e bioflocculati nel fiocco biologico. Se si esprime la biomassa come SST (solidi sospesi totali), si include, oltre agli SSV, anche il substrato particolato inerte non organico. I valori di biomassa indicati come SSV o SST, forniscono, conseguentemente, valutazioni approssimate delle cinetiche di rimozione dei substrati all interno di un processo biologico, e ciò ha grande influenza sui valori calcolati dai modelli ingegneristici impiegati nella progettazione di impianti di depurazione biologica. Del resto, per la quantificazione della biomassa cellulare costituente i fanghi attivi non sono attualmente disponibili tecniche routinabili, e le possibili alternative sono ancora argomento di ricerca e di continui approfondimenti. I metodi oggi utilizzabili ed applicabili sono generalmente basati su valutazioni indirette, come ad esempio la stima della biomassa attiva mediante tests respirometrici o la misura del contenuto di ATP cellulare. In quest ambito, la tecnica della citometria a flusso impiegata nella determinazione quantitativa della biomassa dei fanghi attivi, risulta essere molto promettente, soprattutto perché è uno strumento di analisi di tipo diretto. Le recenti innovazioni nello sviluppo di fluorocromi e nella citometria a flusso, infatti, permettono l applicazione di una tecnica rapida ed automatizzata per l enumerazione dei batteri (o più in generale di particelle) o per l analisi multiparametrica degli stessi. La citometria a flusso risulta essere una tecnica d analisi precisa soltanto se la preparazione del campione, la tecnica di colorazione e soprattutto l interpretazione dei risultati sono corretti. Con essa si possono identificare singole cellule batteriche sulla base del contenuto di vari componenti, come gli acidi nucleici (DNA ed RNA) e le proteine, con il vantaggio di avere un elevata accuratezza unita ad una velocità di diverse centinaia o migliaia di cellule per secondo. Nella conta batterica, questa tecnica sostituisce di fatto la conta diretta al microscopio, permettendo di realizzare misure più veloci e più rapide, e frequenti indagini e monitoraggi delle comunità microbiche. In un citometro a flusso, le cellule vengono marcate con specifici fluorocromi e passano con flusso laminare, davanti ad un punto focale di un raggio luminoso di eccitazione. Ogni cellula risponde con un impulso luminoso di fluorescenza, la cui intensità è proporzionale al contenuto cellulare del componente marcato (acidi nucleici o proteine). Il segnale di fluorescenza emesso viene catturato e trasformato da un 36

20 fotomoltiplicatore in impulso elettrico, che viene registrato, misurato e visualizzato in un istogramma di intensità. Con citometri a fluorescenza doppia o multipla, è possibile acquisire contemporaneamente due o più segnali di emissione, ed eseguire comparazioni multiparametriche. In aggiunta ai segnali di fluorescenza, le particelle che vengono aspirate e che raggiungono il punto di fuoco, possono lasciare dei segnali di scattering, che sono raccolti da specifici fotomoltiplicatori e trasformati, anch essi, in impulsi elettrici misurabili, registrabili e visualizzabili in istogrammi di intensità di scattering. Il segnale di scattering, che permette di ottenere informazioni sulla dimensione e sulla struttura cellulare, viene prodotto dall interazione stessa della particella con il raggio luminoso di eccitazione, e può essere acquisito a diversi angoli, ma solitamente si utilizzano l angolo a 0 e quello a 90. Nella conta particellare, un citometro a flusso può raggiungere una velocità di misura di oltre cellule/secondo, una precisione di misura delle singole cellule pari a 1% e come limite di individuazione bastano poche centinaia di molecole fluorescenti per cellula; il settaggio e l impostazione dello strumento, permettono di privilegiare uno o l altro di questi obiettivi. La citometria a flusso è una tecnica che già in passato ha trovato varie applicazioni, combinata con le tecniche di immunofluorescenza, nella valutazione dei patogeni presenti nelle acque o negli alimenti e soltanto negli ultimi anni è stata impiegata nell analisi dei fanghi attivi (1995) o delle acque reflue. Attualmente è impiegata con successo nella microbiologia, per lo studio del ciclo cellulare, per l indagine degli effetti degli antibiotici, nel monitoraggio di batteri e di altri microrganismi nelle acque superficiali e reflue. Comunque, il potenziale della citometria a flusso nel campo della microbiologia non è ancora completamente sfruttato. In questo monitoraggio degli impianti di depurazione presenti nel bacino del Sarca la tecnica citometrica è stata applicata soltanto ad alcuni impianti della zona del Basso Sarca, per stimare quantitativamente i batteri costituenti la biomassa dei fanghi attivi. La tecnica in questione non è stata utilizzata per tutti gli impianti monitorati, sia per problemi di tempo e di scelta del laboratorio, che per problematiche legate alla tempistica di analisi. Infatti, per i campioni analizzati, il fango attivo presente nelle vasche di ossidazione è stato prelevato contemporaneamente a quello che serviva per l analisi della microfauna (Indice Biotico dei Fanghi), ed è stato processato appena giunto in laboratorio, secondo il protocollo descritto negli allegati. E doveroso ricordare che le fasi di preparazione ed analisi dei campioni sono state condotte in collaborazione con il Dipartimento di Ingegneria Civile ed Ambientale dell Università di Trento (in particolare con l Ing. Paola Foladori e con la Dott.ssa Pamela Gurlini), con il quale è stato anche preparato il protocollo di applicazione della citometria a flusso ai fanghi attivi degli impianti di depurazione biologica. Dopo l applicazione del protocollo di analisi riportato in allegato, dal campione di fango attivo si ottiene una sospensione cellulare che deve essere marcata per l analisi citometrica in fluorescenza. La marcatura fluorescente dei campioni per la valutazione della vitalità viene effettuata utilizzando l accoppiamento SYBR-Green I e Ioduro di Propidio: in questo modo, sulla base dei segnali di fluorescenza verde e rossa emessi, rispettivamente, dai due fluorocromi, si discriminano le cellule vitali da quelle danneggiate e da quelle morte, sulla base dell integrità di membrana cellulare. Il programma che gestisce il citometro a flusso a nostra disposizione (Bryte-HS prodotto dalla BioRad) permette di contare le cellule su particolari istogrammi (canale di intensità sulle ascisse, contro conta batterica sulle ordinate), ed ottenere informazioni multiparametriche (come la determinazione delle cellule danneggiate) per mezzo di citogrammi (per esempio: fluorescenza verde contro fluorescenza rossa). Per quanto riguarda invece la valutazione dell attività enzimatica, sono stati impiegati i fluorocromi BCECF-AM e FDA. Tali fluorocromi mettono in risalto l attività metabolica cellulare, perché, diffondendo all interno delle cellule, interagiscono, come un substrato, con le esterasi intracellulari non specifiche, dalle quali vengono idrolizzati per dare prodotti fluorescenti. Le cellule morte (quindi completamente permeabili) o con membrana danneggiata, perdono velocemente il fluoroforo, risultando così incolori. In questo studio i fluorocromi che evidenziano l attività enzimatica (esterasica) cellulare, sono stati impiegati per lo stesso campione trattato con i fluorocromi per la vitalità e mortalità, ma l applicazione di BCECF-AM e FDA non è stata estesa a tutti i prelievi. 37