hiclot Manuale utente

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1 hiclot Manuale utente versione del 19/3/2010

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3 Capitolo 1 Informazioni generali 1.1 Impostazione dello strumento hiclot è un coagulometro monocanale dal costo contenuto che si utilizza con estrema facilità ed è in grado di effettuare i test coagulativi più diffusi: PT PTT TT FIB Tempo di Protrombina Tempo di Tromboplastina Parziale Tempo di Trombina Fibrinogeno (Clauss) Il sistema è integrato da un software 1 di collegamento ad un computer che lo dota di alcune funzioni aggiuntive tra cui l archivio storico dei risultati e la stampa. Si presenta come un parallelepipedo che ha sul lato superiore un display LCD retroilluminato, una tastierina ed inoltre 1 La versione più recente di questo software è scaricabile da

4 4 Informazioni generali hiclot lato destro Il controllo avviene mediante una tastiera a tre bottoni ed un display posto sul lato superiore, sul lato destro c è l in- terruttore e il connettore per l alimentatore esterno, sul lato sinistro la presa per il cavo di collegamento al PC. hiclot lato sinistro 12 pozzetti per il preriscaldamento dei campioni 2 pozzetti per i reagenti 1 pozzetto di lettura 1.2 Struttura dello strumento Il lato superiore di hiclot contiene il pannello di controllo ed il blocco termostatico Blocco termostatico Il blocco termostatico è di alluminio e riporta alcuni pozzetti per il preriscaldamento di campioni e reagenti ed il pozzetto di lettura. Superiormente è coperto da una superficie di

5 1.2 Struttura dello strumento 5 plastica per diminuirne la dissipazione assicurandone l uniformità della temperatura che è fissata tra 36, 5 o C e 37, 5 o C. Il pozzetto centrale contiene il lettore ottico ed è quello in cui inserire il campione da misurare Pannello di controllo Il pannello di controllo è costituito da un display alfanumerico LCD e da una tastiera a 3 tasti. Nel normale lavoro con lo strumento l utilizzo della tastiera è ridotto al minimo in quanto essa si usa solo per selezionare e far partire un test. I due tasti superiori e selezionano le voci da una lista, quello inferiore accetta la selezione corrente.

6 6 Informazioni generali 1.3 Principio di funzionamento Tutte le metodiche coagulative scatenano reazioni a cascata che si concludono con la trasformazione, catalizzata dalla Trombina, del Fibrinogeno in Fibrina. La Fibrina forma a sua volta un coagulo gelatinoso ad elevata torbidità e si può rilevarne otticamente la formazione misurando l aumento di assorbanza. In effetti hiclot è fondamentalmente un colorimetro monocanale a luce blu che ha la disposizione rappresentata nella figura seguente. La coppetta, semitrasparente, è attraversata dal raggio di luce generato dall emettitore la cui variazione di intensità viene rilevata dal sensore ottico sul lato opposto. La sequenza operativa delle analisi consiste nell inserire nel pozzetto di misura una coppetta nella quale sia stato pipettato il campione. L inserimento è rilevato dal fotometro. Premendo il pulsante parte un conto alla rovescia di tre secondi al termine del quale l operatore deve inserire il reagente: da questo istante hiclot inizia a monitorare la formazione del coagulo. L andamento tipico dell assorbanza è dopo l aggiunta del reagente è rappresentato dal grafico seguente.

7 1.3 Principio di funzionamento t (sec) Per la prima decina di secondi non si ha formazione di Fibrina, poi intorno ai secondi parte la formazione del coagulo che comporta una variazione dell assorbanza ben visibile in figura 2. Man mano che si forma Fibrina l assorbanza aumenta fino al limite superiore corrispondente alla totale formazione del coagulo. hiclot segue opportunamente la curva di assorbanza costruendo la linea spezzata sovrapposta alla curva reale con la quale viene bloccato il cronometro. In questo modo si ottiene un ottima ripetibilità rendendo nel contempo la misura insensibile ai disturbi esterni. 2 Si noti che la scala verticale delle assorbanze è arbitraria

8 Capitolo 2 Le analisi 2.1 Generalità All accensione hiclot visualizza per qualche istante il nome e la versione del software per poi iniziare automaticamente a riscaldare il blocco termostatico fino a 37 o C. Durante questa fase, che dura 5 8 minuti, visualizza una freccia che man mano si sposta verso destra all aumentare della temperatura. Al termine del riscaldamento, sulla riga superiore compare il messaggio Attesa campione e sulla seconda l inizio della lista metodi PT, PTT che continua verso destra come indicato dalla freccia. Si noti che il metodo PT è tra parentesi quadre ad indicare che è il metodo corrente, cioè quello che lo strumento è pronto ad eseguire. Si può cambiare metodo con i tasti e. Premendo la selezione passa al metodo successivo: al centro della riga tra parentesi quadre è ora il metodo PTT; premendo ancora la seleziona passa al metodo ancora successivo (ora il metodo TT è tra parentesi quadre). Si noti che la freccia a

9 2.1 Generalità 9 destra è scomparsa perché siamo alla fine della lista mentre ne è comparsa una a sinistra poiché la testa della lista non è più visualizzata. Premendo si torna indietro e viene selezionato il metodo che precede quello corrente. I metodi sono nell ordine PT, PTT, TT e FIB. Per iniziare un analisi inserire nel pozzetto di misura la coppetta campione: il fotometro rileva la presenza e si mette in attesa dell inserimento del reagente. Sul display compare il metodo selezionato e la voce Reagente. L eventuale presenza di un asterisco indica che lo strumento non è calibrato e può visualizzare solo il tempo di formazione del coagulo. Premere e lo strumento fa partire un conto alla rovescia di 3 secondi al termine del quale deve essere pipettato il reagente e quindi parte il cronometro che si ferma quando viene rilevato il coagulo. Poi lo strumento visualizza il dato cronometrico e, se calibrato, altri risultati in funzione tipo di test secondo la tabella seguente. test parametro display PT Tempo di Protrombina sec XXX.X P Ratio = P T/P T pool XX.XX INR = Ratio ISI XX.XX Attività % XXX.X PTT Tempo di Protrombina parziale sec XXX.X Ratio = P T T/P T T pool XX.XX TT Tempo di Trombina sec XXX.X Ratio = T T/T T pool XX.XX FIB Fibrinogeno derivato sec XXX.X Concentrazione mg/dl XXX. L ultima colonna a destra contiene la modalità di visualizzazione: ad esempio XXX.X significa che il risultato viene espresso con un numero avente una cifra decimale e un massimo di tre cifre prima della virgola (ad es. 12.3) L estrazione della coppetta dal pozzetto di reazione du-

10 10 Le analisi rante la lettura la interrompe e hiclot si predispone ad una nuova reazione. Il tempo massimo per la formazione del coagulo è 300 sec superato il quale comunque il test viene interrotto. Durante la lettura è sempre possibile premere il pulsante per interrompere il cronometro e riportare lo strumento in condizioni di stand-by. Per i test PT, PTT e TT il calcolo del ratio prevede i coefficienti P T pool, P T T pool e T T pool che devono essere determinati a partire da un pool di sieri rappresentativo della popolazione sana del laboratorio. 2.2 PT - Tempo di Protrombina La Protrombina o fattore II è una glicoproteina sintetizzata dal fegato la cui concentrazione nel plasma è mg/dl. Il test PT indaga l attività dei fattori della coagulazione nella via estrinseca tra cui i fattori I, II, V, VII e X alcuni dei quali sono influenzati dalla terapia anticoagulante orale. Per questo il PT è utilizzato nel monitoraggio dei pazienti soggetti a tale terapia Esecuzione del test 1. Selezionare il test PT 1 2. Preriscaldare il reattivo PT in un pozzetto reagente. 3. Inserire in un pozzetto di preriscaldamento una coppetta vuota 4. Pipettarvi 100 µl di campione (plasma) 5. Preriscaldare il campione per almeno 2 min o il tempo indicato sulla confezione del reagente. 1 Il test selezionato è quello che compare sulla seconda riga del display tra parentesi. Se necessario utilizzare i pulsanti e

11 2.2 PT - Tempo di Protrombina Trasferire la coppetta nel pozzetto di lettura: il sistema automaticamente ne rileva la presenza e richiede all operatore di inserire il reagente 7. Premere : parte un conto alla rovescia al termine del quale pipettare 200 µl di reagente preriscaldato nella coppetta campione. Il cronometro parte. 8. Quando si forma il coagulo, il cronometro si blocca visualizzando i risultati Calibrazione Il calcolo dell Attività necessita di una calibrazione a quattro punti: i calibratori si ottengono a partire dal plasma di controllo normale 2 per diluizione con soluzione salina secondo lo schema seguente: Attività Diluizione Preparazione % plasma salina A : µl - B 50 1 : 2 50 µl 50 µl C 25 1 : 4 25 µl 75 µl D : µl 87.5 µl Preriscaldare le coppette contenti i calibratori per 2 min e poi operare come segue: 1. Leggere il calibratore A (100 %) con la procedura descritta nel paragrafo precedente. Al termine dell analisi, premere il pulsante : in basso a destra compare la scritta CAL ad indicare che il primo valore della curva di calibrazione è stato accettato. 2. Leggere il calibratore B (50 %) e premere per accettare il secondo valore. 3. Leggere il calibratore C (25 %) e premere per ac- 2 che si suppone abbia il 100% di attività

12 12 Le analisi cettare il terzo valore. 4. Leggere il calibratore D (12.5 %) e premere per accettare il quarto valore. Dopo questa procedura il sistema è calibrato e può calcolare il Ratio e l Attività. La curva di calibrazione è la retta di regressione per i punti di calibrazione sul piano indicato in figura che riporta in ascissa l inverso dell Attività (1/A) ed in ordinata i tempi di formazione del coagulo espressi in secondi. Controllo dei dati di calibrazione I dati di calibrazione possono essere visualizzati ed eventualmente corretti premendo il quando il test corrente è PT Compare il tempo di coagulazione T 0 relativo al calibratore A. Continuando a premere compare il tempo di coagulazione T 1 relativo al calibratore B, quindi T 2 per il calibratore C e T 3 per il calibratore D.

13 2.2 PT - Tempo di Protrombina Inserimento dell ISI Premendo ancora dopo l ultimo punto di calibrazione, compare il valore corrente dell ISI 3 che permette di calcolare l INR 4. Questo parametro deve essere reperito sulla confezione reagente e normalmente dipende dal lotto. Supponiamo che il valore corrente dell ISI sia 1.00 e che invece il valore da inserire sia La sequenza delle operazioni da compiere è la seguente 1. Premere - il valore precedente scompare e compare la cifra 1 : confermarlo premendo 2. Premere - compare il punto decimale : confermarlo premendo 3. Premere - accanto al punto decimale compare la cifra 9, premendo ancora una volta al posto del 9 compare 8. Continuare a premere finché non compare 0 : confermarlo premendo 4. Premere cinque volte fino a che accanto allo 0 non compare 5 : confermare la cifra premendo 5. Ora che il numero inserito è corretto, accettarlo premendo una seconda volta La procedura consiste dunque nell inserire un numero decimale selezionando singolarmente ciascuna cifra: passa alla cifra superiore, a quella inferiore. Il punto decimale è dopo il 9 e prima dello 0 ed è possibile inserirne solo uno Risultati visualizzati Quando lo strumento è correttamente calibrato i risultati del metodo sono quattro valori organizzati come segue. 3 International Sensitivity Index 4 International Normalized Ratio

14 14 Le analisi sinistra in alto PT: tempo di formazione del coagulo in secondi (15.0 nell esempio) destra in alto Ratio: rapporto tra il PT del campione e quello del calibratore A (1.23 nell esempio) sinistra in basso INR = Ratio ISI (1.20 nell esempio) destra in basso Attività espressa in percentuale calcolata con la calibrazione descritta (78.4% nell esempio) Reset della calibrazione PT La procedura di calibrazione descritta permette di inserire i valori della curva di calibrazione automaticamente a partire dai risultati analitici dei calibratori. Per ricalibrare lo strumento è necessario annullare i dati correnti e per far ciò spegnere lo strumento e riaccenderlo tenendo premuto il pulsante fino a quando scompare la schermata contenente la versione del software. 2.3 PTT - Tempo di Tromboplastina Parziale É il tempo di coagulazione di un plasma carente di piastrine dopo l aggiunta di fosfolipidi (in sostituzione delle piastrine) e di ioni calcio. Permette di indagare la via estrinseca della coagulazione Esecuzione del test 1. Selezionare il test PTT

15 2.4 TT - Tempo di Trombina Preriscaldare il Ca Cl 2 in un pozzetto reagente 3. Inserire in un pozzetto di preriscaldamento una coppetta vuota 4. Pipettarvi 100 µl di campione (plasma) ed incubare 2 min 5. Pipettarvi 100 µl di reagente PTT ed incubare altri 3 5 min 6. Trasferire la coppetta nel pozzetto di lettura: il sistema automaticamente ne rileva la presenza e richiede all operatore di inserire il reagente 7. Premere : parte un conto alla rovescia di tre secondi al termine del quale pipettare 100 µl di Ca Cl 2 preriscaldato nella coppetta campione. Il cronometro parte. 8. Quando si forma il coagulo, il cronometro si blocca visualizzando i risultati In alto a sinistra è visualizzato il PTT in secondi e in alto a sinistra compare il rapporto tra il PTT ed il valore normale del PTT. 2.4 TT - Tempo di Trombina É il tempo di coagulazione di un plasma citrato carente in piastrine aggiunto di una quantità nota di Trombina. Questo test investiga la parte finale delle reazioni di coagulazione: la trasformazione del Fibrinogeno in Fibrina e la sua polimerizzazione Esecuzione del test 1. Selezionare il test TT 2. Preriscaldare il reattivo TT in un pozzetto reagente.

16 16 Le analisi 3. Inserire in un pozzetto di preriscaldamento una coppetta vuota 4. Pipettarvi 200 µl di campione intero (plasma) 5. Preriscaldare il campione per almeno 3 min o il tempo indicato sulla confezione del reagente. 6. Trasferire la coppetta nel pozzetto di lettura: il sistema automaticamente ne rileva la presenza e richiede all operatore di inserire il reagente 7. Premere : parte un conto alla rovescia di tre secondi al termine del quale pipettare 100 µl di reagente preriscaldato nella coppetta campione. Parte il cronometro. 8. Quando si forma il coagulo, il cronometro si blocca visualizzando i risultati Il primo risultato visualizzato è il tempo di Trombina in secondi, il secondo è il rapporto tra questo valore ed il valore normale. 2.5 FIB - Fibrinogeno (Clauss) Il Fibrinogeno o fattore I è un dimero di tre catene polipeptidiche (α, β e γ) con un terminale residuo carbossilico la cui concentrazione normale nel plasma è mg/dl. Il Fibrinogeno viene convertito in Fibrina mediante polimerizzazione catalizzata dalla Trombina o altri enzimi simili. hiclot lo dosa mediante il metodo Clauss che è un test indiretto basato su un tempo di Trombina modificato: a concentrazioni elevate di Trombina, il tempo di polimerizzazione della Fibrina per un plasma citrato diluito è correlato alla quantità di proteina. Questa reazione è influenzata da sostanze ad azione antitrombinica (FDP, eparina) o da modifiche della struttura

17 2.5 FIB - Fibrinogeno (Clauss) 17 terziaria della proteina Fibrinogeno ed in questi casi se ne verifica una sottostima Esecuzione del test ATTENZIONE Per questo test occorre diluire i campioni 1:10 in tampone IBS. 1. Selezionare il test FIB 2. Preriscaldare il reattivo FIB in un pozzetto reagente. 3. Inserire in un pozzetto di preriscaldamento una coppetta vuota 4. Pipettarvi 200 µl di campione diluito (plasma) 5. Preriscaldare il campione per almeno 5 min o il tempo indicato sulla confezione del reagente. 6. Trasferire la coppetta nel pozzetto di lettura: il sistema automaticamente ne rileva la presenza e richiede all operatore di inserire il reagente 7. Premere : parte un conto alla rovescia di 3 secondi al termine del quale pipettare 100 µl di reagente preriscaldato nella coppetta campione. Parte il cronometro. 8. Quando si forma il coagulo, il cronometro si blocca visualizzando i risultati Calibrazione Il dosaggio richiede una calibrazione a tre punti con calibratori che si ottengono a partire dal plasma di controllo normale per diluizione con il tampone IBS secondo lo schema seguente

18 18 Le analisi Diluizione Preparazione plasma IBS A 1 : µl 400 µl B 1 : µl 450 µl C 1 : µl 475 µl Preriscaldare per 2 min in coppette i calibratori così preparati ed operare come segue 1. Leggere il calibratore A con la procedura descritta nel paragrafo precedente. Al termine dell analisi, premere il pulsante : in basso a destra compare la scritta CAL ad indicare che il primo valore è della curva di calibrazione è stato accettato. 2. Leggere il calibratore B e premere per accettare il secondo valore. 3. Leggere il calibratore C e premere per accettare il terzo valore. La curva di calibrazione è la retta di regressione per i punti di calibrazione riportati sul piano bilogaritmico indicato in figura che riporta in ascissa il logaritmo della concentrazione (mg/dl) ed in ordinata il logaritmo dei tempi di formazione del coagulo (sec). Controllo dei dati di calibrazione I dati di calibrazione possono essere visualizzati ed eventualmente corretti premendo il quando il test corrente è FIB. Compare il tempo di coagulazione T 0 relativo al calibratore A. Continuando a premere compare il tempo di coagulazione T 1 relativo al calibratore B quindi T 2 per il calibratore C.

19 2.5 FIB - Fibrinogeno (Clauss) Inserimento della concentrazione Premendo ancora una volta dopo aver visualizzato l ultimo punto di calibrazione compare la concentrazione in mg/dl del controllo. Inserire tale valore selezionando cifra per cifra come si è proceduto per il caso del PT Risultati visualizzati Se la curva di calibrazione è stata correttamente effettuata e la concentrazione correttamente inserito con la procedura descritta nel paragrafo precedente, al termine dell analisi dopo la formazione del coagulo vengono visualizzati i quattro parametri seguenti

20 20 Le analisi in alto a sinistra Tempo di formazione del coagulo in secondi (16.3 nell esempio) in alto a destra Ratio: rapporto tra il tempo del campione e quello del calibratore A (1.21 nell esempio) in basso Concentrazione del Fibrinogeno in mg/dl (228 nell esempio) Reset della calibrazione FIB La procedura di calibrazione descritta permette di inserire i valori della curva di calibrazione automaticamente a partire dai risultati analitici dei calibratori. Per ricalibrare lo strumento è necessario annullare i dati correnti e per far ciò spegnere lo strumento e riaccenderlo tenendo premuto il pulsante fino a quando scompare la schermata contenente la versione del software. 2.6 Consigli d uso 1. Se i reagenti sono stati lasciati in frigorifero, si prega di lasciarli riscaldare almeno 5 minuti nelle coppette reagenti prima di utilizzarli. 2. L inserimento di reagenti o starter al termine del conto alla rovescia deve essere veloce. Se l inserimento è troppo lento, i risultati potrebbero non essere attendibili a causa della scarsa miscelazione dei componenti. 3. Si prega di controllare adeguatamente la pipetta manuale per l erogazione campioni e dei reagenti. Risultati non ripetibili sono normalmente dovuti alla scarsa ripetibilità nella dispensazione dei liquidi.

21 2.6 Consigli d uso Si prega di avere buona cura nella preparazione dei campioni di calibrazione attraverso diluizioni. Gli errori commessi im questa fase sono molto critici. 5. Questo è uno strumento manuale quindi risultati corretti dipendono dalla corretta manipolazione di reagenti, campioni e dal corretto pipettamento dei liquidi. L operatore deve essere addestrato nell uso dei reagenti e delle pipette. 6. Durante l esecuzione dell analisi, sulla seconda riga del display a destra compare il tempo trascorso dall inizio del test, a sinistra l assorbanza misurata in scala arbitraria. 7. Ciascun hiclot ha un numero di serie scritto sull etichetta posta al di sotto dello strumento ed è costituito dalle lettere HC, quattro cifre un trattino e altre due cifre. Questo numero serve a scaricare il software di interfacciamento.

22 Capitolo 3 Norme di sicurezza ed istallazione Al fine di utilizzare al meglio hiclot, si consiglia di seguire attentamente le norme di sicurezza e di installazione contenute all interno di questo paragrafo 3.1 Misure di sicurezza 1. Leggere attentamente e conservare questo manuale. 2. Prima della pulizia disconnettere tutte le prese d alimentazione. 3. Per la pulizia non utilizzare liquidi, aerosol o qualsiasi altro prodotto detergente che possa penetrare all interno dello strumento, utilizzare esclusivamente un panno umido. 4. Non modificare in alcun modo lo strumento senza esplicita autorizzazione del fabbricante.

23 3.1 Misure di sicurezza Non esporre né utilizzare il sistema in ambiente bagnato od eccessivamente umido. 6. Non appoggiare il sistema su di un piano instabile o mal fissato. 7. Collegare il sistema solo ad una rete d alimentazione conforme alle normative vigenti ed in grado di erogare la potenza prescritta. 8. Si consiglia fortemente l uso di un gruppo di continuità opportunamente dimensionato. 9. Per un uso corretto e sicuro il sistema richiede una rete d alimentazione provvista di collegamento a massa. 10. Collegare il sistema il più possibile vicino alla presa d alimentazione. 11. Non appoggiare nulla sui cavi. 12. Non sovraccaricare la presa d alimentazione con l utilizzo di prese multiple. 13. Non introdurre oggetti estranei nel sistema. 14. Il sistema è stato collaudato per un funzionamento ad una temperatura ambiente tipica di 25 o C; nel caso la temperatura si discosti eccessivamente da questo valore, condizionare l ambiente di lavoro dello strumento. 15. Non tentare di aprire il sistema. Qualsiasi riparazione deve essere eseguita solo da personale specializzato e riconosciuto dalla casa costruttrice. 16. Disconnettere il sistema dalla rete ed avvisare l assistenza tecnica in qualsiasi caso si abbia sentore di pericolo. 17. Pretendere l utilizzo di sole parti originali per le riparazioni. 18. Il sistema deve essere utilizzato esclusivamente da personale specializzato. 19. Non usare sostanze infiammabili di qualsiasi natura in prossimità dello strumento.

24 24 Norme di sicurezza ed istallazione 3.2 Contenuto dell imballo hiclot viene spedito in un imballo di cartone all interno del quale è sistemato in una struttura di plastica espansa antiurto morbida ed elastica. L imballo contiene: - Lo strumento hiclot - L alimentatore - Un pieghevole con le istruzioni di base - 30 coppette campione - 6 coppette reagente

25 3.3 Dichiarazione di conformità Dichiarazione di conformità La società produttrice hilab S.r.l. ( con sede in via Piero Aloisi 36, ROMA, dichiara che il prodotto hiclot è conforme ai requisiti essenziali delle seguenti direttive comunitarie: 89/336/CEE 92/31/CEE 93/68/CEE 93/97/CEE 73/23/CEE recepite dai seguenti decreti legislativi n. 791 del 18/10/1977 attuazione 73/23 n. 615 del 12/11/1996 recepimento direttive 92/31/CEE, 93/68/CEE, 93/97/CEE n. 626 del 25/11/1996 attuazione direttiva 93/68/CEE n. 277 del 31/7/1997 modifiche alla N.626 del 25/11/96 É conforme ai requisiti di prodotto indicati dalle seguenti norme tecniche armonizzate: CEI EN Compatibilità elettromagnetica, norma generica sull immunità. Ambienti residenziali commerciali e dell industria leggera. CEI EN Compatibilità elettromagnetica, norma generica sull emissione Parte 1, ambienti residenziali, commerciali e dell industria generica. CEI EN Sicurezza degli impianti elettrici d uso domestico e similare, Parte 1 norme generali. In fede hilab S.r.l. - l amministratore unico ing. Francesco Iovine Roma, lì 5/5/2004

26 Indice 1 Informazioni generali Impostazione dello strumento Struttura dello strumento Blocco termostatico Pannello di controllo Principio di funzionamento Le analisi Generalità PT - Tempo di Protrombina Esecuzione del test Calibrazione Inserimento dell ISI Risultati visualizzati Reset della calibrazione PT PTT - Tempo di Tromboplastina Parziale Esecuzione del test TT - Tempo di Trombina Esecuzione del test FIB - Fibrinogeno (Clauss) Esecuzione del test Calibrazione

27 INDICE Inserimento della concentrazione Risultati visualizzati Reset della calibrazione FIB Consigli d uso Norme di sicurezza ed istallazione Misure di sicurezza Contenuto dell imballo Dichiarazione di conformità