La cellula batterica. Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. Università G. d Annunzio, Chieti-Pescara

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1 La cellula batterica Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. Università G. d Annunzio, Chieti-Pescara

2 Consiglio ( importante!!!)

3 Batteri Dimensioni cellulari Dimensioni medie Procarioti: µm Mycoplasma pneumoniae (0.2 µm) Thiomargarita namibiensis (750 µm) Dimensioni medie Eucarioti: µm Emazia: 7.5 μm Rapporto superficie/volume Batteri = 12 μm 2 / 4 μm 3 = 3:1 Cellula eucariotica = 0.3:1 La crescita batterica e le dimensioni della cellula vengono influenzate dal tasso metabolico = 1/k x (d) 2 Le ridotte dimensioni della cellula batterica consentono una penetrazione più efficiente dei nutrienti che raggiungono velocemente ogni parte del batterio. Gli Eucarioti, di contro, necessitano a tal fine di strutture ed organelli.

4 Batteri Principali morfologie cellulari I batteri presentano elevata variabilità anche nella forma ed organizzazione: Forme (morfologie) cellulari caratteristiche: sferica: cocchi (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Neisseraiceae) cilindrica: bacilli (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) corta e rigonfia: coccobacilli (Corynebacterium) ricurva: vibrioni (Vibrio cholerae) spirale: spirilli (Spirillum) a molla: spirochete (Borrelia, Treponema) filamentosa: (Streptomyces) variabile: pleomorfi (Bacteroides,Corynebacterium)

5 Batteri Organizzazione cellulare L organizzazione cellulare dipende dalla modalità di divisione e dai rapporti che le cellule figlie mantengono tra loro dopo la divisione: cocchi: singoli diplococchi: in coppia (Neisseriaceae) catene (Streptococcus) tetradi (gruppi di 4 cellule) sarcina (forma cubica, formata da 8-64 cellule) ammassi: (clusters) irregolari (Staphylococcus) bacilli: catene (streptobacilli) (Bacillus anthracis) palizzata (Corynebacterium)

6 Cellula batterica Organizzazione L organizzazione cellulare dei batteri è quella tipica dei Procarioti. La cellula batterica comprende tipicamente: Componenti fondamentali (per la sopravvivenza e la riproduzione cellulare) Componenti accessori (flagelli, pili, capsula, glicocalice, plasmidi: non sempre presenti, svolgono funzioni accessorie che, talvolta, possono essere determinanti per la virulenza)

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8 Cellula batterica

9 Membrana Citoplasmatica Struttura Struttura sottile (spessore 8 nm) che separa il citoplasma dall ambiente Barriera altamente selettiva (concentra i nutrienti al suo interno ed espelle all esterno le sostanze di rifiuto) Struttura trilaminare organizzata a mosaico fluido, doppio strato fosfolipidico con associata od integrata (transmembrana) una componente proteica i fosfolipidi contengono regioni idrofiliche (glicerofosfato) ed idrofobiche (acidi grassi) mediante le quali si auto-assemblano le proteine sono associate alla membrana od integrate in essa flessibile (viscosità ~ olio leggero), per movimento dei fosfolipidi Rispetto alla membrana eucariotica, quella procariotica: non contiene steroli (es. colesterolo, presenti solo nei Micoplasmi e nei batteri metanotrofi), sostituiti da opanoidi aventi stessa funzione di stabilizzazione e compattamento è più ricca in proteine

10 Membrana Citoplasmatica Funzioni Trasporto PASSIVO Barriera di permeabilità: regola il trasporto di nutrienti/prodotti metabolici: diffusione semplice (osmosi) diffusione facilitata (secondo gradiente di concentrazione, senza utilizzo di energia) trasporto attivo (mediato da proteine, contro gradiente di concentrazione, con utilizzo di energia) Sito di ancoraggio per proteine coinvolte nel trasporto, nella chemotassi ed in reazioni bioenergetiche Sito di conservazione dell energia (produzione ed utilizzo di forza motrice protonica, durante respirazione e fotosintesi) Interviene nella divisione cellulare, segregando i due cromosomi (mesosomi) Sede di proteine di sintesi di parete cellulare e di trasduzione del segnale

11 Membrana Citoplasmatica Funzioni

12 Membrana Citoplasmatica Trasporto passivo Non richiede utilizzo di energia in quanto la sostanza si muove secondo gradiente di concentrazione (high-to-low) La diffusione semplice può riguardare piccoli composti idrofobici (glicerolo) o gas (ossigeno), oppure solo H 2 O (osmosi). La diffusione facilitata utilizza un canale (aspecifico) od un carrier (specifico) di natura proteica

13 Trasporto Passivo Osmosi Quando concentrazioni di soluto sono separate da una membrana semi-permeabilie, H 2 O si sposta per creare soluzioni isotoniche (ad uguale concentrazione di soluto) Ipertonico: la concentrazione del soluto in una soluzione è maggiore della soluzione adiacente Ipotonico: la concentrazione del soluto è inferiore a quella di una soluzione adiacente

14 Trasporto Passivo Osmosi La parete cellulare dei microrganismi aiuta a preservare l integrità cellulare opponendosi alle variazioni della pressione osmotica: cellula in soluzioni ipertoniche: contrazione della membrana per fuoriuscita di H 2 O dalla cellula cellula in soluzioni ipotoniche: membrana turgida per l ingresso di H 2 O nella cellula.

15 Trasporto Attivo a) Mediato da carriers Il trasporto è mediato da proteine trasportatrici (carriers) ed avviene contro gradiente elettrochimico richiedendo, quindi, utilizzo di energia (ATP) Trasporto uniport : una sostanza in un unica direzione Trasporto antiport : due sostanze (una generalmente H + ) vengono co-trasportate in direzioni opposte Trasporto symport : due sostanze sono co-trasportate nella stessa direzione

16 Trasporto Attivo b) Traslocazione di gruppo La molecola trasportata viene modificata chimicamente. Esempio: sistema P-transferasico in E. coli (24 proteine) utilizzo dell energia derivante dal fosfoenol-piruvato almeno 4 proteine necessarie al trasporto di un carboidrato (enzima I aspecifico, enzima II specifico) fosforilazione a cascata

17 Trasporto Attivo c) ABC transporter sistema ABC (ATP-Binding Cassette), composto da tre proteine: proteina periplasmatica, proteina trans-membrana, ATP-asi proteina periplasmatica mobile nel periplasma e dotata di elevata affinità (fino a 10-6 M) per il substrato oltre 200 tipologie di sistemi ABC; specificità per composti organici (aminoacidi, carboidrati) ed inorganici (solfati, fosfati) presente non soltanto nei Gram- ma anche nei Gram+ (PBP ancorato alla membrana citoplasmatica) energizzato da idrolisi ATP

18 Membrana Citoplasmatica Mesosoma Il mesosoma è una invaginazione della membrana citoplasmatica di notevoli dimensioni, di forma irregolare. Presenza di diversi e voluminosi mesosomi, soprattutto nei batteri Gram+. Appaiono come strutture lamellari concentriche in prossimità del nucleoìde, delle estremità cellulari o della zona di formazione del setto. Svolge importanti funzioni: durante la divisione cellulare, danno attacco al DNA facilitando la separazione dei due cromosomi e la produzione del setto trasverso (mesosomi settali) contengono gran parte dei citocromi e degli enzimi respiratori (mesosomi respiratori) contengono enzimi coinvolti nella sintesi dei componenti di parete (mesosomi biosintetici)

19 Membrana Citoplasmatica Mesosoma

20 Strutture citoplasmatiche Citoplasma Gel colloidale (80% acqua + 20% sali-proteine) H 2 O quale solvente per componenti funzionali citoplasmatiche Proteine, zuccheri, lipidi, sali (Ca, Mg, fosfati, solfati, ecc.) DNA Bicatenario, circolare (lineare in Streptomyces, Borrelia) Aploide - organizzazione più efficiente della diploidia: cresce più velocemente; le mutazioni permettono un adattamento più veloce all ambiente Lunghezza rilevante (1 mm), superavvolto (DNA-girasi) attorno ad una proteina Localizzato in un area chiamata nucleoìde Plasmidi: DNA circolare extra-cromosomico (piccole dimensioni) Singoli o presenti in più copie Non essenziali per la crescita ed il metabolismo batterico Codificano per fattori di virulenza (es. antibiotico-resistenza) Ribosomi 60% RNA-ribosomale, 40% proteine Differiscono da quelli eucariotici per numero (10.000/cellula) e dimensioni [subunità: grande (50S) + piccola (30S)] Assenza di organelli mitocondri, complesso di Golgi, reticolo endoplasmico

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22 Strutture citoplasmatiche Inclusioni e granuli Corpi intracellulari con funzione di riserva energetica La cellula batterica può infatti utilizzarli nei casi di carenza od assenza di fonti energetiche ambientali Variabili in dimensioni, numero e contenuto Tipologie: glicogeno poli-β-idrossibutirrato (Bacteria, Archaea) vescicole gassose per il galleggiamento (Cyanobacterium) granuli di zolfo e fosfato (granuli metacromatici in Corynebacterium diphtheriae) magnetosomi (Fe 3 O 4 ; magnetotassi)

23 Cellula Procariotica

24 Parete cellulare Struttura del peptidoglicano (1 di 4) La parete cellulare è presente in gran parte dei Procarioti, dove circonda la membrana citoplasmatica. Essa è formata da strati rigidi di peptidoglicano (mureina) eccezioni: Archea (generalmente assente; alcune specie presentano uno pseudoglicano), Micobatteri (peptidoglicano a struttura caratteristica), Micoplasmi (privi di parete) Il peptidoglicano è una struttura rigida, simile ad una rete formata da catene polisaccaridiche lineari, unite tra loro mediante legami crociati di natura peptidica

25 Parete cellulare Struttura del peptidoglicano (2 di 4) Componenti dell unità di ripetizione (glican tetrapeptide) del peptidoglicano: Catena polisaccaridica: disaccaridi ripetuti (in alternanza) di N- acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM), legati tra loro da legami β(1,4) glicosidici. Peptide: tetrapeptide di sintesi enzimatica, legato a NAM e formato da D- ed L-aminoacidi (uniti mediante legami peptidici). sebbene la sequenza di aminoacidi nei tetrapeptidi sia speciespecifica, essa contiene sempre in posizione 3 un aminoacido bibasico: generalmente L-lisina (Gram +), oppure acido mesodiaminopimelico (Gram-)

26 Parete cellulare Struttura del peptidoglicano (3 di 4) Nella struttura di base del peptidoglicano, le catene individuali di peptidoglicano si trovano adiacenti e sono tenute insieme, a livello dei tetrapeptidi, mediante legami crociati peptidici: Legame crociato peptidico tra diamminoacido in posizione 3 e D-alanina in posizione 4: indiretto, mediante un ponte pentaglicinico (Gram+) diretto, mediante legame peptidico tra acido mesodiaminopimelico e D-alanina (Gram-) Estrema variabilità nella composizione dei legami crociati tetrapeptidici: sono noti oltre 100 tipi di peptidoglicano

27 Parete cellulare Struttura del peptidoglicano (4 di 4) NUMERO DI LEGAMI CROCIATI Oltre che a livello strutturale, la parete dei Gram+ differisce da quella dei Gram- anche per il numero dei legami crociati: nei Gram+: praticamente tutti i residui di NAM sono legati ad un tetrapeptide; nei Gram-: i legami sono più scarsi e, quindi, le maglie più larghe

28 Parete cellulare Funzioni il peptidoglicano conferisce rigidità alla cellula: impedisce la lisi od il collasso della cellula, in risposta a variazioni della pressione osmotica (pressione interna: 5-20 atm!) protegge la cellula da insulti meccanici è responsabile della forma dei batteri il peptidoglicano contribuisce alla patogenicità batterica: protegge la cellula da sostanze tossiche (es. detergenti) ha attività pirogena può interferire con la fagocitosi è mitogeno (induce la mitosi dei linfociti) TUTTAVIA, la parete cellulare: è sensibile al lisozima (lacrime, muco, saliva) che attacca lo scheletro glicanico a livello del legame β(1-4) glicosidico lisandosi (in presenza di penicillina, ad esempio), genera cellule osmoticamente sensibili che non lisano soltanto in ambiente isotonico: protoplasto (Gram+), cellula priva di residui di parete cellulare sferoplasto (Gram-), cellula dotata di frammenti di parete cellulare forme L: sferoplasto/protoplasto in grado di crescere; reversibili (allontanamento dell induttore) od irreversibili; responsabili della cronicizzazione dell infezione (antibiotico-r, immuno-elusione) è riconosciuta come target da alcuni antibiotici (β-lattamici) può essere riconosciuta dal sistema immune ospite(immunogenicità)

29 sferoplasti protoplasto

30 Parete cellulare Gram-positivi Formata da peptidoglicano multistratificato e ispessito Å; fino a 40 strati concentrici; 40-80% peso secco Acidi teicoici (dal greco τεικος= muro): polimeri di poliol- (glicerolo, ribitolo) fosfati solubili in H 2 O responsabili della carica complessiva della superficie cellulare legati covalentemente al peptidoglicano legano Ca 2+ e Mg 2+, trasportandoli, in parte, nella cellula funzione di adesine (batteriofagi) immunogeni (principali antigeni di superficie: sierotipo) Acidi lipoteicoici: acidi teicoici contenenti un acido grasso ancorati (mediante l acido grasso) alla m. citoplasmatica secreti e rilasciati nel mezzo colturale; nell uomo possono svolgere attività endotossica funzione di adesine immunogeni (determinanti sierotipo batterico) Carboidrati: carboidrato C, criterio classificativo negli streptococchi Proteine: proteina M (S. pyogenes: antifagocitaria, adesività a mucose) proteina A (S. aureus: lega Fc anticorpale inibendo immuncomplesso e attivazione Complemento)

31 Parete cellulare Gram-positivi

32 Parete cellulare Gram-negativi: parete e membrana esterna Strutturalmente e chimicamente più complessa di quella dei Gram+, la parete cellulare dei Gram- è formata da un sottile (20-30 Å; 2-3 strati concentrici; 5% peso secco) strato di peptidoglicano, rivestito da una membrana esterna, Membrana esterna: Legata al peptidoglicano mediante lipoproteine, piccole proteine con funzione di ancoraggio: la parte proteica, legata al peptidoglicano, quella lipidica, inserita nel foglietto interno della membrana esterna. A differenza delle classiche membrane biologiche, lo strato esterno è composto da una molecola amfipatica: il lipopolisaccaride (LPS) Attraversata da proteine adibite al trasporto (porine) Si oppone maggiormente, rispetto alla m. citoplasmatica, al passaggio di molecole idrofobiche (es. sali biliari, per la presenza di catene laterali O, idrofiliche, del LPS) e di grosse molecole idrofiliche (per il doppio strato fosfolipidico) Protegge la cellula da ambienti avversi (acidità gastrica) Viene distrutta dai chelanti di Ca 2+ e Mg 2+ e da antibiotici (polimixina B) dando vita allo sferoplasto, cellula sensibile a minime variazioni osmotiche

33 Parete cellulare Gram-negativi: porine Le porine sono organizzate in omotrimeri a formare canali (pori) che permettono il passaggio di sostanze idrofiliche attraverso la membrana esterna: Porine aspecifiche (passaggio di molecole con PM < 600 Da) OmpF, OmpC: diffusione di ioni ed altre piccole molecole idrofile PhoE: indotta da phosphate starvation, consente il passaggio di molecole idrofile cariche negativamente Porine specifiche (passaggio di molecole più grandi) Btu: vitamina B12 LamB: indotta da maltosio ed altre maltodestrine nel mezzo FhuA: uptake del ferro Ruolo nella antibiotico-resistenza: sostituzione di aminoacidi neutri con aminoacidi carichi che si proiettano all interno del poro e perturbano il normale passaggio degli antibiotici in presenza di antibiotico viene diminuita/eliminata l espressione delle porine implicate nel suo uptake cellulare Funzione recettoriale per: fagi, batteriocine, componenti del Complemento, anticorpi Fattori di patogenicità batterica: promuovono l invasione delle cellule dell ospite, l adesione, l attività citotossica

34 Parete cellulare Gram-negativi: lipopolisaccaride (LPS) Il lipopolisaccaride (LPS o endotossina) è il fattore di virulenza che caratterizza l azione patogena dei Gram-negativi. E formato da 3 parti: LIPIDE A (gruppo-specifico): glicosfosfolipide; frazione endotossica ancorata alla membrana esterna tramite acidi grassi, con i suoi gruppi P laterali unisce LPS adiacenti; altamente conservato nei Gram- CORE (specie-specifico): polisaccaride ramificato (9-12 zuccheri, di cui i peculiari ac. cheto-deossi-octonico ed un eptoso) ANTIGENE O (sierotipo): polisaccaride lineare ( unità ripetute, 4-7 zuccheri/unità); determina il sierotipo (2.000 in Salmonella, 150 in E. coli)

35 Parete cellulare Gram-negativi: effetti biologici del LPS LPS rappresenta una importante struttura di superficie che consente la interazione dell'agente patogeno con il suo ospite. Infatti, esso può essere coinvolto: nell'adesione (colonizzazione); nella resistenza alla fagocitosi; è sede di determinanti antigenici (immunogeno); se liberato in un ospite sensibile, dà luogo a numerosi effetti tossici (ENDOTOSSINA BATTERICA) EFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA 1) Effetto pirogeno (capacità di indurre febbre anche a basse dosi) 2) Attiva vari tipi cellulari: - macrofagi (aumento della fagocitosi e capacità battericida, produzione di monochine attive su vari altri tipi cellulari e tessuti) - linfociti B (proliferazione e differenziazione in plasmacellule) - cellule endoteliali - piastrine - granulociti 3) Induce infiammazione 4) Induce vasodilatazione con conseguente ipotensione e shock 5) Attiva il Complemento 6) Stimola la coagulazione del sangue (CID, coagulazione intravasale disseminata)

36 Parete cellulare Gram-negativi: effetti biologici dell LPS RUOLO DELL'ENDOTOSSINA NELLO SHOCK ENDOTOSSICO Shock endotossico: grave quadro clinico che può accompagnare le setticemie da batteri Gram- caratterizzato da febbre, ipotensione, acidosi, insufficienza renale e respiratoria e, nelle fasi finali, da coagulazione intravasale disseminata (CID/DIC) ed insufficienza d organo. Frequenza: 1% dei pazienti ospedalizzati sviluppa sepsi; 20-30% nei reparti di terapia intensiva. Esito fatale: 40-60% dei pazienti, nonostante la terapia antibiotica.

37 Parete cellulare Gram-negativi: spazio periplasmico Lo spazio spazio periplasmico è la zona compresa tra: membrana citoplasmatica e peptidoglicano (Gram+) membrana citoplasmatica e membrana esterna (Gram-) Contiene il periplasma, di consistenza gelatinosa, che occupa circa il 20-40% del volume totale cellulare Nello spazio periplasmico si trovano: proteine di trasporto: per zuccheri, aminoacidi, fosfato, vitamine. enzimi periplasmici (Gram-) per l acquisizione di nutrienti, il trasporto elettronico, la sintesi del peptidoglicano e la modificazione di sostanze tossiche (es. β-lattamasi vs antibiotici β-lattamici). nei Gram+, gli esoenzimi sono gli equivalenti degli enzimi periplasmici oligosaccaridi di membrana; in caso di ridotta osmolarità ambientale.

38 Parete cellulare Gram-negativi

39 Parete cellulare Gram+ vs Gram-

40 Parete cellulare Gram+ vs Gram-

41 Parete cellulare Casi particolari Micobatteri: parete cellulare a struttura complessa (simile a quella dei Gram+) in cui il peptidoglicano è intrecciato e legato covalentemente ad un polimero di arabinogalattano e circondato da uno strato di lipidi complessati con le cere formate dagli acidi grassi a lunga catena (acidi micolici) dotate di potente azione adiuvante la patogenicità. Lipidi con acidi micolici sono presenti anche nei corinebatteri ed in Nocardia Micoplasmi: assenza di parete cellulare e presenza di steroli nella membrana citoplasmatica

42 Cellula batterica Strutture esterne

43 Cellula batterica Strutture esterne: glicocalice Glicocalice: rivestimento esterno cellulare, composto generalmente da carboidrati (S. pneumoniae, Neisseria), ma anche da proteine (poli-d-glutammato in B. anthracis) Tipologia: 1. Capsula: altamente organizzata, fortemente adesa 2. Strato mucoso (slime): diffuso, scarsamente adeso ed organizzato Sintesi regolata da fattori: - genetici (geni codificanti la capsula), fenotipici (composizione terreno, fase di crescita, fattori ambientali) Funzioni: protegge la cellula da disidratazione e perdita di nutrienti interferisce con il trasporto di molecole idrofobiche tossiche (detergenti) protegge la cellule dalle difese dell ospite: risposta immune, fagocitosi, etc. adesione ai tessuti, formazione di biofilm

44 Cellula batterica Strutture esterne: glicocalice Biofilm: dinamica di formazione Glicocalice: colorazione con inchiostro di china

45 Cellula batterica Strutture esterne: flagelli Il flagello risulta composto da tre parti: filamento: lungo, struttura elicoidale formata da subunità proteiche (flagellina) uncino: membrana (guaina) curvata corpo basale: formato da anelli ancorati alla parete cellulare La sintesi del flagello è regolata da circa 20 geni. Il flagello è un fattore di virulenza poichè consente al batterio la motilità e l adesione a superfici abiotiche/biotiche. Tuttavia, il flagello è immunogeno e quindi viene frequentemente utilizzato dal sistema immune dell ospite per individuare il batterio

46 Cellula batterica Strutture esterne: flagelli Composizione: - Proteica: flagellina (antigene H), proteina la cui composizione aminoacidica è specie-specifica - A differenza del flagello eucariotico, non presenta una organizzazione Il numero e l organizzazione dei flagelli sono variabili: monotrìco: singolo flagello ad una estremità (P. aeruginosa, V. cholerae) lofotrìco: ciuffo di flagelli ad una estremità (H. pylori) amfitrìco: un flagello ad ogni estremità peritrìco: flagelli disposti attorno alla cellula (P. mirabilis, E. coli)

47 Cellula batterica Strutture esterne: flagelli Il flagello guida il batterio in una direzione (movimento direzionale), in risposta ad uno stimolo esterno: - stimolo chimico: chemotassi (positiva o negativa) - stimolo luminoso: fototassi Il segnale attiva un movimento rotatorio di 360 in senso antiorario (run, in avanti con direzione) od orario (tumble o rotolamento per interruzione del run) In presenza di un gradiente attraente (positivo), il numero dei tumbles si riduce favorendo runs più lunghe

48 Cellula batterica Strutture esterne: flagelli TIPOLOGIE DI MOTILITA Swimming: flagellare movimento in un mezzo liquido Twitching composito (flagella + pili tipo IV) movimento per strisciamento su superfici (mucose, abiotiche) Swarming flagellare indotta dal contatto con superfici aventi una appropriata viscosità e composizione caratterizzata dal differenziamento di cellule vegetative in cellule swarm, lunghe ed iperflagellate

49 Cellula batterica Strutture esterne: fimbrie e pili Fimbria (lat., fimbriae: frangie) e pilo (lat., pilus: pelo): polimeri di pilina Caratteristicamente più corti, più sottili e più numerosi dei flagelli (eccezionalmente possono arrivare fino a 20 µm) Disposti generalmente intorno alla cellula Consentono l adesione intercellulare ed a superfici abiotiche (inerti) e biotiche (epiteli) (esempio: E. coli, N. gonhorroeae). Inoltre, in azione combinata con i flagelli, consentono alla cellula di strisciare su superfici solide (twitching) Pili sessuali (pili F): mediano il trasferimento intercellulare di materiale genetico durante la coniugazione

50 Cellula batterica Strutture esterne: filamenti assiali Filamento assiale: Struttura periplasmica, formata da flagelli intracellulari, localizzati tra la parete cellulare e membrana esterna delle Spirochete (dal greco speira: spirale) Contraendosi, impartiscono alla cellula un movimento per torsione e flessione Treponema pallidum (spirocheta), agente eziologico della sifilide

51 Cellula batterica Endospore