Caratteristiche strutturali e funzionali della cellula procariotica. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/3

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1 Caratteristiche strutturali e funzionali della cellula procariotica

2 Forme di vari procarioti

3 Cocchi Neisseria meningitidis - Gram-negative, coccus prokar yote (dividing); causes meningitis Enterococcus faecium - Gram-positive, coccus prokaryote (dividing); causes intestinal and skin / wound infections. Streptococcus faecalis - coccoid prokaryote (dividing); a pathogen causing skin andwound infections Staphylococcus aureus - a pathogen that causes sinusitis, food poisoning, toxic shock syndrome and skin and wound infections (scarlet fever.)

4 Bastoncelli E. coli - Gram-negative, facultatively anaerobic, rod prokaryote. Part of human and animal microbiota. E. coli can cause urinary tract infections, traveler's diarrhea and nosocomial infections. Lactobacillus sp. - regular, nonsporing, Gram-positive, rod prokaryote. Important in commercial lactic acid production (food products). Human microbiota (oral cavity,vaginal tract and intestine). Pseudomonas aeruginosa- causes skin infections, urinary tract infections and septicemia. Bacillus megaterium, a large rod bacterium

5 Vibrio cholerae - Gram-negative, facultatively anaerobic, curved (vibrio-shaped), rod prokaryote; causes Asiatic cholera. Rhodococcus fascians - Gram-positive, filamentous prokaryote that fragments into rod or coccoid shapes. Actinomycete (Nocardioform). Haemophilus influenzae -Coccobacillus-shaped Bacterium(causes meningitis/pneumonia), Spirulina sp. - Gram negative, oxygenic, photosynthetic, filamentous (spiral-shaped) cyanobacterium (prokaryote).

6 Dimensioni di vari procarioti DIAMETRI Tra i più piccoli: 0.2 µm Tra i più grandi: 50 µm LUNGHEZZE Tra i più piccoli: 0.2 µm Tra i più grandi: 0.5 mm Unità di misura * centi- (10-2 ) * milli- (10-3 ) * micro- (10-6 ) * nano- (10-9 ) * Ångstrom (10-8 cm., 0.1 nm) Fig. 4.13

7 Batterio gigante Epulopiscium fishelsoni 50µmX0,5mm Fig. 4.12

8 Superficie Area vs. Volume S V = 3 r Lo scambio con l esterno aumenta con il diminuire della taglia cellulare Cellule piccole! metabolismo accelerato, sviluppo rapido ed elevato numero di cellule Fig. 4.14

9 Cellula batterica

10 Strutture trovate in maniera universale nei batteri Alcune strutture, come l'rna, il DNA e le proteine, sono presenti in tutti gli organismi e quindi anche nei batteri. Inoltre tutti i microbi possiedono una membrana cellulare e, molti ma non tutti, hanno una parete cellulare.

11 Doppio strato fosfolipidico 8nm Fig. 4.15

12 Il doppio strato lipidico A causa della presenza nei fosfolipidi di una testa idrofilica ed un coda idrofobica, quando si trovano in soluzione acquosa tendono ad associarsi in un doppio strato in modo da esporre le teste polari all acqua, e le code idrofobiche tra di loro. Questa formazione viene definita doppio strato lipidico. Alcune proteine si trovano sia sulla superficie esterna, interna e dentro la membrana, mentre altre sono associate solamente all esterno o all interno. Spesso le proteine che attraversano tutto il doppio strato lipidico sono coinvolte nel trasporto o nella generazione di energia.

13 Fig Struttura della membrana citoplasmatica. Questo schema del modello a mosaico fluido della struttura della membrana batterica mostra le proteine integrali immerse in un doppio strato lipidico. Le proteine periferiche sono debolmente associate alla superficie di membrana. Le sferule rappresentano le estremità idrofile dei fosfolipidi di membrana, mentre le code ondulate rappresentano le catene idrofobe degli acidi grassi. Possono essere presenti altri lipidi di membrana come gli opanoidi.

14 Stabilizzazione delle membrane La membrana citoplasmatica è stabilizzata dalle interazioni idrofobiche e legami idrogeno tra lipidi vicini. Legami idrogeno possono formarsi anche tra le proteine ed i lipidi di membrana. Le cariche negative sulle proteine possono formare interazioni ioniche con cationi divalenti come Mg+2 e Ca+2. Alcune proteine si muovono entro il piano della membrana mentre altre sono ancorate a strutture dentro o vicino la membrana. Il risultato è che la membrana è praticamente fluida con la consistenza di un olio. E stata quindi definita un mosaico fluido: mosaico perché c è un pattern definito, fluido perché i lipidi sono liberi di muoversi lungo la membrana. Questa organizzazione conferisce alla membrana un certo numero di proprietà che le consentono di svolgere molte funzioni.

15 Caratteristiche della membrana citoplasmatica nei procarioti assenza di steroli, ma presenza di molecole pentacicliche simili agli steroli detti opanoidi. Gli opanoidi probabilmente hanno la funzione di stabilizzare la membrana batterica Spessore di circa 5-10 nm presenza di fosfolipidi Presenza di proteine integrali e periferiche

16 sterolo colesterolo opanoide diploptene Molecole planari e rigide Fig. 4.18

17 I lipidi nei Batteri e negli Archaea hanno legami chimici diversi Estere - Batteri Etere - Archaea isoprene Fig. 4.19

18 Fig. 4.20

19 Fig. 4.21

20 Funzioni della membrana Separa il macchinario altamente organizzato della cellula dall ambiente esterno Interazione con l ambiente esterno: assunzione di sostanze nutritive e eliminazione dei metaboliti di rifiuto Individuazione dei segnali ambientali per la chemiotassi Centro di attività metaboliche: respirazione fotosintesi sintesi dei lipidi sintesi dei costituenti parietali IMPORTANTE: le membrane non sono una struttura statica, sono sempre in movimento

21 Funzioni della membrana Fig. 4.21

22 Fig. 4.22

23 Proteine della membrana plasmatica " permeasi: responsabili del trasporto dei nutrienti " enzimi biosintetici: catalizzano le reazioni terminali della sintesi dei lipidi e di varie classi di macromolecole che compongono la parete cellulare batterica " proteine coinvolte nella generazione di ATP durante il trasporto degli elettroni " sulla membrana batterica sono presenti dal 10 al 20% delle proteine totali della cellula

24 controllato dall energia associata alla forza protonmotrice modificazione chimica della sostanza trasportata controllata dal fosfenolpiruvato coinvolge proteine di legame periplasmatiche e l energia viene fornita dall ATP Fig. 4.23

25 Tipologie di trasporto Fig. 4.24

26 Lac permeasi: symporter Fig. 4.25

27 Traslocazione di gruppo: il sistema delle fosfotransferasi Fig. 4.26

28 Sistemi di trasporto ABC: ATP-Binding- Cassette Fig. 4.27

29 Proteine di esportazione Es. amilasi e cellulasi sono secrete nel mezzo esterno dove idrolizzano rispettivamente amido e cellulosa Necessità di traslocasi es. sistema Sec (secrezione) Sequenza segnale: posta all N-terminale, contiene residui carichi + all inizio, seguiti da una regione centrale con aminoacidi idrofobici e da una regione con con residui polari La selezione viene effettuata dalle particelle per il riconoscimento del segnale (SRP, signal recognition particles) che nei batteri è costituita da una proteina e una molecola di RNA 4,5S. La SRP riconosce la proteina con il segnale e la rilascia in un particolare complesso di membrana (Es. SecYEG) (par. 4.7 e 7.16)

30 Membrane e antibiotici Alcuni antibiotici sono diretti contro le membrane (Polimixina B e Gramicidina). L uso di questi antibiotici deve essere limitato in quanto anche noi possediamo un membrana plasmatica, molto simile a quella dei procarioti. Per questo motivo, questi antibiotici devono essere usati solo per uso topico e a basse dosi.

31 La parete delle cellule procariotiche La parete cellulare è una delle parti più importanti della cellula procariotica Ne condiziona la forma e protegge dalla lisi osmotica Può avere delle componenti importanti nella patogenicità Conferisce una certa protezione verso le sostanze tossiche Rappresenta il sito di azione di molti antibiotici La sua composizione fa reagire diversamente alla colorazione di Gram, che può essere usata per la classificazione

32 Tecnica di colorazione Gram (1884) Colorazione con il cristal violetto (colorante basico) fissaggio con iodio Decolorazione con acetone (etanolo) Colorazione con safraina: gram+: porpora gram-: rossi Questa fase determina l aspetto differenziale della colorazione: i gram+ resistono all azione della decolorazione trattenendo il cristal violetto i gram- perdono completamente il colorante

33 La colorazione Gram Fig. 4.4

34 La colorazione Gram Fig. 4.4

35 A La colorazione Gram B A- Stafilococchi ( Gram+) B- E. coli (Gram -)

36 Gram+ e Gram- a confronto Fig. 4.28

37 Peptidoglicano Il peptidoglicano è un polimero formato da molte subunità uguali. I componenti base sono l Nacetilglucosammina (NAG), l acido N-acetilmuramico (NAM) e molti diversi amminoacidi tra i quali L acido D-glutammico, la D- alanina e l acido mesodiaminopimelico. Normalmente nelle proteine si trova la forma L degli amminoacidi. I batteri usano i D-amminoacidi per la sintesi della parete cellulare. Le racemasi sono gli enzimi che convertono la forma L- in D- e viceversa. Fig. 4.30

38 acido diaminopimelico lisina

39 Le catene delle subunità peptidoglicaniche adiacenti sono unite per mezzo di un legame trasverso tra i peptidi Legami crociati del peptidoglicano. a) peptidoglicano di E. coli (gram-), con legame crociato diretto. b) peptidoglicano di Staphylococcus aureus (gram+). a) b) NAM NAG NAM NAG L-Ala D-Glu DAP D-Ala D-Ala DAP D-Glu L-Ala L-Ala D-GluNH2 L-Lys D-Ala Gly -Gly -Gly -Gly -Gly- D-Ala L-Lys D-GluNH2 L-Ala NAM NAG NAM NAG

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42 Gram+ la parete è formata da un unico strato omogeneo di peptidoglicano, detto anche mureina, dello spessore di nm, posto al di fuori della membrana citoplasmatica la parete è più sottile ed al microscopio elettronico appare più liscia Envelope: involucro esterno per indicare tutte le strutture esterne alla membrana citoplasmatica, compresa la parete e la capsula

43 Caratteristiche della parete dei batteri Gram +: gli acici teicoici Gli acidi teicoici sono polimeri di alcoli polivalenti (glicerolo e ribitolo) uniti da legami fosfodiesterici. Gli amminoacidi, come la D-Ala, e gli zuccheri, sono attaccati in posizione 2 o 3 al glicerolo (3 o 4 nel caso del ribitolo). Gli acidi teicoici sono associati sia con il peptidoglicano che con i glicolipidi della membrana citoplasmatica (acidi lipoteicoici). Fig. 4.32

44 Caratteristiche della parete dei batteri Gram +: gli acici teicoici Sono responsabili della carica negativa sulla superficie cellulare e possono contribuire al passaggio di ioni. Gli acidi teicoici che sono strettamente legati ai lipidi sono chiamati Acidi lipoteicoici Nella maggior parte dei batteri Gram+ le pareti non contengono lipidi o proteine (eccezioni: corinebatteri, nocardie, micobatteri)

45 Gram - Figura 4.36

46 Gram- la parete è più complessa: comprende uno strato sottile (1-3nm) di p e p t i d o g l i c a n o, circondato da una membrana esterna di 7-8nm di spessore Spazio periplasmatico: spazio interposto tra la m e m b r a n a citoplasmatica e la membrana esterna. In questo spazio sono presenti enzimi per l assunzione di nutrienti Figura 4.36

47 Caratteristiche della parete dei batteri Gram - Il peptidoglicano contiene meno cross-link senza ponte peptidico. La lipoproteina di Braun è legata in maniera covalente al peptidoglicano ed alla membrana esterna con dei residui idrofobici. Tramite questa proteina il peptidoglicano è fortemente legato alla membrana esterna. La membrana esterna, gioca un ruolo importante nella virulenza dei gram-. Questa membrana è costituita da un doppio strato lipidico (come la membrana citoplasmatica), contiene inoltre i lipopolisaccaridi (LPS). Nella membrana esterna si distinguono due lati: il lato esterno, contenente i lipopolisaccaridi, ed il lato interno verso il peptidoglicano.

48 Caratteristiche della parete dei batteri Gram-: i lipopolisaccaridi Esterno unità tetra o pentasaccaridiche e esosi acido 2-cheto-3-deossiottonico KDO eptosio Figura 4.35

49 I LPS contribuiscono a formare la carica negativa della superficie batterica. La catena laterale O è una corta catena polisaccaridica che si proietta dal nucleo verso l esterno. Benché la catene laterali O siano facilmente riconosciute dagli anticorpi dell ospite, i batteri modificando la natura delle catene laterali riescono ad evitare il riconoscimento. Il lipide A è saldamente ancorato alla membrana esterna, mentre la parte restante della molecola dell LPS si proietta dalla superficie verso l esterno. Il nucleo polisaccaridico è legato al lipide A. Il lipide A è un costituente della membrana esterna, contribuisce a stabilizzare la struttura della membrana ed è spesso tossico. I LPS possono agire come un endotossina e causare i sintomi che caratterizzano le infezioni da gram- come Salmonella, Shigella ed Escherichia.

50 Caratteristiche della parete dei batteri Gram-: la lipoproteina mureinica Lipoproteina mureinica Nella regione C-term un residuo di Lys si lega ad un residuo di acido meso-amino-pimelico La lipoproteina mureinica non è essenziale per la sopravvivenza

51 Caratteristiche della parete dei batteri Gram-: le porine PORINE Le porine sono aggregate tre a tre e formano dei canali attraverso la membrana che permettono il passaggio per diffusione di alcune piccole molecole ( Da). La sintesi delle porine è strettamente regolata

52 Caratteristiche della parete dei batteri Gram-: lo spazio periplasmatico SPAZIO PERIPLASMATICO Nello spazio periplasmatico si trovano numerose proteine con le più svariate funzioni: Enzimi idrolitici proteine per il trasporto (proteine leganti) chemorecettori enzimi detossificanti (es beta-lattamasi) protezione osmotica Lipoproteina mureinica

53 Correlazione tra la struttura della parete cellulare e la colorazione Gram Nella colorazione si forma all interno delle cellule un complesso insolubile di cristal-violetto che viene estratto dall alcol nei batteri Gram-, ma non nei Gram+. La spessa parete dei Gram+ si disidrata in presenza di alcol, i pori della membrana si chiudono ed il colorante non può uscire. Nei Gram -, il sottile strato di peptidoglicano non riesce ad ostacolare il passaggio del solvente quindi il complesso cristal-violetto viene facilmente rilasciato.

54 Cellule senza parete lisozima: rompe i legami #1,4 tra l NAG e NAM. La cellula priva di parete viene definita protoplasto Terreni isotonici: possono prevenire la rottura della cellula

55 Fig. 4.33

56 Pseudopeptidoglicano N-acetiltalosaminurorico

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