Escherichia coli. Applicazioni biotecnologie con microrganismi procarioti. Una delle speci batteriche più biotecnologica è senza dubbio
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- Norma Ruggiero
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1 Applicazioni biotecnologie con microrganismi procarioti Escherichia coli, Bacillus subtilis con altri batteri appartenenti ai generi Pseudomonas, Rhizobium, Lactobacillus possono essere usati: - piani di risanamento ambientale (bioremediation( bioremediation/biosensori) - produzione di prodotti industriali: es. polidrossialcanoati (plastiche biodegradabili), polisaccaridi (gomme ), cellulosa - In agricoltura: pratiche di biocontrollo e preservazione delle colture (Pseudomonas( Pseudomonas) - Biotecnologie alimentari, probiotici, drug delivery - produzione di proteine eterologhe (ricombinanti) Applicazioni biotecnologie con batteri Gram-negativi negativi: : proteine eterologhe Una delle speci batteriche più biotecnologica è senza dubbio Escherichia coli Ospite per l espressione l di proteine eterologhe sia procariotiche che eucariotiche d interesse d biotecnologico Qual è lo scopo dell espressione espressione di proteine eterologhe in E. coli? Ottenere una certa quantità di un prodotto proteico d interesse d purificato: ad es. enzimi catalitici per industria e ricerca (es. lipasi, proteasi), agenti terapeutici (es( insulina), produzione di vaccini Utilizzare le cellule intere di E. coli che esprimono un certo enzima eterologo come biocatalizzatori (biotrasformazioni)) al fine di produrre molecole organiche di alto valore aggiunto (Vitamina( C, aspartame).
2 Perché utilizzare Escherichia coli? (o comunque microrganismi?) La produzione di proteine eterologhe (soprattutto per usi industriali) richiede processi che diano rese alte sia quantitativamente che qualitativamente (cioè proteina integra e biologicamente attiva) I microrganismi garantiscono il soddisfacimento di questi requisiti per: facilità di crescita, ottenimento di grandi quantità di biomassa, facilità di recupero/purificazione della proteina di interesse, minore presenza di contaminanti e/o allergeni. Vantaggi economici ed etici. Come si arriva alla produzione di proteine di interesse (eterologhe) nell ospite (es. E. coli?) Clonaggio del gene corrispondente In modo che: Il gene venga espresso e la proteina prodotta in maniera riproducibile ed affidabile La proteina sia stabile e biologicamente attiva La proteina sia purificabile e (facilmente) riestraibile dal bioreattore
3 Escherichia coli coli (TEM x 92,750) Escherichia coli 3 µm Batterio Gram-negativo Enterobatterio Bastoncello dimensioni 1 x 3 µm Anaerobio facoltativo Metabolismo sia respiratorio (resp( resp. aerobica ed anaerobica) che fermentativo LogN Agitazione (O 2 ) 3x10 9 cells/ml Statico 3x10 8 cells/ml tempo Capacità di crescere in terreni definiti (minimi) Elevata velocità di crescita (tempo di generazione minuti in terreno ricco) Respirazione anaerobia Possono fungere da accettore di elettroni (in ordine di efficienza energetica): NO3 NO2 Fumarato DMSO (di( di-metil-sulfossido) TMAO (ossido di trimetilamina)
4 Escherichia coli 3 µm Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Genoma: : cromosoma circolare interamente sequenziato Presenza di plasmidi stabili Plasmidi MOLECOLE DI DNA CAPACI DI REPLICAZIONE AUTONOMA (DIMENSIONI ca kbp) DNA CIRCOLARE CHIUSO, SUPERAVVOLTO PRESENTI IN UN NUMERO DI COPIE DIPENDENTE DALLA LORO ORIGINE DI REPLICAZIONE (plasmidi generalmente usati per applicazioni biotecnologiche: copie/cellula) GENI PER LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI (MARKER SELETTIVI) bla= resist. ampicillina ColE1= origine di replicazione La regione di importanza clou del vettore d espressione: il Multiple Cloning Site (MCS) Il gene codificante la proteina di interesse deve essere clonato (=inserito) nel vettore d espressione a valle di un promotore specifico. A questo scopo il vettore di espressione contiene un multiple cloning site, cioè una sequenza ricca in sequenze di riconoscimento di nucleasi di restrizione (siti di restrizione)
5 L uso di enzimi di restrizione è alla base di gran parte delle tecnologie del DNA ricombinante Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza specifica sul DNA e introducono un taglio a doppia elica in prossimità (Enzimi di classe I, classe III) o in corrispondenza (Enzimi di classe II) del sito di riconoscimento. Sono disponibili un alto numero di Nucleasi di restrizione di classe II che riconoscono siti di legame diversi e tagliano il DNA con risultati diversi (estremità coesive 5 o 3 ) o taglio blunt end. L uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare
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