ENZIMI DI RESTRIZIONE E DNA RICOMBINANTE

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1 ENZIMI DI RESTRIZIONE E DNA RICOMBINANTE

2 GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE Sono enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze (frammenti non casuali). La grandezza dei frammenti dipende unicamente dalla sequenza. Sono detti anche endonucleasi di restrizione (invece le esonucleasi distruggono il DNA partendo dalle estremità). Sono prodotti e utilizzati dai batteri come sistema di difesa nei confronti dei virus Ne esistono molti tipi diversi, ognuno dei quali riconosce una sequenza particolare. Forniscono un formidabile strumento per le analisi (mutazioni del DNA) e per la manipolazione del DNA (DNA ricombinante)

3 GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE Tutti gli enzimi di restrizione (idrolasi) presentano due caratteristiche fondamentali: Tagliano entrambe le eliche del DNA Effettuano il taglio in corrispondenza di specifiche sequenze bersaglio Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato in Escherichia coli, il primo enzima di restrizione (tipo II) che taglia il DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica. La metilazione protegge le sequenze del batterio

4 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile Sono stati isolati più di 2000 enzimi da procarioti Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche Sono generalmente sequenze palindromiche (4, 6 o 8 nucleotidi) ovvero sequenze a simmetria binaria; presentano la stessa sequenza se vengono lette in direzione 5 3 Hae III 5 GGCC 3 3 CCGG 5 Not I 5 GCGGCCGC 3 3 CGCCGGCG 5 Eco RI 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5

5 ENZIMI DI RESTRIZIONE

6 ENZIMI DI RESTRIZIONE Gli enzimi di restrizione possono produrre due tipologie di estremità: Estremità coesive (sticky ends): estremità sfalsate perché l enzima ha idrolizzato su un filamento un legame fosfodiestere distante alcune basi da quello dell altro filamento. Le estremità dei due filamenti sono complementari. Estremità piatte (blunt ends): il taglio avviene nel mezzo della sequenza di riconoscimento. EcoRI SmaI

7 INGEGNERIA GENETICA Ingegneria genetica: insieme di tecniche che consentono di manipolare in maniera mirata l informazione genetica di un organismo, agendo direttamente sul DNA Monod scrive: La genetica molecolare di oggi non solo non ci offre alcun mezzo per agire sul patrimonio genetico ereditario e arricchirlo di caratteri nuovi, per creare un superuomo genetico, ma anzi denuncia la vanità di una simile speranza: la scala microscopica del genoma vieta per il momento e forse per sempre simili manipolazioni 1972 Primo esperimento di manipolazione genetica (Paul Berg costruisce la prima chimera genetica (DNA di virus SV40, DNA di Lamda e DNA di Escherichia Coli). Nasce l ingegneria genetica

8 APPLICAZIONI DELL INGEGNERIA GENETICA Alterare il fenotipo di un organismo in maniera mirata e non casuale come avviene in natura Eliminazione di un gene dal genoma di un organismo Aggiunta di un gene nel genoma di un organismo Trasferimento di informazione genetiche da un organismo ad un altro Generazione di organismi con DNA ibrido (geneticamente modificato) Sviluppo delle biotecnologie moderne Biotecnologie avanzate: applicazioni delle tecniche di ingegneria genetica, per la realizzazione di processi o prodotti destinati ad usi specifici.

9 DNA RICOMBINANTE Due tratti di DNA che in natura non sono adiacenti, vengono uniti in provetta. I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di restrizione. EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G

10 Le estremità coesive prodotte da uno stesso enzima possono appaiarsi. G CTTAA AATTC G GAATTC CTTAAG

11 Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare covalentemente le due molecole di DNA OH P OH P 5 3 G AATTC CTTAA G 5 3 G AATTC CTTAA G P OH P OH OH P 5 3 GAATTC CTTAAG 3 5 P OH DNA LIGASI ATP 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5

12 UTILIZZO DI ENZIMI CHE PRODUCONO ESTREMITA NETTE (BLUNT) Le estremità nette prodotte da un enzima di restrizione possono essere legate ad altre estremità nette prodotte da qualsiasi enzima, senza limitazioni imposte dalla complementarietà delle basi delle code appiccicose CCC GGG GGG CCC GAT/ATC CTA/TAG SmaI EcoRV CCC ATC GGGTAG SVANTAGGI: La ligasi di estremità blunt è meno efficiente. La sequenza ibrida che si forma non è riconosciuta da nessuno dei due enzimi.