La principale caratteristica che li contraddistingue é relativa alle dimensioni dell'inserto di DNA che ogni vettore può accettare.

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2 Clonare un gene significa isolarlo da un genoma ed inserirlo in un vettore capace di replicarsi in un dato ospite (di solito E.coli o lievito). Esistono diversi tipi di vettori di clonaggio, ciascuno con diverse caratteristiche. La principale caratteristica che li contraddistingue é relativa alle dimensioni dell'inserto di DNA che ogni vettore può accettare. PLASMIDI < 10 Kb FAGI < 23 kb COSMIDI kb PAC kb BAC < 300 kb YAC Mb

3 Plasmide non integrativo Episoma

4 Vettori Plasmidici I vettori plasmidici sono derivati dai plasmidi batterici naturali. I plasmidi sono degli elementi genetici extracromosomali che si replicano autonomamente. Possono essere lineari o integrati nel cromosoma batterico (episomi) ma, nella maggior parte dei casi, sono molecole di DNA circolare. Le caratteristiche comuni a qualsiasi vettore plasmidico sono: Origine di replicazione Marcatore selezionabile Vettore Plasmidico Siti di restrizione unici

5 Marcatori di Selezione Tutti i vettori di clonaggio presentano almeno un marcatore selezionabile. per selezionare le molecole ricombinanti. Inoltre, sotto un'appropriata pressione selettiva, stabilizzano il plasmide. I marcatori più utilizzati nei batteri sono i geni di resistenza agli antibiotici. Per esempio il gene per la β-lattamasi codifica per un enzima capace di idrolizzare l'anello lattamico degli antibiotici di tipo penicillinico. I batteri che contengono un plasmide con questo gene quindi possono crescere in terreni di coltura che contengono l'ampicillina. Siti di restrizione Per effettuare un clonaggio molecolare é necessario avere sempre almeno un sito unico per un endonucleasi di restrizione, che non deve essere presente in regioni cis essenziali (es. ori o promotori) o in geni che codificano per funzioni essenziali (es. geni di resistenza).

6 Replicazione plasmidica La caratteristica più importante dei plasmidi, quella di essere dei repliconi, cioè molecole capaci di replicazione autonoma, è conferita loro dalla presenza di un origine di replicazione, chiamata ori L origine di replicazione controlla: Il numero di copie La specificità d ospite I gruppi di incompatibilità

7 I plasmidi si replicano con due modalità diverse. in maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico, generalmente quelli di grandi dimensioni, e si dicono a controllo stringente. In genere a basso numero di copie, codificano per proteine necessarie alla loro replicazione. in maniera indipendente dalla replicazione batterica, in genere di piccole dimensioni, e si dicono a controllo rilassato. Ad alto numero di copie, generalmente dipendono da proteine dell ospite per la loro replicazione. Plasmide ori numero di copie PBR322 e derivati PMB PUC e derivati ColE pacyc e derivati p15a psc101 e derivati psc10 1-5

8 Un classico vettore plasmidico

9 Vettore episomale per la trasfezione transiente di cellule di mammifero MCS: Multiple Cloning Site P CMV : promotore del citomegalovirus PA: segnale di poliadenilazione SV40 ori: sequenza di DNA corrispondente all origine di replicazione di SV40 Neo: gene per la selezione codificante la neomicina fosfotransferasi e conferisce alle cellule resistenza all antibiotico G418 Ori: origine di replicazione di E.coli

10 I Batteriofagi I batteriofagi si presentano come placche di lisi su popolazioni batteriche cresciute a confluenza su terreni solidi. Ogni placca rappresenta un clone. Tra i batteriofagi più noti, il fago λ capace di integrarsi nel genoma batterico o il batteriofago µ, che si integra a caso nel cromosoma batterico sfruttando l'enzima transposasi. Il batteriofago λ può utilizzare due stili di vita all'interno del batterio: il ciclo litico e il ciclo lisogenico Nel ciclo litico il batteriofago si replica, si assembla in virione maturo e lisa la cellula ospite. Nel ciclo lisogenico invece il fago é capace di integrare il proprio DNA nel cromosoma b a t t e r i c o, mantenendolo in uno stato profagico inattivo. Il ciclo lisogenico Il ciclo litico

11 In laboratorio, la replicazione e la crescita del fago λ avviene in capsule Petri. Il fago viene mescolato con una coltura di E.coli ad alta densità, in una soluzione di agar chiamata top agar e la soluzione viene versata sulla superficie di una piastra di coltura ed incubata a 37 C. La crescita di λ produce la lisi delle cellule batteriche e viene visualizzata come placche di lisi.

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13 I vettori derivati dal fago λ Il DNA di λ è una molecola lineare a doppio filamento di 48,5 Kb, caratterizzata dalla presenza alle estremità 5 di due estremità coesive a singola elica di 12 nt, chiamate siti cos (cohesive ends), che permettono la circolarizzazione del DNA di λ dopo l infezione della cellula ospite. Il genoma di λ comprende circa 40 geni che possono essere suddivisi in tre gruppi funzionali: La regione sinistra codifica per proteine strutturali della testa e della coda. La regione centrale contiene geni responsabili per la lisogenia. Gran parte di questa regione non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la costruzione di vettori. La regione destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico.

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15 Applicazioni biotecnologiche di λ Il principale campo di applicazione dei batteriofagi, consiste nello sviluppo di diversi tipi di vettori per biologia molecolare. Il più utilizzato è il fago λ, ma anche M13, T3, T7 e f1. Packaging in vitro In una normale infezione litica, λ comincia a replicarsi, producendo lunghi concatenameri, Questi vengono successivamente ridotti in frammenti lineari, delimitati dalle estremità cos, e impacchettati all interno di un capside vuoto. In seguito all assemblaggio con una coda, si ricostituisce un virione maturo e infettivo. Mescolando il DNA da inserire, con due colture di fagi difettivi, uno incapace di introdurre il DNA nei capsidi vuoti e l altro incapace di produrre capsidi vuoti, si riesce a produrre un packaging efficiente.

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19 Cosmidi Un cosmide è un plasmide, ~ 5 Kb, un ibrido tra plasmide e fago, che contiene: un marker selettivo, un origine di replicazione, siti di clonaggio, sequenze cos. La dimensione di un inserto che può essere clonato in un cosmide varia tra 30 e 46Kb. Invece di trasformare la miscela di ligazione per trasformazione, vista la dimensione media di un cosmide ricombinante, si può utilizzare il packaging in vitro. Il cosmide infatti possiede un sito cos è può essere considerato un buon substrato per una reazione di packaging, purchè abbia dimensione comprese tra 37 e 51 Kb.

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21 Poiché i cosmidi sono privi di geni di λ, quando il DNA si trova nelle cellule di E.coli viene mantenuto come plasmide

22 PAC BAC stabili a basso numero di copie basati sul batteriofago P1, per clonare frammenti di DNA <= 100 kb contengono un sito pac, necessario per l impaccamento del DNA ricombinante nelle particelle virali, e due siti loxp I siti loxp sono specifiche sequenze riconosciute dalla ricombinasi fagica, prodotta dal gene cre, che portano alla circolarizzazione del DNA quando questo è iniettato all interno di una cellula ospite che esprima cre Utilizzati per la produzione di genoteche di lievito, topo, Drosophila, uomo si basano sull uso del cromosoma artificiale batterico. Derivano dal fattore sessuale F a singola copia di E.coli e contengono i siti cosn (di λ) e loxp (di P1), due siti di clonaggio e vari siti di restrizione Vengono introdotti in cellule batteriche con buona efficienza di trasformazione Permettono il clonaggio di frammenti di DNA <= 300kb Utilizzati per produrre genoteche di taglia media pari a 125 kb.

23 I fosmidi sono simili ai cosmidi ma sono basati sul plasmide F batterico. Il plasmide è a basso numero di copie, infatti l ospite E. coli ne contiene solo uno. I fosmidi hanno una taglia di circa 40 kb. I fosmidi sono utilizzati per preparare librerie genomiche. Il basso numero di copie comporta maggiore stabilità rispetto a plasmidi ad alto numero di copie. Infatti i fosmidi vengono utilizzati per preparare librerie di genomi complessi. Sono stati utilizzati anche per il sequenziamento del genoma umano.

24 Vettori di clonaggio eucariotici: vettori per lievito I lieviti sono molto utilizzati come organismo ospite perchè, pur essendo unicellulari, sono organismi eucariotici. In generale esistono 2 tipi di vettori in lievito: i vettori d integrazione, che non possono replicare e vengono mantenuti per integrazione nel cromosoma dell ospite e i vettori a replicazione autonoma, che invece possono replicarsi autonomamente. Vettori di integrazione Un tipico vettore d integrazione, chiamato YIp (Yeast Integrative plasmid) è basato su un vettore plasmidico entro il quale si clona la sequenza d interesse. Una volta trasformato in lievito il plasmide verrà mantenuto solo dopo integrazione in un cromosoma mediato dalla ricombinazione omologa tra un marcatore funzionale di lievito e il corrispondente marcatore difettivo in un lievito mutante Vettori autonomi I vettori a replicazione autonoma assicurano alte frequenze di trasformazione e rese più alte. YEp (Yeast Episomal plasmid): basati su un plasmide endogeno di lievito di tipo episomale, il plasmide 2 µ. YCp (Yeast Centromere plasmid) e YAC (Yeast Artificial Chromosome): plasmidi con sequenze ARS (Autonomous Replicating Sequence) come centromeri o telomeri

25 Yeast Integrative Plasmid Yeast Replicative Plasmid Yeast Episomal Plasmid Yeast Centromere Plasmid

26 Una delle principali differenze tra i vettori plasmidici e quelli di lievito risiede nei marcatori di selezione. Infatti, i lieviti sono molto meno resistenti agli antibiotici e la selezione viene di solito effettuata sfruttando la complementazione di mutazioni auxotrofiche nel ceppo di lievito ospite Ap ori YEp trp1 ori 2µ Per esempio, un ceppo di Saccharomices cerevisiae contenente una mutazione nel gene trp1 non sarà in grado di crescere su un terreno privo di triptofano. Se, però, il vettore plasmidico porta un gene trp1 funzionale, i trasformanti potranno crescere selettivamente su terreni privi di triptofano. Tra i marcatori più comunemente impiegati, oltre a trp1, ura3 (uracile), leu2 (leucina) e his3 (istidina).

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29 Inserimento di un gene in un vettore Yip per ricombinazione omologa Ap ori YIp ura3 Inserto Ricombinazione omologa Ura3 - difettivo ura3 Ap ori Inserto ura3

30 YAC Nel caso di genomi grandi e complessi, come quelli dei mammiferi o delle piante superiori, non è opportuno utilizzare genoteche cosmidiche o, ancor meno fagiche o plasmidiche. Il numero di cloni necessari per coprire statisticamente questi genomi sarebbe troppo grande. Il metodo utilizzato quindi consiste nel suddividere il genoma in frammenti molto più grandi, utilizzando appositi vettori come gli YAC (Yeast Artificial Chromosome) I vettori YAC possono accettare inserti grandi fino a 0,5-2Mb, anche se l efficienza di trasformazione è molto bassa. Vengono mantenuti e propagati in E.coli Uno YAC è costituito essenzialmente da: un centromero di lievito due telomeri di lievito un origine di replicazione di lievito (ARS) uno o più siti unici per enzimi di restrizione un marcatore di selezione (di tipo auxotrofico)

31 Clonaggio in vettori YAC Trasformazione in cellule di lievito Ade-, Ura-, Trpe selezione per colonie rosse, URA+, TRP+

32 Protocollo 1. Digerire parzialmente il DNA bersaglio con EcoRI e il vettore YAC con EcoRI e BamHI 2. Separare i due bracci e rimuovere l eventuale frammento stuffer 3. Ligare vettore YAC e inserto 4. Trasformare le cellule di lievito ade-, ura-, trp-, selezionando per i 2 marcatori posizionati ciascuno su un braccio diverso 5. Cellule ade- danno origine a colonie rosse, in presenza di SUP4 si ha soppressione dell effetto della mutazione e colonie bianche. Plasmidi YAC ricombinanti hanno inattivato SUP4 e quindi danno origine a colonie di colore rosso

33 5 dei sistemi di clonaggio utilizzati per costruire le mappe per sequenziare il genoma umano

34 Il Primo Organismo Modello Escherichia coli

35 Il Primo Organismo Modello eucariote Saccharomyces cerevisiae

36 Trasformazione di cellule procariotiche ed eucariotiche L introduzione di DNA esogeno in una cellula viene generalmente definita trasformazione. La possibilità di trasferire DNA esogeno in un organismo modello è alla base delle tecniche di ingegneria genetica. L efficienza di questo passaggio è cruciale per garantire il successo di qualunque clonaggio. Le tecniche di trasferimento genico permettono oggi di trasferire ad alta efficenza, ed in modo controllato DNA ricombinante in una cellula ospite capace di replicarlo. Trasformazione: trasferimento di DNA in cellule ospiti Trasfezione: trasferimento genico mediato da batteriofagi o virus

37 Trasferimento genico mediante elettroporazione Le cellule, in una ssospensione acquosa ad alta concentrazione, vengono incubate con il DNA e poste in una piccola cella con 2 elettrodi collegati ad uno speciale alimentatore. Un breve impulso elettrico, emesso tra i 2 elettrodi, induce l apertura di piccoli fori sulla membrana cellulare. Le cellule vengono poi diluite in terreno liquido ed incubate in agitazione per almeno un ora (recovery). Le cellule possono essere poi utilizzate per esperimenti in transiente, o piastrate su terreno con antibiotico per selezionare i cloni positivi. Espressione stabile Espressione transiente

38 Trasformazione chimica

39 Recovery Periodo di recupero in terreno liquido che permette al plasmide di replicarsi nelle cellule in cui è entrato Durante il recovery le cellule trasformate possono esprimere il gene per la resistenza all antibiotico

40 Efficienza di trasformazione Calcolare i mg totali di DNA usati per la trasformazione Calcolare il fattore di diluizione usato per piastrare i trasformanti Contare le colonie Moltiplicare n.colonie (CFU) x fattore diluizione Dividere per i mg di DNA utilizzato Efficienza di trasformazione CFU/mg Controlli di trasformazione: Ligazione del solo vettore Vettore chiuso a concentrazione nota Vettore digerito

41 Selezione di vettori ricombinanti A seguito di ligazione di un inserto con un vettore e introduzione di questo costrutto in un ospite, si possono ottenere diversi tipi di trasformanti: batteri vuoti batteri contenenti il solo vettore batteri contenenti il vettore ligato all'inserto Come selezionare i cloni ricombinanti da quelli contenenti solo il vettore??? Si può ricorrere a metodi generali e laboriosi come l'ibridazione su colonia (colony hybridization) o un'analisi per digestione con enzimi di restrizione (se i cloni trasformanti sono pochi), o la PCR su colonia Molti vettori di clonaggio sono costruiti per facilitare lo screening dei cloni ricombinanti.

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44 Specificità d ospite Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata (narrow host range). Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite (broad host range). I plasmidi a largo spettro d'ospite devono questa loro proprietà al possesso di alcuni geni necessari per il riconoscimento dell'origine di replicazione. Dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico. Gruppi di incompatibilità Plasmidi con la stessa origine di replicazione (Inc) sono incompatibili tra loro. I plasmidi dipendono per la loro replicazione da componenti genetiche dell'ospite batterico in grado di riconoscere l'origine di replicazione e iniziare la replicazione. Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi verrà perso. Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità

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