oppure una sequenza genica, e che sarà poi inserito in un organismo per uno dei seguenti scopi:

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1 Il Fago Lambda

2 Perché è importante conoscere la biologia del Fago lambda? Il fago lambda è il vettore fagico più utilizzato nelle tecnologie del DNA ricombinate, caratterizzato da un genoma lineare a doppia elica di bp. Un VETTORE è un elemento di DNA in cui verrà inserito un gene oppure una sequenza genica, e che sarà poi inserito in un organismo per uno dei seguenti scopi: Clonaggio e amplificazione di una sequenza di DNA Studio dei meccanismi d espressione di una sequenza di DNA Introduzione di geni all interno di cellule o animali da sperimentazione Produzione, in scala industriale, di specifiche proteine

3 PROPRIETA DI UN VETTORE Deve replicarsi attivamente all interno della cellula ospite Le sue dimensioni devono essere il minore possibile Deve possedere proprietà per individuare le cellule che lo hanno incorporato Deve essere mantenuto senza subire modificazioni Deve possedere il maggior numero di siti unici di taglio Deve essere facilmente isolabile in forma pura

4 I batteriofagi sono i virus infettanti i batteri e come tali sono ottimi vettori genici. Sono dotati di un sistema di penetrazione a all interno di un ospite batterico si replicano in maniera autonoma. Questo tipo di infezione ha una resa molto maggiore della Trasformazione e le dimensioni del DNA inserito possono essere più grandi. Come ottenere una grande quantità di fagi? Step 1: Infezione dei batteri. Step 2: Lisi batterica ed eliminazione dei detriti batterici mediane centrifugazione. Step 3: Liberazione di fagi che vengono precipitati mediante polietilenglicole e poi purificati su cuscinetti di Cesio Cloruro. Step 4: Purificazione del DNA fagico racchiuso nel capside mediante trattamento con Proteinasi K e detergenti (SDS).

5 Isolamento dei cloni fagici L isolamento dei cloni fagici può avvenire dunque esclusivamente mediante infezione batterica La replicazione e la crescita del fago lambda avviene su capsule di Petri. Il fago viene mescolato con cellule di E. coli in una soluzione di top agar. La soluzione viene versata sulla superficie di una piastra contenente un terreno di coltura agarizzato ed incubata h a 37 C. La crescita di lambda produce la lisi delle cellule batteriche e viene visualizzata come placche di lisi.

6 La metodologia più efficace per il conteggio delle particelle virali è la Microscopia Elettronica

7 Placche di lisi

8 Efficienza di piastramento Il rapporto quantitativo tra il numero delle unità infettanti e il numero delle particelle virali è definito EFFICIENZA DI INFEZIONE EI= Unità infettanti/n particelle virali L efficienza con cui i virus infettano le cellule ospiti raramente è del 100%, e spesso può essere considerevolmente inferiore; Una efficienza inferiore può essere dovuta a particelle virali difettive, o più spesso perché nelle condizioni sperimentali usate l infezione non è avvenuta con successo; I virus batterici spesso hanno un efficienza di piastramento > 50%; Anche se sono necessarie molte particelle virali per avviare l infezione una sola particella virale infetterà la singola cellula.

9 La Biologia del Fago Lambda: Ciclo vitale Enterobacteria fago λ (detto più comunemente fago lambda) è un batteriofago temperato che infetta Escherichia coli. Una volta che il fago fa il suo ingresso nell'ospite, il suo genoma può integrarsi all'interno del genoma dell'ospite. In questo caso, λ è chiamato PROFAGO, e risiede all'interno dell'ospite apparentemente senza arrecare danno. In questa fase il profago duplica con la duplicazione del DNA dell'ospite, che avviene prima di ogni divisione cellulare. Questa fase è quella definita LISOGENIA. Se la cellula si trova in una situazione di stress, ad esempio presenza di antibiotici ed altri fattori che danneggiano la cellula, il profago si riattiva, il suo DNA viene escisso dal genoma ospite e si avvia il CICLO LITICO. Il fago riattivato inizia a produrre grandi quantità di RNA virali a partire dal proprio DNA, al fine di costituire un elevato numero di unità fagiche. Quando tutte le risorse della cellula sono esaurite a causa dell'assemblaggio di nuovi fagi, la sua membrana viene distrutta ed i fagi prodotti sono riversati all'esterno.

10 La coda è priva di guaina e termina con rudimenti di fibrie caudali E un virus a simmetria Binaria con testa icosaedrica e coda elicoidale.

11 Il Genoma del fago lambda Il genoma del fago lambda è costituito da DNA duplex lineare di circa 50Kb viene impacchettato nel nucleo proteico del fago rappresentato dalla testa attraverso un meccanismo dipendente dall idrolisi di ATP. Tale genoma presenta estremità coesive costituite da due sequenze complementari denominate COS di 12 bp (cosl e cosr). Appena il virione inietta in genoma nella cellula ospite le estremità cos si appaiano ed il genoma fagico viene chiuso covalentemente sfruttando gli enzimi batterici

12 Mappa semplificata del Genoma del fago lambda I geni strutturali che codificano per proteine necessarie all assemblaggio della testa e della coda mappano all estremità sinistra (~0-20 Kb) Le proteine coinvolte nel ciclo litico mappano all estremità destra del genoma (~35-49 Kb) Alcune porzioni del genoma non sono indispensabili alla sopravvivenza del fago e possono essere sostituite da DNA esogeno (linee diagonali) o eliminate (punti) senza modificare la capacità del fago di infettare la cellula ospite e di assemblare nuovi virioni Tali regioni contengono i geni responsabili della crescita lisogena ed altri geni virali non essenziali per la crescita litica

13 Ciò consente l inserimento di DNA esogeno di lunghezza fino a ~ 25 Kb tra i geni J e N, dando luogo ad un DNA ricombinante che può essere inserito in vitro all interno di virioni capaci di replicarsi e di infettare E. coli. Le nuove particelle fagiche ricombinanti perdono le capacità lisogene mantenendo quelle infettive e litiche.

14 Dal genoma del fago Lambda possono essere espressi sette trascritti per un totale di circa 60 geni. I trascritti sono catalogati in base al nome del Promotore e alcune aree di trascrizione dipendono dai fattori di trascrizione N e Q. Una caratteristica del genoma di Lambda e che alcuni trascritti sono sovrapposti, e sono trascritti a patire da 7 Promotori: P RM : ci P R : Cro e regione N-dipendente (cii - O - replication - P - Q). P RE : Cro - ci P antiq : Q P R' : regione Q-dipendente (lysis - head - tail). P I : int P L : N e regione N-dipendente (ciii - xis - int - sib)

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16 Funzioni delle proteine di λ Cro. E un INIBITORE DI TRASCRIZIONE. Lega, in ordine di affinità, gli operatori OR3 > OR2 > OR1. A basse concentrazioni blocca il promotore P RM inibendo la produzione di ci. Ad alte concentrazioni cala la sua stessa trascrizione legando OR1 e OR2. ci. E un INIBITORE DI TRASCRIZIONE. Lega, in ordine di affinità, OR1 > OR2 > OR3. A basse concentrazioni blocca il promotore P R inibendo la produzione di Cro. Ad alte concentrazioni cala la sua stessa trascrizione. cii. E un ATTIVATORE DI TRASCRIZIONE, trascritta dal promotore R lega ciii. Attiva la trascrizione sul promotore antiq, RE e I. La sua stabilità può calare a causa della sua suscettibilità alle proteasi cellulari. Aumenta la sua stabilità se legato a ciii. ciii. E una cii binding protein, protegge cii dalla degradazione delle proteasi cellulari.

17 Funzioni delle proteine di λ N. E una RNA binding protein ed un cofattore per la RNApol. Lega l'rna che contiene una sequenza Nut e da lì viene caricato sulla stessa polimerasi. Altera il riconoscimento dei codoni di stop, attivando di fatto alcuni codoni di stop successivi (Antiterminatore). Q. E una DNA binding protein, ed è un cofattore per la RNApol. Lega il DNA presso i siti Qut e ne favorisce l'associazione con la RNApol. Altera il riconoscimento dei codoni di stop, attivando di fatto alcuni codoni di stop successivi (Antiterminatore). Xis. Regola l'escissione e l'integrazione del genoma fagico. Int. E un INTEGRASI. Coordina l'integrazione del genoma fagico. A basse concentrazioni, non produce alcun effetto. Se la concentrazione di Xis è bassa e di Int alta, il fago procede all'inserzione del proprio genoma. Se le concentrazioni di Xis e di Int sono comparabili, avviene invece l'escissione.

18 Funzioni delle proteine di λ A, B, C, D, E, F, Z, U, V, G, T, H, M, L, K, I, J. Si tratta dei geni strutturali che compongono la testa (A-F) e la coda (Z-J). L'ordine riportato è quello di posizionamento sul genoma in senso orario. Queste proteine sono in grado di auto-assemblarsi per generare i nuovi fagi. S, R. sono Proteine promotrici della lisi cellulare OP. La regione O - replication - P contiene il promotore della replicazione specifica del genoma fagico. Sib. Non si tratta di una proteina, ma di una sequenza necessaria perché un fago sia funzionale attp. Non è una sequenza codificante per una proteina. Si tratta della regione su cui agiscono Int e Xis nell'inserzione ed escissione del genoma fagico. Nel genoma ospite è presente una regione corrispondente attb.

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20 Assemblaggio dei virioni Durante l assemblaggio in vivo dei virioni all interno della cellula ospite le teste e le code vengono inizialmente auto-assemblate separatamente. Contemporaneamente la replicazione del DNA fagico avviene mediante il meccanismo del cerchio rotante. Si originano cosi lunghe catene di DNA multimeriche chiamate Concatameri. Costituite da copie multiple del genoma virale legate per le estremità e separate da sequenze nucleotidiche specifiche dette siti COS. Le proteine Nu1 e A legano i siti COS e dirigono l inserimento del DNA situato tra 2 siti COS in una testa pre-assemblata. Tale processo, detto Packaging consente l inserimento di una sola copia di 50 Kb in una testa preformata. Infine il virione assume la coda preformata.

21 Assemblaggio dei virioni

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23 L'integrazione genomica L'integrazione del genoma fagico all'interno di quello batterico avviene presso una speciale regione, chiamata att λ. La sequenza precisa sul genoma di E. coli è chiamata attb (Bacterial attachment, sito di attacco batterico) ed è composta essenzialmente di tre segmenti, detti B-O-B'. La sequenza complementare sul genoma del fago è attp (Phagic attachment, sito di attacco fagico) ed è composta delle regioni P-O-P'.

24 L'integrazione genomica L'integrazione avviene attraverso una Ricombinazione Conservativa sito specifica. Tale evento richiede la presenza delle proteine Int (fagica) e IHF (integration host factor, batterica). Sia Int che IHF legano il sito attp, formando un complesso DNA-proteina detto INTASOMA che sostiene la ricombinazione. Il risultato di tale evento vede l'originale regione BOB' modificata in una nuova con B-O-P'-genoma fagico-p-o-b'. Il DNA fagico è ora completamente integrato.

25 Il Ciclo Vitale Il fago lambda lega la membrana della cellula di E. coli, presso i recettori del Maltosio. Il genoma lineare del fago è iniettato nella cellula e diventa immediatamente circolare per appaiamento delle sequenze cos. Si avvia la trascrizione, a partire dai promotori L, R e R', per produrre i trascritti precoci immediati (immediate early).

26 Il Ciclo Vitale Vengono prodotte le proteine N, Cro ed una proteina più breve, inattiva. Il promotore di N e Cro è l unico subito riconosciuto dalla RNA polimerasi batterica. Cro lega la sequenza OR3, inibendo la trascrizione del gene ci. N lega i due siti Nut (localizzati nel gene N e nel gene Cro). La proteina N legata a P L e P R avvia la trascrizione delle successive ORF (Open Reading Frame). Le proteine tradotte in questa fase, detta tardivo-precoce (late early) sono ulteriori proteine N e Cro, oltre a cii e ciii.

27 Il Ciclo Vitale ciii lega cii, proteggendola dall'attacco delle proteasi. La stabilità di cii determina quale ciclo vitale verrà intrapreso dal fago: Ciclo Litico Ciclo Lisogeno. Cellule non sofferenti, con attività abbondante di proteasi, renderanno cii instabile, avviando il ciclo litico. Cellule sofferenti e carenti di nutrienti disponibili hanno un'attività proteasica minore, rendendo cii stabile, preludio al ciclo lisogeno.

28 Il Ciclo litico Il ciclo litico del fago Lambda dura circa 20 minuti, durante i quali vengono espressi in maniera temporalmente coordinata i geni precoci, i geni precoci tardivi ed i geni tardivi. La regolazione del ciclo litico è sostanzialmente caratterizzata dal fenomeno dell antiterminazione I trascritti precoci tardivi continuano ad essere prodotti: tra di essi figurano xis, int, Q e geni per la replicazione del genoma di lambda. Il genoma di lambda viene replicato in preparazione alla successiva produzione di nuovi fagi. La DNA binding protein Q lega i siti Qut e favorisce l associazione della RNApol Dal promotore R' si avvia la produzione di mrna per la lisi e per la sintesi di proteine strutturali. Nuove unità fagiche vengono assemblate a partire dalle proteine strutturali. Le proteine di lisi raggiungono una concentrazione tale da causare la rottura della membrana, che consente la fuoriuscita dei nuovi fagi.

29 Il Ciclo lisogeno Il preludio alla Lisogenia si ha se la proteina cii è stabile, questa attiva la trascrizione dai promotori P RE, P antiq, P I Il promotore P antiq produce mrna antisenso, spegnendo la produzione di Q. Il promotore P RE produce mrna antisenso che spegne la produzione di Cro, assieme all'mrna senso per ci, che ne accende la produzione di ci. Il promotore P I produce mrna del gene int, che aumentano la concentrazione della Integrasi Int. L'assenza di Q inibisce il promotore P R', inibendo di fatto la produzione delle proteine litiche e strutturali tipiche del ciclo litico.

30 Il Ciclo lisogeno Livelli elevati di Integrasi (superiori a Xis) generano l'inserzione del genoma di lambda in quello dell'ospite. La produzione di ci ne genera il legame con il sito OR1 presso il promotore P R, spegnendo la produzione di Cro. Il calo di Cro libera il sito OR1, in modo che aumenti la trascrizione dal promotore P RM, che mantengono alto il livello di ci. Il calo della trascrizione avviene anche su P L e da P R impedendo la produzione di cii e ciii. Il calo delle concentrazioni di cii e ciii genera un calo della trascrizione da P antiq, P RE e P I. Solo i promotori P RM e P R' rimangono attivi, producendo un breve trascritto inattivo e ci. Il genoma, inserito nell'ospite, entra in uno stato dormiente.