immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo

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1 Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo

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3 A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA?? CREARE COPIE IDENTICHE (= CLONI) DI UN FRAMMENTO DI DNA DIFFERENZE con la PCR: è una reazione in vivo sfrutta l apparato di replicazione del DNA della cellula ospite (batteri) è un processo più accurato

4 COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA? PREMESSE: 1) I BATTERI CELLULE PROCARIOTICHE: assenza nucleo singola molecola circolare di DNA possono acquisire facilmente piccole molecole di DNA esogeno 2) I VETTORI piccole molecole circolari di DNA che portano pochi geni possono facilmente essere acquisiti dalle cellule batteriche

5 COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA? PREMESSE: 3) GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE ENDONUCLEASI che tagliano il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze di basi Estremità piatte Estremità coesive

6 COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA? ENZIMA di RESTRIZIONE 1. IL DNA DA CLONARE VIENE TAGLIATO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE PLASMIDE LIGASI 2. INSERITO IN UN VETTORE TAGLIATO CON GLI STESSI ENZIMI PLASMIDE RICOMBINANTE 3. LIGASI CELLULA BATTERICA 4. IL VETTORE RICOMBINATE VIENE INSERITO IN UNA CELLULA BATTERICA E AL SUO INTERNO SI DUPLICA (TRASFORMAZIONE)

7 Le FASI del CLONAGGIO 1. Preparazione del terreno di coltura e delle piastre di crescita 2. Preparazione del DNA da clonare purificazione creazione delle estremità coesiva 3. Inserzione del DNA da clonare in un vettore 4. Inserzione del vettore nell ospite TRASFORMAZIONE 5. Piastramento delle cellule 6. Crescita 7. Recupero dei CLONI

8 PIASTRA DI CRESCITA

9 TRASFORMAZIONE DI CELLULE BATTERICHE 1. DNA NUDO E VETTORI DI CLONAGGIO 2. CELLULE COMPETENTI 3. VALUTAZIONE DEL PROCESSO DI TRASFORMAZIONE (resistenza antibiotico)

10 TRASFORMAZIONE E CELLULE COMPETENTI La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare messa a punto per facilitare l'introduzione di plasmidi nei batteri, processo che in natura avviene in misura minima. Questo si ottiene modificando alcune proprietà chimicofisiche delle pareti e delle membrane cellulari con l'impiego di sostanze chimiche (CaCl2), utilizzando rapidi sbalzi di temperatura o di scariche elettriche ad alto voltaggio (elettroporazione); ne deriva una permeabilizzazione, transitoria, delle cellule al DNA esogeno.

11 TRASFORMAZIONE CHIMICA (CaCl2) Tutti i metodi chimici si basano sull osservazione che batteri trattati con soluzioni di ioni bivalenti lasciano entrare DNA nudo in modo più efficiente. Si ipotizza che l aggiunta di ioni bivalenti (Ca++), maschera le cariche negative del DNA favorendone l ingresso nella cellula (E. coli).

12 ELETTROPORAZIONE La presenza di un campo elettrico destabilizza le membrane di E. coli ed induce la formazione di pori transienti del diametro di alcuni nanometri. Le molecole di DNA passano attraverso questi pori applicando impulsi di voltaggio elevato.

13 GHIACCIO C Formazione di elettropori GENE GUN

14 PROBLEMATICHE RELATIVE AI VETTORI PUO SUCCEDERE CHE 1) La cellula non acquisisce il VETTORE e quindi neanche il DNA da clonare: TRASFORMAZIONE FALLITA 2) Il vettore si richiude su se stesso senza acquisire il DNA da clonare: la cellula ingloba il vettore richiuso PRIVO del DNA da clonare

15 VETTORI DI CLONAGGIO La grande maggioranza degli esperimenti di clonaggio utilizza il batterio E. coli per la propagazione dei frammenti di DNA clonati (OSPITE).

16 VANTAGGI di E. coli: 1. Facile da coltivare in laboratorio 2. La sua genetica è ben conosciuta 3. Il suo genoma è interamente mappato e sequenziato

17 VETTORI DI CLONAGGIO Sequenza di DNA capace di replicarsi in maniera autonoma che può essere utilizzata per trasferire frammenti di DNA esogeno. Quelli più utilizzati sono basati su DNA di plasmidi o sul DNA del batteriofago lambda. Vettori di clonaggio: utilizzato per amplificare, in un sistema in vivo, un frammento di DNA. Vettori di espressione: utilizzato per esprimere un gene contenuto nel frammento di DNA clonato.

18 VETTORI DI CLONAGGIO Caratteristiche: Replicazione autonoma Caratteristica selezionabile che permette di distinguere cellule trasformate da quelle non trasformate Presenza di almeno un sito di restrizione

19 PLASMIDI Sono elementi extra-cromosomiali naturali che vengono ereditati in maniera stabile da una generazione all altra conservando le loro caratteristiche individuali. Plasmidi rilassati (10-200) utilizzano, per la replicazione, proteine dell ospite Plasmidi stringenti (1-2) sintetizzano fattori proteici necessari per la replicazione

20 PLASMIDI MODIFICATI: pbr322 Rappresenta il primo vettore (4.363 bp) costruito utilizzando componenti di plasmidi naturali: Origine di replicazione Resistenza ad antibiotici Siti di clonaggio

21 pbr322

22 pbr322 INATTIVAZIONE INSERZIONALE

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24 Resistenza agli antibiotici: Solo i batteri che hanno integrato un plasmide contenente il gene che codifica per la resistenza alla Kanamicina possono crescere su terreno nutritivo in presenza di antibiotico

25 PLASMIDI puc MCS Alto numero di copie: mutazione in ori produce copie MCS: multiple cloning site (polylinker)

26 OPERONE lac di E. coli: l esempio classico

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28 PLASMIDI puc MCS Alto numero di copie: mutazione in ori produce copie MCS: multiple cloning site (polylinker)

29 PLASMIDI puc Screening blu-bianco

30 PLASMIDI puc Screening blu-bianco a-complementazione

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32 PLASMIDI puc

33 PLASMIDI puc

34 ALTRI TIPI DI VETTORI VETTORI (15-20 Kb) = vettori ottenuti apportando delle modifiche al genoma del batteriofago. COSMIDI (40-45 Kb) = plasmidi che contengono i siti cos di utili per l impacchettamento di DNA in un fago FAGMIDI=plasmidi che contengono l origine di replicazione del fago f1.

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37 ALTRI TIPI DI VETTORI VETTORI (15-20 Kb) = vettori ottenuti apportando delle modifiche al genoma del batteriofago. COSMIDI (40-45 Kb) = plasmidi che contengono i siti cos di utili per l impacchettamento di DNA in un fago FAGMIDI=plasmidi che contengono l origine di replicazione del fago f1.

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39 PROBLEMATICHE Durante il clonaggio di frammenti di DNA può accadere che i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione necessari non siano presenti, o siano localizzati in una posizione non corretta. Come superare questo inconveniente? 1. UTILIZZARE LINKER OLIGONUCLEOTIDICI 2. MUTAGENESI PER CREARE NUOVI SITI DI RESTRIZIONE

40 LINKERs OLIGONUCLEOTIDICI

41 LINKERs OLIGONUCLEOTIDICI

42 MUTAGENESI PER CREARE NUOVI SITI DI RESTRIZIONE Quando il frammento da clonare rappresenta un prodotto di PCR è possibile inserire agli estremi del frammento nuovi siti di restrizione durante la reazione di amplificazione: TAGLIO TAGLIO

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44 Perché clonare i geni? 1 Clonando un tratto di DNA è possibile identificare gli elementi regolatori di un gene (promotore, siti di potenziamento o silenziamento della trascrizione). 2 Dal gene clonato si possono preparare sonde da utilizzare in esperimenti di Southern o Northern per localizzare il corrispondente acido nucleico 3 Mediante mutagenesi sito-specifica si può modificare un gene clonato in modo mirato, alterando a piacere il corrispondente prodotto proteico 4 Infine si può pensare di rimpiazzare il gene mutato di un individuo malato con la forma normale del gene clonato ( terapia genica ). 5 Si può forzare l espressione di un gene clonato, nella sua forma normale o modificata: se il gene viene clonato in vettori di espressione (procariotici), sarà possibile far esprimere e quindi produrre in gran quantità la proteina di interesse dalla cellula batterica. Se invece si utilizzano vettori di espressione in eucarioti, si può introdurre il gene clonato in una pianta o in un animale, ottenendo così individui transgenici.

45 IL DNA RICOMBINANTE NON SERVE SOLO PER STUDIARE I GENI: PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL INGEGNERIA GENETICA A cosa possono servire le proteine ricombinanti? -PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO. -PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (ENZIMI). -PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI ANTICORPI.

46 IL DNA RICOMBINANTE NON SERVE SOLO PER STUDIARE I GENI: PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL INGEGNERIA GENETICA La produzione di proteine ricombinanti mediante processi biotecnologici garantisce l'ottenimento di farmaci ad elevato grado di purezza e sicuri in quanto privi dei contaminanti quali virus o altri agenti infettivi. Inoltre, permette di disporre si grosse quantità di farmaco necessarie, eliminando la precarietà dell'approvvigionamento dagli organi animali, utilizzati in passato per la produzione di particolare farmaci come ad esempio l'insulina ottenuta dal pancreas di maiale.

47 Molte proteine ricombinanti di interesse terapeutico sono espresse in microorganismi Insulina umana Diabete Ormone della crescita umano Nanismo ipofisario Vaccino per l epatite B Prevenzione dell epatite B Attivatore del plasminogeno tissutale Infarto miocardico acuto Eritropoietina Anemia associata ad insufficenza renale cronica Inteferone Granulomatosi cronica Fattore stimolante la crescita delle colonie di macrofagi e granulociti Trapianto di midollo osseo Fattore stimolante la crescita di colonie di granulociti Neutropenia causata da chemioterapeia Interleuchina-2 umana Carcinoma del rene Fattore VIII Emofilia A DNasi umana Fibrosa cistica Glucocerebrosidasi Morbo di Gaucher Interferone Sclerosi multipla Fattore IX Emofilia B Interferone Infezione cronica da HCV PGF Trombocitopenia indotta da chemioterapia PDGF- Ulcerazione arti inferiori da diabete Recettore FNT Artrite reumatoide Glucagone Ipoglicemia

48 VETTORI DI ESPRESSIONE

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55 immunitaria

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57 PRODUZIONE ORMONE DELLA CRESCITA UMANO IN E. Coli -Peptide di 191 aa -Carenza provoca nanismo ipofisario -GH da animali non è efficace sull uomo -80 ipofisi di cadaveri umani per un paziente per un anno (alto rischio infezioni)

58 Sistemi di espressione Procarioti: (E.Coli) Eucarioti: Saccharomyces Cerevisiae (lievito) Cellule di mammifero in coltura Animali transgenici Piante transgeniche

59 Usi del DNA ricombinante: PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI IN CELLULE EUCARIOTICHE Vantaggi rispetto a sistemi procariotici -FOMAZIONE CORRETTA DI PONTI DISOLFURO -FOLDING CORRETTO -TAGLIO PROTEOLITICO DA PRECURSORE -GLICOSILAZIONE -MODIFICAZIONE DI aa (FOSFORILAZIONE, ACETILAZIONE, ecc.)