C.d.L. Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei Microrganismi

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1 C.d.L. Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei Microrganismi AA BIOTECNOLOGIE DEI MICRORGANISMI Università degli Studi di Bari - Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche

2 APPLICAZIONI DELLE BIOTECNOLOGIE Farmacologia e Medicina Identificazione e isolamento del gene: Estrazione del DNA e sua frammentazione e separazione del gene di interesse. Amplificazione enzimatica. Nel caso di geni di tipo eucariotico, considerata la loro discontinuità sintesi a partire dal RNAm. Analisi in alternativa della sequenza proteica con produzione di una sequenza di aminoacidi a cui corrisponderebbe una sequenza di basi Rnam. 2

3 Libreria genomica: collezione di frammenti di DNA genomico inserito poi in un fago (vettore). cdnateca: frammenti di DNA estratti da un tessuto o da un gruppo di cellule. 3

4 APPLICAZIONI DELLE BIOTECNOLOGIE Farmacologia e Medicina Il processo di ricerca e scoperta di nuovi farmaci sta cambiando, l approccio è oggi più biologico di tipo cellulare e molecolare, rispetto a quello estrattivo e chimico. La ricerca di biotecnologie essenzialmente si basa sulla messa a punto di nuove tecnologie per la diagnosi, prevenzione, e terapia delle malattie. I limiti nella produzione dei farmaci umani erano soprattutto (farmaci di natura proteica) stavano nei costi di produzione e nelle quantità limitate prodotte (prima dell introduzione del DNA ricombinante). I prodotti ottenuti per estrazione dal sangue potevano presentare problemi notevoli di sicurezza. Si pensi all AIDS, in seguito alle trasfusioni e all inoculazione di prodotti biologici derivati dal sangue ha causato la tragica diffusione dei virus dell epatite B e C. La diffusione della BSE ha provocato il ritiro di alcuni emoderivati. 4

5 Farmacologia e Medicina Le scienze biotecnologiche oggi trovano vasta applicazione nella diagnosi, terapia e prevenzione delle malattie dell uomo. La maggior parte delle ricerche sono rivolte alla produzione di proteine o peptidi per scopi terapeutici, ormoni o prodotti del sangue antinfettivi o immunomodulatori. Altre ricerche sono rivolte allo sviluppo di reagenti e tecniche diagnostiche (anticorpi monoclonali, PCR sonde etc.). Altre ricerche sono rivolte allo studio degli animali transgenici in grado di produrre farmaci nel loro latte, o modificati geneticamente inmodo che possano rappresentare donatori di organi o tessuti. 5

6 Il gene che codifica per farmaci salvavita viene inserito mediante le tecniche del DNA r in un batterio o in un altro tipo di cellula che è così commissionata a produrre la molecola farmacologica in grande quantità e purezza. Negli anni 90 sono entrati in uso molti farmaci ricombinanti : attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), eritropoietina (EPO), colony stimulating factors (CSF), interleuchina 2 (IL-2), interferone (IFN), vaccino per l epatite B. 6

7 Farmacologia e Medicina La tecnologia del DNA ricombinante permette la produzione di un ampia serie di farmaci in quantità notevoli molto efficaci e sicuri nell uso. Oggi vengono prodotte 300 proteine differenti con potenziale o già validata attività terapeutica per l uomo derivanti da microorganismi ricombinanti nei quali è stato clonato lo specifico gene codificante (anche cellule animali). 7

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9 Insulina umana È il primo prodotto ricombinante, è prodotta da batteri ricombinanti geneticamente modificati. (1982), è stato il rimo farmaco biotecnologico. L insulina è prodotta dalle cellule beta del pancreas, il suo ruolo è quello di regolare l assorbimento del glucosio dal sangue ai tessuti. La malattia che la carenza o la sua assenza genera è il diabete mellito, la cui cura prevedeva inizialmente inoculazioni giornaliere di insulina di origine animale (bovina) con costi (estrazione e purificazione) e rischi di reazioni collaterali molto gravi, inoltre con efficacia in molti casi dubbia. L ingegneria genetica ha risolto questi problemi presentano un ormone perfettamente identico a quello naturale umano attraverso il clonaggio del gene all interno di un batterio. 9

10 Processo produttivo insulina L insulina nella sua forma attiva è costituita da due catene polipeptidiche (A, B) formate da 21 e 30 amminoacidi tenute insieme da ponti disolfuro. Tratti separati del singolo gene codificante codificano per l insulina. Il gene dell insulina codifica per un unica e lunga catena polipeptidica chiamata proinsulina. La proinsulina viene poi convertita in insulina attraverso il clivaggio del polipeptide centrale le due unità sono tenute insieme da ponti disolfuro. 10

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12 Processo produttivo insulina Per risolvere il problema sono stati due approcci, il primo prevede l inserimento nel batterio del gene tal quale e successivo clivaggio chimico del prodotto ottenuto con asportazione del polipeptide centrale. Produzione da parte di due colture batteriche di delle singole catene A e B e quindi legame chimico tra di loro per ottenere la molecola attiva. Per ottenere il gene umano sono state usate tecniche differenti (è molto difficile isolare un singolo gene dal genoma umano), un primo metodo è isolare dal pancreas l RNA m che codifica per l ormone insulina e retro trascriverlo in una copia di DNA (sono presenti elevate quantità di RNA m nelle cellule beta) Il gene può essere anche sintetizzato a partire dalla sequenza di amminoacidi presenti nella molecola della proinsulina e insulina, nella corretta sequenza nucleotidica. 12

13 Processo produttivo insulina Dopo avere ottenuto il gene dell insulina derivato da RNA o dopo sintesi chimica questo viene inserito nel genoma di Escherichia coli che sarà commissionato alla produzione di insulina umana. 13

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15 Categorie di farmaci prodotti con tecnica del DNA ricombinante Sono numerosi i farmaci prodotti mediante ingegneria genetica in cellule procariote o eucariote: Ormoni peptidici: si identificano con peptidi o piccole proteine, svolgono funzioni essenziali nel metabolismo e trovano quindi grande impiego (farmaci, salvavita), ormone della crescita e eritropoietina. Proteine del sangue: numerose proteine del sangue per uso terapeutico che vengono prodotte per ingegneria genetica, importanti proteine coinvolte nei processi di coagulazione del sangue (fattore VII, VIII, IX) sia nei processi che degradano i coaguli (plasminogeno), in questo modo è possibile curare con basso costo numerose malattie genetiche, questi fattori erano ottenuti da sangue di donatori e hanno provocato in passato numerose infezioni virali (AIDS. Epatiti). 15

16 Categorie di farmaci prodotti con tecnica del DNA ricombinante Immuno modulatori e antitumorali : tra le principali sostanze sono da ricordare la serie degli interferoni con attività antivirale o immuno modulatrice o ancora antitumorale, altre molecole nella terapia antitumorale sono l interleuchina il tumor necrosis factor e granulocyte macrophage colony stimulating factor. Queste molecole agiscono o direttamente sulla massa tumorale oppure possono stimolare le cellule delle difese immunitarie, in modo da consentire un uso di farmaci citotossici a più levate concentrazioni. Peptidi atriali e neuropeptidi : gli atrii cardiaci sintetizzano e liberano una serie di peptidi (attività endocrina) che influiscono su escrezione del sodio, volume dell urina, tono della muscolatura liscia, e vasodilatazione renale selettiva. Quindi la loro produzione è importantissima nella prevenzione dell ipertensione Neuropeptidi: che comprendono endorfine e encefaline gastrine ed altri consentono la cura di malattie mentali (Alzheimer, schizofrenia o depressione 16

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18 Categorie di farmaci prodotti con tecnica del DNA ricombinante Antibiotici: negli anni 40 ha inizio la produzione industriale di antibiotici con lo sviluppo di ceppi fungini mutati e le colture sommerse capaci di produrre elevate quantità di penicillina. Le biotecnologie innovative compaiono negli anni 70 quando i classici ceppi di produzione funghi (Penicillium, Aspergillus etc.) e batteri (Acinetobacter, Pseudomonas) vengono modificati geneticamente per ottenere prodotti più attivi. La resa di produzione è stata aumentata nel corso degli anni volte, costruendo geneticamente mediante trasferimento del plasmide con la resistenza all antibiotico ceppi microbici in grado di produrre elevate quantità senza risentirne, nel corpo batterico i plasmidi inseriti potevano essere diverse centinaia. La capacità di produzione dell antibiotico era già presente nel genoma batterico. Attualmente l obiettivo è la clonazione di geni che codificano per l antibiotico e trasferimento in opportune cellule ospiti mediante tecniche di ricombinazione genetica, il primo antibiotico clonato è stato l eritromicina (diverse decine di geni clonati insieme) 18

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20 Piante transgeniche La tecnica del DNA r consente di far esprimere nelle piante rese transgeniche sia proteine animali che prodotti medicinali. Le piante producono proteine che sono quasi sempre indistinguibili da quelle prodotte da un mammifero I risultati più interessanti sono stati ottenuti in Nicotiana tabacum rese transgeniche mediante Agrobacterium tumefaciens (vettore) in grado di trasferire alle cellule vegetali i geni che codificano per l emoglobina umana. Si tratta di un batterio patogeno che invade l ospite modificando il suo genoma e introducendo i propri geni (galla), il batterio viene modificato in modo da non indurre danni alla pianta e al suo interno (genoma) sono presenti geni di utilità come quelli dell emoglobina e dell eritropoietina Le piante erano quindi in grado di produrre emoglobina funzionante e eritropoietina che regola la produzione di di globuli rossi nel midollo osseo. Il principale inconveniente è relativo alla comparsa di reazioni immuni nei confronti di queste proteine (glicosilazione e presenza di glucani) 20

21 vaccini I vaccini ricombinanti sono stati prodotti clonando in una cellula procariota o eucariota il gene del microrganismo che codifica per la principale proteina immunogena cioè quella che induce nell ospite la produzione di anticorpi. questi vaccini sono costituiti da subunità di una proteina del microorganismo patogeno (vaccini a sub unità); nei vaccini virali è una proteina del capside o dell envelope, nei vaccini batterici adesine o tossine modificate (anatossine). Dopo selezione del gene questo viene inserito in un apposito vettore (clonaggio) per il suo trasferimento nel microorganismo che produrrà in grande quantità la proteina immunogena poi purificata e usata come vaccino. 21

22 vaccini La produzione di questi tipi di prodotto nei procarioti (E. coli) non sempre origina un prodotto efficace in quanto questi organismi non sono in grado di apportare una serie di modificazioni post traduzionali tipiche delle cellule eucariote Per questo motivo vengono impiegate cellule eucariote come i lieviti che sono in grado di apportare le modifiche volute quali ospiti di espressione in modo da vere il corretto pattern di glicosilazione e altre modificazioni delle proteine da impiegare come vaccino. 22

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24 Vaccini contro l epatite B Il virus che causa l epatite B oltre che essere causa di cirrosi epatica è in grado di causare cancro al fegato è in effetti un agente cancerogeno Attualmente il numero dei portatori cronici è di circa 300 milioni, molti portatori cronici possono apparire in buona salute ma possono ugualmente trasmettere il virus a coloro con i quali vengono in contatto, mantenendo così molto elevato il numero degli infetti che possono facilmente sviluppare un cancro al fegato. Il virus HBV contiene due antigeni associati al guscio proteico e un antigene di superficie (Hbc, Hbe e HBsAg). L antigene di superficie è detto anche antigene australia induce nel corso dell infezione la formazione di anticorpi protettivi, non solo costituisce il guscio del virus matura ma è anche libero nel sangue sottoforma di strutture sferiche e filamentose. L antigene di superficie costituisce quindi la molecola di scelta per allestire un vaccino e infatti prima dell avvento dell ingegneria genetica le particelle di HBsAg ottenute per ultracentrifugazione dal sangue di un portatore sano. Mediante ingegneria genetica il gene virale è stato clonato in un vettore Saccharomyces cerevisiae. L antigene prodotto presentaantonio un grado di ROSATO purezzamed elevatissimo, e Farm non solo ma viene trattato con 24 una serie di tecniche di separazione che ne 02 garantiscono l assoluta affidabilità

25 Vaccini contro l epatite B L antigene prodotto presenta un grado di purezza elevatissimo, non solo ma viene trattato con una serie di tecniche di separazione che ne garantiscono l assoluta affidabilità (cromatografia, ultrac. e frazionamento, purezza > 98%) Presenta tutte le caratteristiche della proteina glicosilazione e modificazioni post traduzionali, dopo la sua purificazione la molecola è pronta a essere impiegata come vaccino. 25

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27 Vaccini contro la meningite batterica L hemophilus influenzae di tipo B era il maggiore responsabile della meningite batterica. Negli anni 80 (USA) era colpito da meningite 1 bambino su 200, il 25% di chi sopravviveva presentava lesioni cerebrali permanenti. Dopo l introduzione del vaccino ricombinante la malattia è scomparsa o ridotta del 90%. Oltre ai vaccini prodotti da sub unità vengono allestiti altri tipi di vaccini E stato sviluppato in Italia (Chiron spa) un vaccino contro la pertosse, il ceppo è stato modificato geneticamente e produce una tossina identica ma del tutto priva di tossicità (Bordetella pertussis), la tossina pè prodotta su larga scala e impiegata come vaccino. Vaccini ricombinanti batteri o virus modificati in modo da poter essere usati come vaccini vivi ricombinanti 27

28 Vaccini vivi ricombinanti Microorganismi eterologhi naturalmente non patogeni o resi tali, poxvirus o batteri dei generi Salmonella o Escherichia, dopo manipolazione fungono da vettori di geni esogeni, in grado cioè di esprimere proteine immunogene di un agente patogeno verso cui si vuole proteggere un individuo. Ad esempio nuovi vaccini sono allestiti incorporando nel genoma di pox virus non patogeni dei geni appartenenti ai virus dell HBV e dell Herpes simplex, è stato dimostrato nel coniglio in cui l uso del Vaccinia virus ha indotto immunizzazione per la presenza nel suo genoma di Microorganismi omologhi patogeni nei quali sono stati modificati i geni che ne influenzano la virulenza o deleti il virus può quindi stimolare una reazione immune senza però scatenare la malattia ad es. il virus erpetico dopo delezione del gene TK che causa la neurovirulenza e dal batterio del colera privato della capacità di produrre la sua enterotossina. geni corrispondenti ad antigeni appartenenti alle specie di HBV ed Herpes. 28

29 Il gene mutato non è patogeno 29

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31 Vaccini commestibili Sono vaccini prodotti in vegetali transgenici proteine immunogene sono state introdotte nel genoma di piante come tabacco, pomodori, soia ( ad esempio alte concentrazioni di proteine virali appartenenti al virus HBV. Da prove preliminari sembra acquisito il concetto che l ingestione di questi prodotti dia immunizzazione. Vaccini prodotti da animali transgenici: capre transgeniche che producono latte contenente le proteine del parassita responsabile della malaria da utilizzare per la vaccinazione. Più esattamente frammenti della proteina MSP-1, Principale proteina di superficie del plasmodio, la ricerca tende a valutare gli effetti di questa operazione su animali da esperimento (scimmie) prima di passare alla sperimentazione sull uomo. Ogni anno 500 milioni di persone contraggono la malattia e 3 milioni muoiono. 31