Farmaci Biotecnologici
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- Uberto Borghi
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1 Farmaci Biotecnologici Mariapia Vairetti Dipartimento di Medicina Interna e Terapia Sezione di Farmacologia e Tossicologia Cellulare e Molecolare
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3 ,! - &#!! %% ( +. " $##, /) - *" $ # $ #!! %%) - /0,##1 # $ "# 2) 3 "& $!4 %4% La produzione industriale di farmaci utilizzando i sistemi viventi come bioreattori si è da allora largamente diffusa, diventando attualmente la via preferita di sintesi di numerosi farmaci, in particolare per il costo di produzione relativamente basso. &! # 5! # 6 * Chimici Biotecnologici Aspirina: Peso molecolare 180 Interferone beta: peso molecolare
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9 Insulina umana il primo prodotto ricombinante autorizzato per uso terapeutico &=3& L insulina è prodotta dalle cellule β delle isole pancreatiche sotto forma di un precursore di 110 aminoacidi detto preproinsulina La conversione della proinsulina in insulina avviene nel complesso di Golgi ad opera di endopeptidasi.
10 Effetti immediati e ritardati dell insulina 1. Favorisce l entrata di glucosio nelle cellule 2. Nel fegato: - favorisce la sintesi di glicogeno (utilizzo del glucosio) - inibisce la glicogenolisi (deg. glicogeno) - inibisce la gluconeogenesi 3. Nei muscoli: - promuove la sintesi proteica e inibisce il catabolismo proteico - promuove la sintesi di glicogeno 4. Nel tessuto adiposo: - aumenta la sintesi di acidi grassi e trigliceridi, riduce la lipolisi inattivando le lipasi ; '% '& In seguito al legame con l insulina il recettore viene subito internelizzato, in seguito ad internelizzazione il recettore può essere degradato o riciclato per tornare sulla superficie della cellula. Il legame dell insulina al recettore porta ad una rapida autofosforilazione dei residui di tirosina, questo catalizza la fosforilazione di altri substrati enzimatici. L insulina può anche controllare la sintesi di secondi messaggeri, tramite l attivazione della fosfolipasi C che possono mediare l azione di enzimi cellulari. 9
11 Profilo fisiologico dell insulina Produzione: 0,6 U/kg/24h - produzione basale continua, indipendente dai pasti - secrezione episodica e rapida, in corrispondenza dei pasti 20 Glucosio plasmatico mmol/l Soggetto diabetico Soggetto normale 0 Pasti Ore della giornata Deficit di insulina: Diabete Mellito Si tratta della principale patologia che interessa il pancreas endocrino. Causa alterazioni del metabolismo ed iperglicemia entrata di glucosio nelle cellule di glucosio in circolo: gluconeogenesi epatica glucosio eccesso extracellulare deficit intracellulare fame in mezzo all abbondanza
12 ; DIABETE DI TIPO I o INSULINO-DIPENDENTE Compare soprattutto nei giovani Insulina virtualmente assente Causa chetosi Sembra avere cause autoimmuni Si tratta con insulina esogena DIABETE DI TIPO II o INSULINO-INDIPENDENTE Compare soprattutto negli adulti obesi Carenza recettori insulina Non causa chetosi Sembra avere cause ereditarie Può essere tenuto sotto controllo con una dieta adeguata ed esercizio fisico Si tratta con antidiabetici orali (sulfaniluree) Analoghi dell insulina Sono prodotti in cui la sequenza aminoacidica propria dell insulina umana viene modificata ad arte con delle sostituzioni di uno o più aminoacidi. Insulina Lispro Azione rapida (< 30 minuti) Durata breve (3 ore) 1996
13 Insulina Lispro Analoghi dell insulina Concentrazione di insulina libera nel sangue (µg/l) 2.5 Insulina Umana Normale 2.0 Insulina Lispro Tempo (minuti) - Somministrazione al momento del pasto (IR: 30 minuti prima) - Somministrazione dopo il pasto nei bambini molto piccoli - Minor accumulo sottocutaneo: minor rotazione delle sedi d iniezione Poiché l azione termina dopo circa 4 ore è necessario associarla ad un insulina a lunga durata, per il mantenimento dei livelli basali Insulina Aspart Analoghi dell insulina Carica - Azione rapida ( 60 minuti) Durata breve (3 ore)
14 Analoghi dell insulina Insulina Aspart Concentrazione di insulina libera nel sangue (µg/l) Insulina Umana Normale Insulina Aspart Tempo (minuti) Concentrazione plasmatica doppia in metà tempo rispetto a IR Necessario associare un insulina ad azione ritardata per il controllo della glicemia notturna Insulina Glargina Analoghi dell insulina Asp Cariche + Tempo di inizio ( 1.5 ore) Lunga durata d azione ( 24 ore) 7
15 Analoghi dell insulina Insulina Glargina Utilizzazione del Glucosio (mg/kg min) 4 2 Insulina Insulina Glargina Termine dell osservazione Tempo (ore) dopo l iniezione sottocute - Assenza del picco d azione - Simula il profilo di secrezione continua di insulina dei soggetti non diabetici - Somministrazione 1 sola volta al giorno Poiché formulata in soluzioni a ph acido non la si può somministrare insieme ad altra insuline (ph neutro) Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Ormoni Polipeptidici Peptidi o piccole proteine che svolgono funzioni essenziali nel controllo del metabolismo nei mammiferi. Alcuni sono farmaci salvavita Ormone della crescita: Humatrope Eritropoietina: regola la produzione di globuli rossi da parte del midollo osseo Epocim?
16 Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Proteine del sangue Proteine o fattori coinvolti nei processi della coagulazione del sangue (fattori VII, VIII, IX) sia nei processi che degradano i coaguli (TPA) Si sono eliminati i rischi associati alla potenziale contaminazione da parte di agenti virali (HIV, HBV, HCV) TPA: Activase Fattore VIII: Recombinate Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Immunomodulatori e Antitumorali I più noti sono gli interferoni che a seconda del tipo possono esplicare attività antivirale (α e β), immunomodulatrice (γ) o antitumorale (α). Interferone α: usato nel trattamento di cancro al rene, melanoma, alcune forme di linfoma e leucemie. IntronA, Infergen, Alfaferone, Roferon-A Interferone β: usato nel trattamento della SM, agisce sui linfociti T inibendone la migrazione e riduce la produzione di citochine. Avonex, Betaferon, Rebif Interferone γ : usato per ridurre l incidenza di infezioni in pazienti con ridotte difese immunitarie. Imukin 0
17 Altre categorie di farmaci prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Immunomodulatori e Antitumorali Altre molecole che trovano applicazione nella terapia antitumorale sono le interleuchine (IL-2), antagonisti del TNF IL-2: usata nel trattamento di alcune forme tumorali come il cancro al rene e alcuni melanomi. Proleukin Antagonisti del TNF: usati nel trattamento dell artrite reumatoide e psoriasica. Enbrel, Remicade, ) 9C#% $# "6 # $* I<>$# )"I<>. # $ $ # #!! # # )=! "%! 7?C#% ) 3" #. %% * # $ % $ # *! )&* *?9C)3# % 7 #% * #. 0C$ 6 * # # 5 %. "/?C)
18 # Vaccini Ricombinanti Mediante la tecnica del DNA ricombinante sono stati prodotti diversi vaccini la maggior parte dei quali è stata allestita clonando in una cellula procariota o eucariota il gene del microrganismo che codifica per la principale proteina immunogena, cioè quella proteina che nell ospite porta alla produzione di anticorpi in grande quantità. Vaccini a sub-unità Vaccini virali: una proteina del capside o della membrana esterna (envelope) Vaccini batterici: proteine di adesione (antigeni delle fimbrie) o specifiche tossine modificate (anatossine) /
19 B '<# 2 J B > %% Epatite B rappresenta un grosso problema sanitario: il virus responsabile (HBV), oltre che a causare la cirrosi epatica è anche un agente cancerogeno (cancro al fegato). Ad oggi il numero dei portatori cronici è stimati sui 300 milioni e possono trasmettere il virus a coloro che vengano in contatto con sangue infetto, liquido seminale, secrezioni vaginali, saliva, sudore o lacrime perpetuando così il mantenimento dell infezione. B '<# 2 J B > %% Virus a DNA con envelope Il virione contiene due antigeni associati al guscio proteico interno (core): Hbc e Hbe e un antigene di superficie (sull envelope) HBsAg (Hepatitis B surface Antigen) HBsAg rappresenta quindi la molecola di scelta per allestire il vaccino.
20 B '<# 2 J B > %% Il gene virale che codifica per HBsAg è stato clonato in un vettore e quindi trasferito ed espresso in un lievito S. Cerevisiae L antigene prodotto dal lievito presenta tutte le caratteristiche della proteina HBsAg nativa (glicosilazione e altre modifiche posttraduzionali) Antigene viene purificato per ultracentrifugazione, cromatografia e precipitazioni frazionate (purezza > 98%) viene adsorbito su Al(OH) 3 che funziona da adiuvante Engerix-B B ;! 2 Il maggior responsabile di questa patologia è il batterio Haemophilus Influenzae di tipo b (Hib). Prima della diffusione del vaccino la Meningite Batterica colpiva negli Stati Uniti 1 bambino su 200 1/4 dei bambini che sopravvivevano all infezione presentavano lesioni cerebrali o perdita dell udito Oggi, grazie al vaccino ricombinante la meningite da Hib è una rarità: l incidenza di infezione si è ridotta del 90% ed in alcuni paesi è addirittura scomparsa Hiberix 9
21 8 % * $ ####!$# %! Vaccino Antipertosse Mediante la tecnica del DNA ricombinante è stato ottenuto un ceppo di Bordetella Pertussis capace di produrre una tossina della pertosse del tutto identica, antigenicamente, a quella del ceppo patogeno, ma assolutamente priva di tossicità. La tossina mutata, prodotta in laboratorio su larga scala, viene purificata e impiegata come vaccino B Batteri o virus modificati geneticamente in modo da poter essere impiegati come vaccini vivi ricombinanti
22 B Microrganismi eterologhi naturalmente non patogeni o resi tali Alcuni proxivirus e batteri del genere Salmonella ed Escherichia Dopo ingegnerizzazione fungono da vettori di geni esogeni, esprimono cioè le proteine immunogene dell agente patogeno verso cui si vuole proteggere l individuo Nuovi vaccini: si sono incorporati i geni di alcuni virus (Epatite B, H. Simplex, Influenza Virus) nel genoma del Vaccinia Virus Nel coniglio, esperimenti preliminari di vaccinazione hanno dimostrato che si ottiene protezione valida verso questi virus La scelta di questo virus vettore sta nella sua resistenza: un vaccino così allestito non deve essere refrigerato e può venire liofilizzato e somministrato mediante scarificazione cutanea B Ceppi di microrganismi patogeni omologhi In questi microrganismi sono stati modificati o deleti i geni che ne condizionano la virulenza Il microrganismo potrà moltiplicarsi nel soggetto vaccinato, stimolando attivamente la risposta immunitaria specifica senza però causare la malattia Virus Erpetico allo studio quale vaccino dopo delezione del gene TK che causa la virulenza Batterio Vibrio Cholerae allo studio quale vaccino dopo averlo privato della capacità di produrre l enterotossina attiva, ma ancora in grado di indurre immunità
23 . *.$* &+* &$* -+* -$*,+*,$* +* $* Onco Infett neuro CVS respi Aids Immuno = 83A&K@!90@&A)
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