Tecnologia del DNA ricombinante

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1 Tecnologia del DNA ricombinante 1

2 PROCARIOTI E. coli NON PATOGENO GRAM-NEGATIVO SEMPLICE DA COLTIVARE CRESCE VELOCEMENTE Termofili Mesofili Psicrofili Psicrotrofi Alcuni dei microrganismi manipolati geneticamente per eseguire processi biotecnologici Microrganismo Esempio di applicazione Bacillus brevis Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis Corynebacterium glutamicum Escherichia coli Pseudomonas spp. Rhizobium spp. Streptomyces spp. Xanthomonas campestris Zymomonas mobilis produzione glucosio isomerasi produzione di alginato liasi insetticida microbico produzione di aminoacidi clonazione/espressione bioremediation fissazione dell azoto produzione di antibiotici produzione di resina xantorrea produzione di alcol 2

3 EUCARIOTI (Può essere presente una parete cellulare) LIEVITI Saccharomyces cerevisiae IMPORTANZA BIOINDUSTRIALE MODELLO DEGLI ORGANISMI EUCARIOTI RICERCA PRODUZIONE PROTEINE RICOMBINANTI EUCARIOTE COLTURE CELLULARI (insetti, piante, mammiferi) 3

4 Sistemi di restrizione-modificazione Tipo I Un singolo enzima contiene attività di restrizione e di metilazione. Il taglio viene effettuato lontano dalla sequenza di riconoscimento (fino a 1000 bp). ATP e S-adenosilmetionina come cofattori Tipo II Due enzimi distinti per il taglio e la metilazione. Non richiedono cofattori Riconoscono la stessa sequenza palindromica e agiscono al suo interno Tipo III Caratteristiche analoghe a quelli di tipo I Riconosce e modifica una sequenza palindromica ma taglia a ~25 bp di distanza 4

5 Sistemi di restrizione-modificazione Endonucleasi homing DNAsi codificate da introni o derivate da inteine Hanno sequenze di riconoscimento lunghe e tollerano un certo grado di variabilità In nomenclatura sono precedute dal prefisso I (introni)o PI (inteine) Nomenclatura: 1. Le prime tre lettere, scritte in corsivo, sono prese da genere e specie del batterio di origine. 2. Sierotipi differenti dello stesso organismo possono essere identificati da una quarta lettera minuscola (Es. Hind, Hinf). 3. Può seguire una lettera maiuscola o un numero, che identifica un ceppo particolare di quel batterio. 4. Un numero romano indica l ordine di scoperta, qualora dallo stesso batterio vengano isolati enzimi diversi. 5

6 Endonucleasi di restrizione di tipo II Riconoscono specifiche sequenze palindromiche 3000 enzimi caratterizzati Circa 500 sono disponibili per l uso di laboratorio Alcuni tagliano il DNA lasciando prolungamenti fosfato 5 oppure prolungamenti ossidrile 3 (estremità coesive) Altri tagliano lasciando estremità blunt In condizioni di reazione estreme manifestano attività star Roberts RJ et al. (2003) REBASE: restriction enzymes and metyltransferases. Nucleic Acid Research 31:

7 Enzimi diversi con la stessa specificità di riconoscimento e taglio 7

8 Mappatura fisica dei siti di restrizione elettroforesi T4 DNA ligasi (fago T4) o DNA ligasi (E. coli) 8

9 DNA ligasi P OH 3 5 P P Complesso enzima-amp ATP DNA ligasi T4 (ligasi blunt) A Enzima NAD+ DNA ligasi di E. coli P P OH P P DNA ligasi Temperatura ottimale teorica: 37 C Temperatura ottimale reale: 4-16 C Variazioni della concentrazione del DNA possono influenzare la reazione di ligasi: Bassa concentrazione di DNA favorisce le ricircolarizzazioni Alta concentrazione di DNA favorisce il legame intermolecolare (inserto-vettore) Trattamento del DNA tagliato (vettore) con fosfatasi alcalina per rimuovere i fosfati al 5 9

10 Plasmidi naturali Molecole circolari di dsdna ( kb), extracromosomiali e capaci di autoreplicazione A B Forma circolare aperta Linearizzato Forma superavvolta Supercoiled Plasmid DNA Plasmidi naturali Codificano solo alcune delle proteine necessarie alla replicazione Dipendono dagli enzimi dell ospite per la loro replicazione e trascrizione Regione ori (origine di replicazione): geni per la replicazione Lo spettro d ospite di un plasmide è determinato dalla sua regione ori Maggiore è il numero di geni nella regione ori, maggiore è la possibilità di replicarsi in ospiti diversi 10

11 Spesso codificano proteine che conferiscono nuove proprietà all ospite (a volte di grande interesse commerciale o clinico): Resistenza ad antibiotici, sostanze tossiche Capacità di produrre antibiotici, tossine, fattori di virulenza Nuove capacità metaboliche (degradazione di composti aromatici, fermentazione di zuccheri, produzione di solfuro di idrogeno ) Enzimi di restrizione e modificazione Capacità di fare la coniugazione Altre volte non è possibile associarli a nessun fenotipo: plasmidi CRIPTICI Classificazione -Plasmidi coniugativi (plasmidi F) recano l informazione necessaria per trasferirsi da una cellula all altra (geni tra) -Plasmidi non-coniugativi oppure -Plasmidi ad alto numero di copie (rilassati) -Plasmidi a basso numero di copie (stringenti) * *Colicin E1, which inhibits other E. coli strains 11

12 Numero di copie di un plasmide è determinato dai meccanismi che regolano l inizio della replicazione 1. Tramite RNA antisenso (RNA II) che ha funzione di primer (regione ori derivata dal plasmide Col E1) 2. Tramite interazione delle sequenze di inizio della replicazione con proteine specifiche (es: proteina repa) codificate da geni plasmidici vicino a ori 1. Tramite RNA antisenso (RNA II) che ha funzione di primer (regione ori derivata dal plasmide Col E1) 12

13 2. Tramite interazione delle sequenze di inizio della replicazione con proteine specifiche (es: proteina repa) codificate da geni plasmidici vicino a ori Per aumentare il numero di copie per cellula di plasmidi con il replicone pmb1/cole1 si può intervenire in vari modi: Ridurre i livelli di trascrizione di RNAI, per es. introducendo mutazioni nella sequenza del promotore Delezione del gene Rom/Rop (il numero di copie per cellula aumenta di volte) I plasmidi di prima generazione (es: pbr322) sono presenti in copie per cellula I plasmidi con un replicone pmb1/cole1 privo del gene Rom/Rop hanno un numero di copie molto più elevato (>500 per cellula) 13

14 Ripartizione Meccanismi molecolari precisi mantengono un numero stabile di copie del plasmide nella cellula ospite e assicurano la loro ripartizione tra le cellule figlie (regione par) La mancanza di questa regione può portare ad una incorretta ripartizione durante la divisione cellulare fino a perdita del plasmide in condizioni di stress, anche per plasmidi ad alto numero di copie. Incompatibilità Due plasmidi che non possono coesistere nella stessa cellula si dicono incompatibili (appartengono allo stesso gruppo di incompatibilità) Ciò accade quando i due plasmidi: Contengono la stessa regione par Utlizzano lo stesso meccanismo di replicazione (es: RNA antisenso) 14

15 Purificazione dei plasmidi Basato su lisi alcalina (ph ~12): in queste condizioni il DNA cromosomico (linare) si denatura mentre quello plasmidico (circolare) no. Dopo aggiunta di sodio acetato, il DNA cromosomico precipita mentre il DNA plasmidico rimane in soluzione. Il plasmide viene poi purificato tramite cromatografia a scambio ionico e eluito in TE o dh 2 O. 15

16 Plasmidi come vettori di clonaggio Un vettore plasmidico di buona qualità deve possedere le seguenti proprietà: 1. Piccole dimensioni (<10kb) 2. Possedere uno o più marcatori genetici, la cui presenza o assenza permette di selezionare le cellule che ospitano il plasmide (resistenze ad antibiotici o marcatori nutrizionali). 3. Contenere singoli siti di taglio per il più alto numero possibile di enzimi di restrizione. Questi siti devono stare al di fuori delle regioni essenziali (replicone e marcatore). Plasmidi ad alto numero di copie (rilassati) Sono i più utilizzati per la clonazione del DNA. Plasmidi a basso numero di copie (stringenti) Sono richiesti in applicazioni speciali : 1. Propagazione di sequenze di DNA instabili o di geni che sono letali per E. coli se presenti in molte copie 2. Costruzione di cromosomi batterici artificiali (BAC), che possono trasportare grandi segmenti (~100 kb) di DNA. 16

17 Il primo vettore artificiale di grande successo fu pbr322, creato nel 1977 da Bolivar e Rodriguez (Università di Città del Messico). E una molecola circolare di 4361 bp Contiene geni per la resistenza a tetraciclina e ampicillina Contiene siti unici di restrizione Contiene una origine della replicazione Derivato da RSF2124 Derivato da psc101 Derivato da pmb1/cole1 pbr322 17

18 Riparate dagli enzimi della cellula ospite TRASFORMAZIONE E. coli - ceppi RecA - (incapaci di fare ricombinazione) - ceppi mancanti degli enzimi di restrizione 1) CaCl 2 + shock termico cfu/μg DNA (dipende da dimensioni del DNA da introdurre) 2) Vettori fagici 3) Elettroporazione 10 9 cfu/μg DNA (più efficiente con DNA di grandi dimensioni - >100 kb -) altri organismi Competenza innata (dipendente dalle condizioni di crescita) es: Bacillus spp. (Gram+) Formazione di protoplasti Liposomi Elettroporazione Biolistica (Gene gun) Vettori virali 18

19 SELEZIONE I. Resistenza agli antibiotici II. Screening delle singole colonie per controllare la presenza del costrutto specifico (tramite PCR, analisi di restrizione, test di espressione, ecc) Serie dei plasmidi puc Contengono un sito di policlonaggio (polylinker), introdotto con la tecnica della clonazione di oligonucleotidi sintetici Il sito di policlonaggio è diverso in ogni plasmide della serie Il sito di policlonaggio è inserito nel gene lacz. Importante per la selezione delle colonie contenenti l inserto Sono disponibili primer universali per il sequenziamento degli inserti, disegnati sulle regioni che fiancheggiano il sito di policlonaggio da ambo i lati (2686 bp) 19

20 puc18 puc19 Saggio di α-complementazione Gene laci Proteina repressore IPTG Gene lacz peptide α della β-galattosidasi + Peptide complementare della β-galattosidasi codificato dalla cellula ospite β-galattosidasi intera = 1021 aa (3.1 kb) Il plasmide contiene solo i primi 146 codoni del gene lacz (peptide α) X-Gal Ceppo mutante M15 di E. coli contenente la delezione dei residui del gene lacz colonie blu 20

21 Saggio di α-complementazione Se si fornisce un substrato cromogeno (X-gal), l idrolisi del substrato da parte dell enzima β-galattosidasi dà luogo a molecole che si colorano di blu dopo esposizione all aria: Se avviene α-complementazione le cellule si colorano di blu (plasmidi non ricombinanti). Se non avviene α-complementazione le cellule restano bianche (plasmidi ricombinanti: l inserzione di DNA ha reso il peptide α non funzionale). Bisognatuttavianotareche: Il saggio può dare un certo numero di falsi negativi, cioè colonie blu che in realtà sono ricombinanti. Questo si verifica spesso con inserti piccoli di DNA (<100 bp) Il saggio può dare falsi positivi, cioè colonie bianche che in realtà non sono ricombinanti. Questo si può verificare se il ceppo accumula mutazioni nei geni lacz, oppure quando si tratta il vettore con un eccesso di fosfatasi alcalina. Batteriofago λ 1. dsdna lineare lungo 48.5 kb 2. Estremità ss coesive (cos) che permettono la circolarizzazione all interno dell ospite 21

22 ciclo litico ciclo lisogeno Lisi dell ospite Regolazione delle funzioni tardive Sintesi del DNA Regolazione e immunità Integrazione e ricombinazione Regione b2 (escissione) cos testa coda cos Può essere sostituita senza danneggiare il ciclo litico del virus 22

23 Quantità di DNA del fago per un efficace impaccamento: 75% 105% < 38 kb > 52 kb fagi non infettivi ~50 kb Vettori di inserzione : sito di restrizione unico in cui inserire il DNA Vettori di sostituzione: 2 siti delimitano una regione di riempimento clonaggio di inserti grandi (15-20 kb) Clonazione di un frammento di DNA di grandi dimensioni in un batteriofago λ Fenotipo Spi+ (non è in grado di infettare batteri lisogeni per il fago P2 possiede i geni red e gam) Fenotipo Spi _ 23

24 Stratagene Efficienza di trasformazione del DNA di λ con un inserto clonato: placche /μg di DNA => Impaccamento in vitro (anche con DNA monomerici) Proteina E (principale componente del capside) non espressa Non si ha produzione dei precursori delle teste Proteina D non espressa Non si ha impaccamento del DNA nelle teste +ATP +DNA Lisi e miscelazione degli estratti 24

25 Fago filamentoso M13 ssdna circolare Pilo F di E. coli F+ Non ci sono limitazioni della lunghezza del DNA dovute all impaccamento La forma replicativa ds si può manipolare come un plasmide Il DNA fagico ss si può usare come stampo per: Sequenziamento mutagenesi tramite oligonucleotidi preparazione di sonde 25

26 M13 come vettore di clonazione (α-complementazione) M13 mp18 26

27 Cosmidi Riuniscono le caratteristiche di plasmidi e vettori basati sul fago λ ~6 kb Blunt ends / defosforilazione ~50 kb Impaccamento in vitro Selezione tramite resistenza all antibiotico 27

28 Stratagene Vettori basati sul fago P1 (PAC) NB: genoma fago P1= 115 kb Replicone plasmidico:low copy Replicone P1: high copy Kanamicina-resistenti 28

29 Cromosomi artificiali batterici (BAC) Derivati da: Plasmide F di E. coli Sito cosn (da fagoλ) sitoloxp (da fagop1) siti di clonaggio (BamHI, HindIII) 1-2 copie per cellula Possono essere introdotti nelle cellule tramite trasformazione Vettore di clonazione estremamente stabile (adatto per costruzione di genoteche) Cromosomi artificiali di lievito (YAC) Vettori replicativi di lievito + telomeri vettore in grado di propagarsi come molecola lineare Stabilità proporzionale alla grandezza dell inserto Ma puo contenere inserti chimerici 29

30 Dimensioni massime degli inserti nei diversi vettori di clonaggio VETTORI PLASMIDICI fino a 10 kb VETTORI BASATI SUL FAGO λ kb VETTORI COSMIDICI kb VETTORI PAC (basati sul fago P1) kb VETTORI BAC (cromosomi artificiali batterici) fino a 300 kb VETTORI YAC (cromosomi artificiali di lievito) Mb Creazione e screening di una genoteca 30

31 Creazione e screening di una genoteca clonaggio 1.Tramite sonda 2.Tramite PCR 3.Immunologico 4.Attività della proteina (complementazione genica) screening Sintesi del cdna 31

32 Sintesi del cdna * * Degradazione RNA Apertura delle anse Degradazione ssdna *Azione difficilmente controllabile Sintesi del cdna CCCC 5 GGGG 3 CCCC mrna cdna Terminal transferasi + dctp AAAA 3 TTTT 5 mrna AAAA CCCC 3 TTTT 5 cdna Idrolisi dell RNA Recupero del cdna Sintesi del 2 filamento tramite oligo-dg 3 cdna ds TTTT 5 Clonaggio tramite linker 32

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