Anche i batteri fanno. (cioe si scambiano geni!)

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1 LA GENETICA DEI MICRORGANISMI ovvero Anche i batteri fanno sesso (cioe si scambiano geni!)

2 La coltivazione dei batteri Una colonia è formata da circa 10 7 cellule. Clone = discendenti di un unica cellula.

3 Mappatura nei procarioti Strategie analoghe Incroci tra ceppi che differiscono per marcatori genetici e identificazione e conta dei ricombinanti Differenze Eucarioti: scambio tra cromosomi appaiati alla meiosi che produce 2 prodotti reciproci Procarioti: no meiosi, ricombinazione non reciproca e prodotti non reciproci Trasferimento unidirezionale Scambi mai tra cromosomi interi ma tra il cromosoma principale di un ceppo (ricevente) e frammenti di DNA dell altro (donatore)

4 Marcatori genetici? Capacità di crescere Resistenza agli antibiotici o ai virus Mutanti Nutrizionali (auxotrofi) Fonte di carbonio Forma delle colonie Meccanismi mediante i quali avviene scambio di materiale genetico tra batteri: Trasformazione DNA libero Coniugazione contatto cellule Trasduzione mediato da fagi

5 La trasformazione scoperta da F. Griffith nel 1928 in Streptococcus pneumoniae. Trasferimento di materale genetico da un batterio all altro mediato da frammenti di DNA extracellulare. Nella trasformazione frammenti isolati di DNA vengono assorbiti dall esterno all interno della cellula

6 La trasformazione a livello molecolare

7 La mappa per trasformazione Con la trasformazione è possibile mappare i geni: quanto più due marcatori sono vicini, tanto più probabile è la loro cotrasformazione. ordini possibili: p-q-o e p-o-q

8 La scoperta della coniugazione - 1 Nel 1946 Joshua Lederberg e Edward Tatum dimostrarono che due ceppi di E.coli auxotrofi (E. coli A met - bio - thr + leu + thi + ed E. coli B met + bio + thr - leu - thi - ), posti a contatto, possono scambiarsi materiale genetico e creare dei batteri prototrofi. Colonie prototrofe: 1x10-7

9 La scoperta della coniugazione - 2 Alla fine degli anni 40 Bernard Davis scopre che se i due ceppi sono separati da un filtro attraverso cui possono passare molecole (ma non batteri) non si ha la formazione di prototrofi: il contatto fisico tra i due ceppi è indispensabile!

10 Il fattore di fertilità (F) W. Hayes (1953): il trasferimento genico avviene in una sola direzione: da un donatore (maschio) ad un ricevente (femmina). Hayes trovò un donatore sterile (cioè incapace di trasferire l informazione) che si era trasformato in un ricevente. Ipotesi capacità di fungere da donatore è una condizione ereditaria determinata da una fattore di fertilità F. Ceppi con F sono donatori (F + ), quelli senza F sono riceventi (F - ). Fattore F: plasmide che si replica nel citoplasma batterico in modo autonomo.

11 La scoperta della coniugazione - 3

12 I ceppi Hfr Luca Cavalli Sforza scoprì un nuovo ceppo derivato da un F+ chiamato high frequency of recombination (Hfr). L incrocio HFR x F- dava 1000 volte più ricombinanti dell incrocio F+ x F-, ma nessuna cellula F- diventava F+. Il ceppo Hfr si forma in seguito all integrazione di F nel cromosoma batterico. Quando si mescolano cellule F+ con cellule F-: il fattore F si integra nel cromosoma batterico con una bassa frequenza. I geni batterici si trasferiscono ma con bassa frequenza. Nell incrocio Hfr x F- invece: tutti i batteri donatori hanno F integrato, frequenza di ricombinanti è alta.

13 L integrazione di F Ricombinazione tra due anelli di DNA, in seguito ad un singolo crossing over, con formazione di un anello unico che è la somma dei due precedenti. In questo modo un ceppo F+ (con F plasmide libero) diventa HFR. Una volta inserito, il plasmide F mantiene la sua capacità di riconoscere un batterio F- e di iniziare la coniugazione.

14 Il trasferimento di HFR - 1 Il trasferimento di F integrato (HFR) comincia sempre a partire dall origine di replicazione O. Quindi il ricevente, per poter diventare F+, dovrebbe ricevere tutto il cromosoma batterico del donatore. O lac pro thr pur gal his gli O thi HfrH pur lac pro thr gal il fattore F

15 Il trasferimento di HFR - 1 Poiché il pilo sessuale è instabile, il trasferimento non è mai completo, per cui il ricevente resta F- ma riceve una parte di DNA batterico donatore che può eventualmente essere integrata dal ricevente. lac pur gal pro thr O HfrH hi sgli thi pur lac pro thr gal

16 Il trasferimento di HFR - 2 A questo punto, il ricevente non ha ricevuto un DNA circolare, ma lineare! Questo potrà eventualmente essere integrato nel genoma del ricevente per ricombinazione sfruttando l omologia del DNA batterico, e solo in seguito ad un numero pari di crossing over.

17 La coniugazione interrotta Elie Wollman e François Jacob, 1957 Si può sfruttare la labilità del pilo e l inserzione di F per mappare i geni di un cromosoma batterico. Le inserzioni di F sono casuali sia come punto di inserzione, sia come orientamento, quindi ogni ceppo batterico HFR trasferirà geni nel ricevente con un ordine che riflette la disposizione dei geni lungo il cromosoma.

18 La procedura I due tipi di cellule vengono mescolate in gran quantità in un terreno liquido a 37 C. A vari tempi vengono prelevati dei campioni della coltura, vengono agitati (per interrompere artificialmente la coniugazione) e piastrati su terreni selettivi contenenti streptomicina per uccidere le cellule Hfr. Quello che si ottiene è una mappa a tempo del cromosoma batterico donatore. Esempio: donatore HfrH thr + leu + azi R ton R lac + gal + str S ricevente: F- thr leu azi S ton S lac gal str R

19 Le mappe a tempo Wollman e Jacob scoprirono che: Ogni allele del donatore appariva nel ricevente F- dopo un intervallo di tempo ben preciso dall inizio della coniugazione. Gli alleli del donatore si presentavano sempre in una specifica sequenza. I marcatori che entravano più tardi comparivano in un numero minore di cellule. Da queste osservazioni dedussero che il trasferimento avviene a partire da un punto ben preciso sul cromosoma del donatore chiamato origine O e prosegue secondo modalità lineare.

20 Il gradiente di trasferimento Anche se la coniugazione non viene interrotta il ponte di coniugazione si rompe spontaneamente. Pertanto solo di rado il cromosoma viene trasferito per intero. La rottura spontanea può verificarsi in qualsiasi momento. Ciò determina un gradiente di trasferimento il marcatore più vicino all origine (es. met) verrà trasferito con la frequenza più alta

21 Costruzione della mappa Come unità di misura si usa la distanza di tempo (in minuti) impiegato dagli alleli del donatore ad entrare nel ricevente. Solo dopo 2 ore i riceventi diventano F+ il fattore F entra per ultimo.

22 Il cromosoma batterico è circolare Usando vari ceppi Hfr ed ottenendo mappe diverse, Campbell ipotizzò che il cromosoma batterico fosse circolare.

23 Il saggio a tre punti nei batteri

24 La sesduzione, ovvero F Nel 1959 E. Adelberg, in un ceppo Hfr il fattore F può excidersi e generare un ceppo F+.Se però si excide in maniera errata può incorporare il gene batterico accanto al quale era inserito. In questo caso prende il nome di F. Il plasmide F può coniugare e inserire il gene che ha incorporato in un batterio ricevente (sesduzione) che diventa F+

25 La trasduzione trasferimento di geni batterici mediato da batteriofagi

26 Ciclo di crescita del fago temperato lambda

27 Trasduzione generalizzata e trasduzione specializzata I fagi che effettuano la trasduzione generalizzata veicolano qualsiasi porzione del genoma dell ospite I fagi che effettuano la trasduzione specializzata trasferiscono solo porzioni specifiche

28 La trasduzione generalizzata (Joshua Lederberg e Norton Zinder 1951) Salmonella typhymurium phe+trp+tyr+ met-his- x phe-trp-tyr- met+his+ ricombinanti prototrofi anche se messi in un tubo ad U vettore della ricombinazione: il fago P22

29 Il meccanismo della trasduzione generalizzata è stato chiarito da Ikeda e Tomizawa con il fago P1 nel 1965

30 Trasduzione generalizzata

31 NB nella testa del fago non restano geni fagici!!

32 Con la trasduzione generalizzata si possono stabilire relazioni di associazione tra i geni La cotrasduzione: il trasferimento di due geni batterici (molto vicini) ad opera dello stesso fago

33 donatore leu+thr+azi R x ricevente leu-thr-azi S thr leu azi thr azi leu oppure thr leu azi

34 Come si calcola la frequenza di cotrasduzione?

35 donatore a+b+ x ricevente a b a+b a b+ trasduttanti a+b+ frequenza di cotrasduzione = numero dei trasduttanti per entrambi i marcatori numero di trasduttanti totali x 100% selezionando per a+ freq. di cotrasduzione = (a+b+) (a+b)+(a+b+) x 100% selezionando per b+ freq. di cotrasduzione = x 100% (a+b+) (a b+)+(a+b+)

36 Trasduzione specializzata

37 Il profago λ si integra con un crossing over a livello del sito di attacco di lambda tra i geni gal e bio

38 Meccanismo della trasduzione specializzata

39 Riassunto

40 Mappatura del genoma fagico

41 Fenotipi fagici : placche di lisi e specificità d ospite (ceppo batterico che un fago è in grado di lisare)

42 Marcatori del fago T2: h+ lisa il ceppo B di coli ma non il ceppob/2 ceppo B h lisa sia il ceppo B che il B/2 r+ placche piccole con margini indistinti r placche grandi con margini netti quando fagi h+ crescono su uno strato misto di cellule B e B/2 formano placche torbide perchè lisano solo B e i batteri B2 crescono nelle placche provocando torbidità delle placche. I fagi h formano invece placche chiare

43 Il lisato si piastra su una miscela di ceppi B e B/2

44 Frequenza di ricombinazione tra h ed r = placche (h + r + ) + (h r ) placche totali x 100