DNA batterico. Nei batteri le mutazioni possono essere indotte e/o spontanee

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1 DNA batterico Il DNA batterico si replica in modo semiconservativo, utilizzando entrambi i filamenti come stampo e richiede l intervento di numerosi enzimi. Nei batteri le mutazioni possono essere indotte e/o spontanee Nei batteri può avvenire uno scambio (trasferimento) di informazioni geniche: - unidirezionale da donatore a ricevente - non è mai trasferito l intero cromosoma - può avvenire tra specie diverse

2 DNA: materiale genetico primario Ogni tripletta di basi consecutive definisce un codone e codifica per un aminoacido; coppie di nucleotidi costituiscono un gene (proteina di AA) Cromosoma batterico coppie di basi, circa geni. Non ci sono introni. DNA polimerasi: III interviene nella replicazione, I e II nei meccanismi di riparo Elicasi: intervengono nello svolgimento dell elica Topoisomerasi I e II (girasi): intervengono nella separazione delle eliche Primasi: RNA polimerasi che sintezzano i primers, corte sequenze nucleotidiche che fungono da innesco Schema della replicazione semiconservativa del DNA: Eliche figlie (nuove) complementari alle eliche parentali (vecchie). Ciascuna copia contiene un elica vecchia ed una nuova

3 Replicazione del DNA Le elicasi, con l aiuto delle girasi, Il cromosoma batterico rimane circolare durante la replicazione La replicazione inizia da un origine, prosegue nelle 2 direzioni (2 forche replicative), termina quando le forche si incontrano: intermedi a forma di theta svolgono la doppia elica La primasi sintetizza un corto innesco di RNA (1-5 nucleotidi) complementare alla elica stampo; DNA pol III a partire da 3 -OH del primer sintetizza (5 3 ) un elica complementare al filamento leading e frammenti di Okazaki discontinui (circa 1000 nucleotidi) (5 3 ) sull altro filamento (lagging o lento) La DNA pol I rimuove gli RNA primers e sintetizza i pezzetti mancanti La ligasi lega i frammenti tra loro per ricostituire la molecola Potenzialità di errore (mutazioni) errori corretti da DNA pol III e I

4 Replicazione del DNA Modello di replicazione a rolling circle (cerchio rotante) Utilizzato durante la coniugazione e dai plasmidi oltre che da alcuni virus I. in corrispondenza di un origine (O) una delle 2 eliche viene tagliata II. III. IV. l estremità libera 3 -OH funziona da primer per la DNA pol III, che inizia a copiare l elica complementare. La catena interrotta si dipana e forma una coda libera con l estremità 5 la neosintesi procede e la coda si allunga V. la nuova catena è completamente sintetizzata e la parentale, completamente dipanata, si distacca VI. quest ultima catena serve come stampo per la sintesi di una catena complementare, che può a questo punto circolarizzare (alla fine del processo si hanno 2 nuove molecole di DNA) Anche in questo caso la replicazione è semiconservativa

5 Il codice genetico universale degenerato senza sovrapposizioni Codoni: triplette Codone AUG (Met): inizio sintesi proteica Codoni STOP: fine sintesi proteica

6 Trascrizione: sintesi di RNA RNA polimerasi sintetizza RNA (mrna, rrna, trna) su di uno stampo di DNA, rappresentato dal filamento senso l RNA polimerasi batterica è costituita da 6 subunità (α 2, β, β, ω, σ); gli mrna sono frequentemente policistronici e colineari con il DNA trascritto: non c è splicing Dato che la sintesi di mrna nei batteri avviene nel citoplasma, spesso si ha accoppiamento di trascrizione e traduzione, cioè la sintesi proteica inizia già prima della fine della trascrizione

7 Traduzione dell mrna: sintesi proteica 3 fasi inizio, allungamento, terminazione A) Schema generale B) Inizio: mrna si lega alla subuità 30S libera l iniziatore (Nformilmetionil-tRNA, fmet-trna) si lega con l anticodone ad AUG nel sito P; la subunità 50S si associa al complesso Allungamento: il ribosoma scorre sull mrna di un codone (traslocazione), il secondo AAtRNA entra nel sito A e si forma il legame peptidico con fmet ad opera di peptidil-trasferasi. Il trna scarico si sposta nel sito E ed esce dal ribosoma; vengono aggiunti i nuovi AA (sito A, legame nel sito P, uscita trna nel sito E) Terminazione: si ha quando nella sequenza dell mrna si trova un codone STOP. L ultimo AA viene chiamato carbossi-terminale. Il ribosoma si dissocia, la proteina viene rilasciata e il gruppo formilico viene rimosso da fmet.

8 Meccanismi di regolazione genica Consentono alla cellula di produrre proteine (enzimi) solo quando servono ECONOMIA CELLULARE Instabilità dell mrna (nei batteri, emivita: 4-6 minuti, necessità di continua sintesi) Controllo della sintesi proteica a livello di trascrizione Enzimi costitutivi: prodotti continuamente (es. enzimi per la degradazione del glucosio) Enzimi inducibili: prodotti in presenza del substrato (es. β galattosidasi per lattosio) 3 meccanismi fondamentali (schema di Jacob e Monod) 1) INDUZIONE 2) REPRESSIONE 3) FEED BACK

9 Meccanismi di regolazione genica I geni strutturali per la sintesi di enzimi di una data via metabolica sono sotto il controllo di un gene operatore (l insieme è chiamato operon). Tutto l operon è a sua volta sotto il controllo di un gene regolatore che codifica per una particolare proteina (repressore) in grado di legarsi all operatore, bloccandolo e bloccando tutto l operon. In assenza del substrato, l operon è represso. Quando è presente, il substrato si lega al repressore inattivandolo: il gene operatore si attiva ed attiva tutto l operon (Induzione da parte del substrato). Alcune volte, il repressore è inizialmente inattivo; legandosi ad un prodotto finale della via metabolica si attiva, bloccando il gene operatore (Repressione da parte del substrato). In altri casi, il prodotto finale si lega ad uno degli enzimi della via metabolica (di solito l enzima 1) bloccandolo (Inibizione da feed-back)

10 DNA extracromosomico: plasmidi Elementi genetici accessori (DNA bicatenario circolare), in grado di replicarsi autonomamente rispetto al cromosoma batterico (repliconi) Dimensioni minori del cromosoma ( coppie di basi) Contengono un limitato numero di geni (meno di 30) (autoreplicazione + geni caratteristici di ogni plasmide) - informazione genetica non essenziale (possono essere persi batteri curati ) - presenti da 1 a centinaia (multicopia) di molecole per cellula Episomi plasmidi in grado di "integrarsi" nel cromosoma batterico

11 Principali tipi di plasmidi Fattore F (di fertilità) (94,5 kb) - responsabile della formazione del pilo sessuale nella coniugazione - responsabile del possibile trasferimento di materiale cromosomico da F+ a F- Plasmidi R - responsabili della resistenza agli antibiotici (enzimi inattivanti) - alcuni coniugativi (RTF), diffusione delle resistenze Plasmidi Col - produzione di batteriocine Plasmidi di virulenza - produzione di tossine o fattori di colonizzazione (fimbrie) Plasmidi metabolici - produzione di enzimi degradativi - resistenza a metalli pesanti (Pb, Hg, As, ecc.)

12 Plasmidi Mappa genetica di un plasmide (pbr322) Ogni plasmide contiene: Ori, origine per la replicazione autonoma; eventuali geni che codificano per il proprio trasferimento attraverso coniugazione (TF); altri geni, che codificano per resistenza agli antibiotici (es. ampicillina Ap e tetraciclina Tc), batteriocine, tossine. A volte sono presenti più geni contemporaneamente. Sigle e numeri della figura indicano la posizione dei siti di restrizione (quali enzimi di restrizione possono tagliare il plasmide ed in quale posizione).

13 Enzimi di restrizione - endonucleasi prodotte dai batteri per difendersi dai batteriofagi - tagliano il DNA bicatenario in corrispondenza di sequenze specifiche, generando estremità coesive o piatte (4, 5, 6, 7, 8, ecc. coppie di basi) - utilizzati per trasferire geni su vettori (es. plasmidi), rilegati dalle ligasi DNA ricombinante ingegneria genetica Dpn II Dde I Eco RI Fse I Alu I Dra I Pme I BsaB I

14 DNA extracromosomico: Elementi trasponibili (geni mobili) Elementi genetici accessori (DNA bicatenario lineare) molto diffusi sia tra i procarioti sia tra gli eucarioti, non in grado di replicarsi autonomamente, ma in grado di integrarsi nel DNA cromosomico o in plasmidi (trasposizione), responsabili di molti fenomeni di variabilità genetica Scoperti negli anni 40 da Barbara McClintock (premio Nobel 1983)

15 Sequenze di inserzione e Trasposoni Sequenze di inserzione (IS) Elementi trasponibili più semplici: brevi sequenze ( coppie di basi, bp) contenenti il gene per la trasposasi (tnp), affiancato da brevi sequenze (15-40 bp) ripetute e invertite, che permettono l inserzione nel cromosoma batterico Struttura di una IS Esempi di trasposoni composti A) Tn5; B) Tn3 Trasposoni composti (Tn) Nel core si trovano diversi tipi di geni (resistenza agli antibiotici, produzione di tossine, ecc.) affiancati da IS, che ne permettono la trasposizione

16 DNA extracromosomico: Batteriofagi Virus dei batteri il loro genoma può rappresentare un elemento genetico accessorio Responsabili della trasduzione e della lisogenia conversione lisogena: acquisizione di nuove caratteristiche da parte del batterio; ad es. produzione di tossine

17 Variabilità genetica Evoluzione Microrganismo ancestrale Mutazioni spontanee Variabilità genetica Differenziazione Maggiore adattabilità all'ambiente (selezione naturale) Nei procarioti, per la mancanza di riproduzione sessuale, la variabilità genetica è dovuta a: Mutazioni Trasferimento intercellulare di materiale genetico (ricombinazione)

18 Ricombinazione genetica La ricombinazione è un processo unidirezionale mediante il quale una porzione di materiale genetico (DNA) è trasferita da un donatore ad una cellula ricevente che la integra nel suo cromosoma, attraverso processi di scambio di sequenze omologhe, con acquisizione di nuove caratteristiche fenotipiche trasformazione trasduzione coniugazione

19 Trasformazione Fine anni 20: Griffith Cellula donatrice lisata DNA libero cellula ricevente competente La cellula è normalmente impermeabile al DNA, a meno che non si trovi in uno stato di competenza (formazione di pori transitori nella membrana che permettono il passaggio di molecole di DNA) I frammenti di DNA devono avere certe dimensioni (> daltons) Occorre elevata omologia tra il DNA di donatore e ricevente cellule della stessa specie I frammenti di DNA entrano, si appaiano e possono ricombinarsi (a sinistra) Lo stato di competenza può essere indotto artificialmente (ad es. trattando la cellula ricevente con ioni positivi, quali Ca++, mediante elettroporazione, ecc.)

20 Trasformazione con plasmidi La trasformazione è il metodo più utilizzato in ingegneria genetica per introdurre plasmidi (o altri vettori), contenenti DNA ricombinante, all interno di cellule ospiti

21 Trasduzione Ricombinazione batterica mediata da batteriofagi (fagi)

22 Trasduzione generalizzata Durante il ciclo litico il DNA batterico può essere degradato e sue parti possono essere impacchettate per errore nelle teste fagiche (particelle trasducenti) Quando queste infettano altre cellule, trasferiscono il DNA (geni) batterico, che può integrarsi con quello del ricevente

23 Trasduzione specializzata o ristretta Il più importante fago temperato è il fago λ (lambda) Durante il ciclo lisogeno il fago temperato si integra nel cromosoma batterico (profago) in un punto ben definito (sito di integrazione). Durante la fase di escissione per errore può portarsi dietro parti del genoma batterico che possono essere trasferite e possono ricombinarsi con il cromosoma del ricevente. Si definisce trasduzione ristretta, perché solitamente solo pochi geni vicini al punto di inserzione del profago possono essere trasferiti.

24 Coniugazione 1946: Lederberg e Tatum avviene attraverso il contatto fisico tra 2 cellule, la cellula F+ (donatrice)che presenta F libero nel citoplasma e la cellula F- (ricevente) priva di F Plasmide F (94,5 kb) contiene geni (geni tra) per il proprio trasferimento e la formazione del pilo sessuale e sequenze IS che consentono l appaiamento a sequenze omologhe sul cromosoma e la successiva integrazione OriT indica l origine di replicazione ed il sito in cui comincia il trasferimento orientato nella coniugazione

25 Coniugazione Fotografia al M.E. di una cellula F + (a destra) e di una F - (a sinistra) collegate dal pilo sessuale durante la coniugazione I plasmidi possono trasferirsi per coniugazione, ma non si frequenza di ricombinazione) in cui il plasmide F si trova tratta di ricombinazione Responsabile della ricombinazione mediante coniugazione è una Cellula HFR (ad alta integrato nel cromosoma batterico

26 Coniugazione incrocio HFR F- Vera ricombinazione F si apre in corrispondenza di O e comincia a trasferirsi trascinandosi dietro i geni del cromosoma, che possono ricombinarsi con i geni del ricevente (questo rimane F - ) Il passaggio dell intero cromosoma richiede 90. Il pilo si rompe facilmente per cui passano geni diversi a seconda del tempo di contatto è possibile la definizione della mappa cromosomica

27 Coniugazione incrocio F F- Vera ricombinazione Quando F si libera dal cromosoma (escissione) per errore può portare con sé qualche gene cromosomico (F )

28 Mutazioni Alterazioni stabili ed ereditarie dell'informazione genetica, cioè alterazioni della sequenza di basi di un gene che possono portare all alterazione della sequenza aminoacidica e all eventuale alterazione della struttura e della funzione Mutazioni macrolesionali: delezione di più di una coppia di basi, duplicazione di sequenze preeesistenti e alterazioni di ampi tratti del DNA in conseguenza di fenomeni di inversione e traslocazione che possono verificarsi con frequenze molto più elevate di quelle dovute a errore di duplicazione

29 Effetti delle mutazioni sul fenotipo Retromutazione: La mutazione ripristina una funzione perduta con una precedente mutazione Di senso: La tripletta modificata codifica per un aminoacido (uguale o diverso dall'originale) Non senso: La tripletta modificata diventa un codone stop (UAA, UAG, UGA) con conseguente interruzione della catena polipeptidica Silente: La sostituzione di una base con un'altra nella tripletta porta alla codifica dello stesso aminoacido (es. da UUU - Phe a UUC - Phe) e il prodotto genico è inalterato, oppure la mutazione altera un aminoacido ma non la funzionalità del prodotto genico Leaky: La mutazione porta ad un prodotto genico alterato, ma ancora funzionante anche se in modo ridotto (blocco metabolico incompleto) Permissiva: La mutazione porta ad un prodotto genico alterato, in grado di funzionare solo in particolari condizioni (mut. letale condizionale); es. mutanti termosensibili Letale: La mutazione porta ad un prodotto genico alterato, inattivo. Se esso può essere surrogato da precursori forniti dall'esterno si ha la produzione di mutanti auxotrofi.

30 Valutazione delle proprietà genotossiche dei composti chimici: Test di Ames (Individuazione di agenti mutageni) Si utilizzano ceppi di Salmonella mutanti nel gene per l istidina (HIS-), che crescono solo in terreno contenente istidina. In ognuno di tali ceppi si possono verificare retromutazioni spontanee con una certa frequenza (HIS+).

31 Valutazione delle proprietà genotossiche dei composti chimici: Test di Ames (Individuazione di agenti mutageni) Se ad un terreno privo di istidina viene aggiunto un mutageno, la frequenza di retromutazione aumenta significativamente, consentendo la crescita di un numero di colonie maggiore. In assenza del mutageno, si produce un certo numero di colonie (retromutanti spontanei). Se, in presenza di diverse concentrazione del composto chimico, si osserva un aumento dose-dipendente del numero delle colonie (di almeno 2-3 volte), il composto è giudicato mutageno. Dal momento che alcuni composti chimici non sono mutageni (potenzialmente cancerogeni) in quanto tali, ma possono diventarlo se metabolizzati all interno dell organismo (nell uomo e negli animali soprattutto nel fegato), il saggio è stato perfezionato aggiungendo alla miscela un sistema di metabolizzazione esogeno, costituito da un omogenato (microsomi) di fegato di ratto.