Inclusion bodies: : se li conosci li eviti

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Fulvio Marco Franchini
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1 Alto livello di espressione + errata conformazione Inclusion bodies Inclusion bodies: : se li conosci li eviti La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16 C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) aumentando l espressione l di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro Vettori per l espressione di chaperonine

2 Inclusion bodies: : se li conosci li eviti ma non necessariamente La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16 C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) aumentando l espressione l di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro Possono essere il punto di partenza, una volta purificati per la preparazione di un proteina d interessed L involucro dei batteri Gram negativi Gram+ Lo spazio periplasmico è un ambiente ossidante L aggiunta di peptidi segnale favoriscono il trasporto dal citoplasma allo spazio periplasmatico (es. MKTHRLNMTASLLIGISAFA ) La proteina periplasmatica DsbA induce la formazione di ponti disolfuro tra cisteine

3 Espressione di proteine ricombinanti in Escherichia coli Vantaggi - Crescita rapida - Elevata densità cellulare su substrati poco costosi Svantaggi Formazione di inclusion bodies Folding ossidativo limitato - Organismo molto ben allo spazio periplasmico caratterizzato e ricca Modificazioni post- collezione di mutanti traduzionali non adeguate - Numero elevato di (ad es. glicosilazione) vettori di clonaggio ed espressione 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico

4 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico

5 Rese di produzione Peso umido Peso secco Proteine totali Per cellula 9.5x10-13 g 2.8x10-13 g 1.55x10-13 g Per litro a 10 9 cells/ml 0.95 g 0.28 g 0.15 g Rese massime teoriche di una proteina d interesse per litro di coltura a 10 9 cells/ml % delle proteine totali Resa/litro 150 µg 3 mg 75 mg 4) Raccolta delle cellule e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico

6 Raccolta: filtrazione e centrifugazione Per lisare le cellule: lisozima sonicazione French Press Nel caso di espressione periplasmatica si lisa solo lo spazio periplasmico con shock osmotico French Press 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico Ottimizzazione dell espressione espressione in E. coli della leptina umana Jeong and Lee (2000) Biotechnol Bioeng 67: La leptina umana, prodotto del gene obese è una piccola proteina di 16 kda secreta dagli adipociti Ha il compito di informare il cervello su quando smettere di mangiare La somministrazione di leptina potrebbe costituire un cura dell obesit obesità Infatti nel topo ob/ob la somministrazione di leptina fa diminuire la fame e il peso corporeo

7 Ottimizzazione dell espressione espressione in E. coli della leptina umana La leptina contiene due cisteine che formano un ponte disolfuro La rinaturazione da corpi di inclusione non è efficiente Anche l espressione l periplasmatica della leptina con segnali di secrezione di E. coli è risultata inefficiente P T7 P T7

8 P trc P trc Una semplice riduzione della temperatura aumenta sensibilmente la solubilità della leptina. Ma nonostante questo miglioramento l attività della proteina resta bassa..

9 DsbA DsbA è un enzima periplasmico coinvolto nella formazione di ponti disolfuro Questa volta con completo recupero dell attività biologica

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