07/01/2015. Vettori per l espressione di chaperonine. Il successo si consuma freddo: i vettori per espressione a basse temperature

Dimensione: px

Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "07/01/2015. Vettori per l espressione di chaperonine. Il successo si consuma freddo: i vettori per espressione a basse temperature"

Gloria Palmieri
5 anni fa
Visualizzazioni

1 Alto livello di espressione + errata conformazione Inclusion bodies Vettori per l espressione di chaperonine Il successo si consuma freddo: i vettori per espressione a basse temperature 1

2 Inclusion bodies: se li conosci li eviti La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16 C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) aumentando l espressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro Inclusion bodies: se li conosci li eviti ma non necessariamente La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16 C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) aumentando l espressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro Possono essere il punto di partenza, una volta purificati per la preparazione di un proteina Gram+ Lo spazio periplasmico è un ambiente ossidante L aggiunta di peptidi segnale favoriscono il trasporto dal citoplasma allo spazio periplasmatico (es. MKTHRLNMTASLLIGISAFA ) La proteina periplasmatica DsbA induce la formazione di ponti disolfuro tra cisteine 2

3 Come si dirige una proteina nello spazio periplasmatico? GGATCCATG-seq cod. Pep segnale (50-60 nt) L utilizzo di primer modificati con diversi tipi di coda può permetterci di aggiungere domini/regioni specifiche a una proteina. Il problema di superare una membrana citoplasmatica non si risolve automaticamente con un peptide segnale Ottimizzazione dell espressione in E. coli della leptina umana Jeong and Lee (2000) Biotechnol Bioeng 67: La leptina umana, prodotto del gene obese è una piccola proteina di 16 kda secreta dagli adipociti Ha il compito di informare il cervello su quando smettere di mangiare La somministrazione di leptina potrebbe costituire un cura dell obesità Infatti nel topo ob/ob la somministrazione di leptina fa diminuire la fame e il peso corporeo Ottimizzazione dell espressione in E. coli della leptina umana La leptina contiene due cisteine che formano un ponte disolfuro La rinaturazione da corpi di inclusione non è efficiente Anche l espressione periplasmatica della leptina con segnali di secrezione di E. coli è risultata inefficiente 3

4 P T7 P trc 4

5 P trc DsbA DsbA è un enzima periplasmico coinvolto nella formazione di ponti disolfuro 5

6 Espressione di proteine ricombinanti in Escherichia coli Vantaggi - Crescita rapida - Elevata densità cellulare su substrati poco costosi - Organismo molto ben caratterizzato e ricca collezione di mutanti - Numero elevato di vettori di clonaggio ed espressione Svantaggi Formazione di inclusion bodies Folding ossidativo limitato allo spazio periplasmico Modificazioni posttraduzionali non adeguate (ad es. glicosilazione) 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 6

7 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 7

8 Rese di produzione Per cellula Per litro a 10 9 cells/ml Peso umido 9.5x10-13 g 0.95 g Peso secco 2.8x10-13 g 0.28 g Proteine totali 1.55x10-13 g 0.15 g Rese massime teoriche di una proteina per litro di coltura a 10 9 ce % delle Resa/litro proteine totali mg mg mg 4) Raccolta delle cellule e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 8

periplasmatica si lisa solo lo spazio periplasmico con shock

9 Raccolta: filtrazione e centrifugazione Per lisare le cellule: lisozima sonicazione French Press Nel caso di espressione periplasmatica si lisa solo lo spazio periplasmico con shock osmotico French Press 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 9

Documenti analoghi

Inclusion bodies: : se li conosci li eviti

Alto livello di espressione + errata conformazione Inclusion bodies Inclusion bodies: : se li conosci li eviti La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura