Le spore di clostridi in digestione anaerobica.

Transcript

1 «Biogas, aspetti igienico-sanitari e prodotti DOP» Le spore di clostridi in digestione anaerobica. Fabrizio Cappa Istituto di Microbiologia - CRB Facoltà di Scienze agrarie, alimentari, ambientali UCSC, Piacenza Cremona fabrizio.cappa@unicatt.it Fabrizo Cappa Istituto di Microbiologia

2 Le spore di clostridi in digestione anaerobica. I. Clostridi II. Clostridi nei digestori anaerobici III. Digestori in termofilia scala reale IV. Digestori in mesofilia e termofilia scala laboratorio V. Conclusioni

3 Comunità microbica in un impianto di biogas Microrganismi Bacteria 80-98% Archaea 20-2% Sundberg et al 2013 Bacteria Firmicutes 53% Bacteroidetes 13% Actinobacteria 4-6% Proteobacteria 4-6% Spirochetes 4-6% Verrucomicrobium 0.5-2% Acidobacterium 0.5-2% Chloroflexy 0.5-2% altri Firmicutes Clostridia 31-84% Sphingobacteria 0.1-8% Bacilli 0.1-5% Erysipelotrichi 0.1-2% Firmicutes sconosciuti 1-14%

4 Distribuzione della composizione della comunità microbica in un digestore per la produzione di biogas Firmicutes 44% Wirth 2012 Clostridia 36% Bacilli 11%

5 I. Clostridi nei digestori anaerobici Identificazioni non coltura dipendente Clostridium thermocellum Clostridium kluyveri Clostridium acetobutylicum attività Cellulolitico idrogeno, ac. grassi Acetato e etanolo idrogeno e ac. butirrico (cellulolitico) Butanolo, etanolo, Idrogeno Clostridium perfringens Acidi grassi, idrogeno, CO 2 Clostridium saccharolyticum Clostridium straminisolvens Clostridium stercorarium Cellulolitico idrogeno, ac. grassi (cellulolitico) Butanolo, etanolo, Idrogeno Acidi grassi, idrogeno Clostridium beijerinckii Acidi grassi, idrogeno, CO 2 Clostridium phytophermentans Acidi grassi, idrogeno, CO 2 Clostridium novyi Clostridium tetani

6 Clostridi responsabili di difetti nei formaggi a lunga stagionatura Genere Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium specie tyrobutyricum butyricum sporogenes beijerinckii perfringens cochlearium septicum disporicum

7 Ricerca dei clostridi nelle matrici alimentari e digestati o Campione matrice alimentare o digestato o Trattato a 80 C per 10 min o Semina su terreno selettivo o Incubazione in anaerobiosi a 37 C o Conta delle UFC o risultati espressi numero di UFC(spore)/grammo

8 Identificazione dei clostridi isolati Isolamento di colonie a differente morfologia Estrazione del DNA Fingerprinting del DNA per la differenziazione e selezione dei ceppi Identificazione tramite sequenziamento del 16S rrna analisi in banca dati

9 Categorie di matrici analizzate Principali matrici In ingresso Liquame bovino Letame bovino Insilato di mais Separato bovino Altre matrici In scala reale Triticale Sorgo Silotriticale Melasso Siero Scarti di caffè Farina di mais Puliture di mais essicatoio Scarto di essicazione mais Melasso di agrumi Sansa di oliva Matrici in uscita Digestato tal quale Digestato Chiarificato Digestato Separato Solido Digestato Stoccaggio

10 Impianti in scala reale Altre matrici alimentari Matrice alimentare Spore/grammo Nr. campioni triticale <10 3 separato bovino 7, sorgo <10 1 silotriticale <10 1 melasso <10 1 siero <10 1 scarti di caffè <10 1 Farina di mais <10 1 Puliture di mais essicatoio <10 1 Scarto di essicazione mais 8, Melasso di agrumi <10 1 Sansa di oliva <10 1

11 Reattori Impianto 6 Impianto 3 Impianto 1 Impianto 5 Impianto 2 Impianto 4 Effluenti bovini Effluenti bovini Effluenti bovini Effluenti bovini Effluenti bovini Effluenti bovini insilati insilati insilati insilati GP PR PR PR GP GP mesofilia mesofilia mesofilia termofilia mesofilia mesofilia

12 spore clostridi (log ufc/g) Impianti scala reale PR GP PR GP PR GP 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 LIQUAME BOVINO LETAME BOVINO INSILATO DI MAIS DIG. TAL QUALE DIG. CHIARIFICATO DIG. S. SOLIDO DIG. STOCCAGGIO 0, Impianti

13 Bilancio spore in mesofilia digestori scala laboratorio Tesi input tot spore output tot spore differenza output tot spore e input tot spore rapporto output_tot / input tot spore Liquame 1,7E+08 a 3,1E+08 1,4E+08 1,70 Liquame + silomais Liquame + silomais + polpe biet 9,7E+07 b 1,6E+08 6,8E+07 1,61 8,8E+07 b 1,6E+08 6,8E+07 1,71 p=0,05

14 Specie isolate dai campioni analizzati nei digestori scala laboratorio in mesofilia C. subterminale 2% C. bifermentas 5% MICRORGANISMO IDENTIFICATI C. perfringens 108 C. sporogenes 32 C. bifermentas 8 C. subterminale 3 C. butyricum 3 C. beijerinckii 1 P. polymyxa 1 C. glycolicum 3 TOTALE 159 C. butyricum P. polymyxa 2% C. beijerinckii 0% 1% C. sporogenes 20% C. glycolicum 2% C. perfringens 68% C. perfringens C. sporogenes C. bifermentas C. subterminale C. butyricum C. beijerinckii P. polymyxa C. glycolicum

15 Bilancio spore in termofilia digestori scala laboratorio Tesi input tot spore output tot spore differenza output_tot spore e input_tot spore rapporto output_tot / input_tot spore Liquame 2,8E+08 a 2,9E+08 1,6E+07 1,26 Liquame + silomais Liquame + silomais + polpe biet 1,6E+08 b 2,5E+08 8,9E+07 1,66 1,5E+08 b 3,6E+08 2,0E+08 2,52 p=0,01

16 Specie isolate dai campioni analizzati nei digestori scala laboratorio in termofilia MICRORGANISMO IDENTIFICATI C. perfringens 70 C. sporogenes 38 C. tyrobutyricum 1 C. sordellii 1 C. bifermentans 1 C. glycolicum 1 Bacillus sp. 1 TOTALE 111 C. sordellii 1% C. tyrobutyricum 1% C. sporogenes 33% C. bifermentans 1% C. glycolicum 1% Bacillus sp. 1% C. perfringens 62% C. perfringens C. sporogenes C. tyrobutyricum C. sordellii C. bifermentans C. glycolicum Bacillus sp.

17 Altre specie di Clostridi identificate Clostridium acetobutylycum 3 Clostridium glycolicum 1 Clostridium metallolevans 2 Clostridium tyrobutyricum 4 Clostridium thiosulfatireducens 1 Clostridium butyricum 7 Clostridium beijerinckii 2 Clostridium sartagoforme 3 Clostridium neonatale 2 25 Specie isolate dai campioni analizzati nei sei impianti in scala reale

18 Conclusioni Impianti scala reale: numero in spore nei digestati piuttosto omogeneo, superiore a 1e10 4 spore/g Confrontando impianti in scala reale area Grana Padano e Parmigiano Reggiano non si evidenziano sostanziali differenze nel contenuto in spore nei digestati in uscita dai reattori I sottoprodotti alimentari non sembrano essere alimenti apportatori di spore Risulta una maggiore biodivesità di specie clostridiche negli impianti in scala reale Negli impianti alimentati senza insilato è dominante il Clostridium perfringens

19 Conclusioni Impianti scala laboratorio Mesofilia e Termofilia: Sia in condizioni di mesofilia che di termofilia il letame è risultato essere la fonte principale di sporigeni seppure con un lieve scarto. Il bilancio delle spore tra le tre tesi non è statisticamente differente Dal bilancio tra spore in ingresso e uscita risulta un leggero incremento nel numero di spore in tutte e tre le tesi. Clostridium perfringens è risultata la specie dominante ed in misura minore è Clostridium sporogenes. C. tyrobutyricum e C. butyricum sono stati identificati occasionalmente.

20 Grazie: Dott. Roberto Tumolo (UCSC) phd. Susanna Ferrari (UCSC) Dott. Lorella Rossi (CRPA) Dott. Paola Vecchia (CRPA)