Aggiornamenti sulle attività svolte recentemente dal NRL Salmonella nell ambito della sorveglianza di S. 4,5,12:i:-

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1 Aggiornamenti sulle attività svolte recentemente dal NRL Salmonella nell ambito della sorveglianza di S. 4,5,12:i:- Lisa Barco

2 Torino, 21 maggio 2014 PROGETTO: Caratterizzazione di isolati di S. Typhimurium (ST) e S. 4,5,12:i:- (VMST) lungo la filiera alimentare 1) Individuare un metodo di identificazione e differenziazione tra i due sierotipi 2) Indagare differenze-similarità tra i due sierotipi 3) Analizzare isolati di VMST che presentano pattern emergenti in Italia e in altri Paesi 4) Identificare le principali fonti di infezione per l uomo attribuibili ai due sierotipi

3 Perché ST e VMST? Graziani et al., 2013 In Italia ST è il primo sierotipo isolato nell uomo a partire dal 2001

4 Perché ST e VMST? Il primo isolamento di VMST dall uomo è del 2003 (1.3%), di seguito la prevalenza di questo sierotipo è progressivamente aumentata, raggiungendo il 39.1% degli isolati nel (Graziani 2013) A partire dal 2009 VMST ha superato S. Enteritidis divenendo il secondo sierotipo nell uomo dopo ST Secondo l EFSA, VMST rappresenta un pericolo per la salute pubblica paragonabile ad alcuni cloni epidemici di ST descritti in passato (EFSA 2010)

5 I ceppi di Salmonella solitamente sono bifasici, ma ci sono anche alcuni sierotipi che esprimono solo uno dei due antigeni flagellari S. Typhimurium (ST) 1,4,[5],12 : i : 1,2 Variante monofasica di S. Typhimurium (VMST) 1,4,[5],12 : i : - Sebbene ST e VMST siano differenti dal punto di vista fenotipico, essi sono strettamente correlati dal punto di vista genetico, come dimostrato utilizzando ad esempio: -DNA microarray (Garaizar et al., 2002; Hauser et al., 2010) -MLST (Garaizar et al., 2002)

6 MECCANISMO DI INVERSIONE DI FASE

7 Obbiettivo 1: Metodo di differenziazione tra ST e VMST Saggio in PCR per la differenziazione dei due sierotipi basato sull amplificazione di un frammento localizzato tra i geni flja e fljb (1kb), specifico di ST e VMST e sulla presenza (ST) assenza (VMST) del gene fljb (EFSA 2010, Barco et al., 2011) 1) S. Typhimurium: 1389 bp (fljb) 1000 bp (flib-flia) 2) S. 4, [5],12:i:- : 1000 bp (flib-flia) 3) Other biphasic strains: 1389 bp (fljb) 250 bp (flib-flia) NC

8 Obbiettivo 1: Metodo di differenziazione tra ST e VMST Per identificare i ceppi di VMST presso l NRL si segue il seguente approccio Metodo Fase Esito Sierotipizzazione tradizionale Identificazione antigene somatico Identificazione antigene flagellare Inversione di fase Agglutinazione antisiero Gr. B Agglutinazione antisiero i Esito negativo PCR Sierotipizzazione Ripeto per altre due volte inversione di fase Amplificazione del solo frammento flja-fljb assenza dell amplificazione del gene fljb Negativo

9 Obbiettivo 1: Metodo di differenziazione tra ST e VMST In letteratura è stato riportato un numero crescente di isolati fenotipicamente tipizzati come VMST, sebbene genotipicamente conservassero il gene fljb (Soyer et al, 2009; Hopkins et al., 2010; Barco et al., 2011, Bugarel et al 2012, 2012b; Prendergast et al., 2013). Questi isolati sono stati definiti come inconsistent variants of S. Typhimurium QUALI POSSONO ESSERE LE RAGIONI DI QUESTO STATO fljb è presente, ma è mutato? Che tipo di mutazione ha subito? Sono presenti gli altri geni dell operone fljab (hin, flia)? Hanno subito mutazioni?

10 Obbiettivo 1: Metodo di differenziazione tra ST e VMST Tra ottobre 2011 e ottobre 2012 l NRL ha identificato 20 isolati classificati come inconsistent variants di S. Typhimurium, per i quali sono stati caratterizzati tutti i geni direttamente coinvolti nell espressione della seconda fase flagellare (flja, fljb e hin) Numero di ceppi flja fljb hin Gruppo 1* 9 x x - Gruppo 2** 5 Mutazione (Ala 46 Thr) x Mutazione (Arg 140 Leu) Gruppo 3*** 6 x x x * Assenza dell invertasi hin che inibisce lo switch tra 1 e 2 fase - l inversione reversibile del promotore del fljb non permette la sua trascrizione ** mutazioni non conservative a carico di flja e hin che possono ostacolare la corretta espressione dei geni *** nessuna anomalia riscontrata??????? Barco et al., 2014

11 Obbiettivo 2: Identificare somiglianze-differenze tra ST e VMST Obbiettivi dello studio 1) Descrivere le caratteristiche dei ceppi appartenenti ai due sierotipi circolanti (analisi descrittiva) 2) Identificare caratteristiche distintive tra i due sierotipi (random forest analysis) Ceppi analizzati: è stato preso in esame un data-set di circa 900 ceppi veterinari (animali alimenti) di ST e VMST isolati nelle regioni del Nord Est nel periodo Il data-set comprendeva - informazioni epidemiologiche: anno di isolamento, tipologia di campione, specie animale, matrice di isolamento - dati fenotipici: sierotipo, profilo di resistenza, fagotipo Metodi: analisi descrittiva random forest analysis

12 Obbiettivo 2: Identificare somiglianze-differenze tra ST e VMST Random Forest (RF) analysis è un metodo di analisi dei dati che si basa su un algoritmo di classificazione che consiste in un set di alberi di decisione random Questa metodologia permette di: - classificare in modo gerarchico le variabili di un dataset - quantificare l importanza delle variabili considerate, identificando quelle che rivestono un ruolo principale per esprimere l outcome d interesse - ottenere una rappresentazione grafica del data set Tale approccio ha trovato applicazione in moltissime discipline diverse Nell ambito dello studio è stato utilizzato per identificare le caratteristiche distintive, tra quelle incluse nel dataset, per differenziare ST e VMST

13 Risultati -Sebbene ST e VMST siano molto simili, VMST manifesta una minore eterogeneità rispetto a ST Torino, 21 maggio 2014 Obbiettivo 2: Identificare somiglianze-differenze tra ST e VMST -VMST è originata recentemente da specifici cloni di ST con i quali continua a condividere molte caratteristiche - Dalla RF analysis è emerso che, tra le variabili incluse nel data-set, il fagotipo risulta quella più informativa per differenziare ST e VMST

14 Obbiettivo 3: Analizzare isolati di VMST con specifici profili Ceppi di VMST-DT R-type ASSuT sono stati descritti in diversi paesi europei e questo è diventato uno dei principali cloni di S. Typhimurium monofasica in Europa. Isolati con profilo di PFGE STYMXB.0131 sono stati responsabili di due gravi episodi di salmonellosi in Lussemburgo nel 2006 (Mossong et al., 2007) Studio Ceppi: VMST, ASSuT, DT193 STYMXB.0131 isolati in nord Italia nell ambito di due outbrek non epidemiogicamente correlati Obbiettivi: - confermare gli outbreak - indagare se, sebbene non epidemiologicamente correlati, i due outbreak fossero causati dallo stesso clone Analisi: PFGE (XbaI, BlnI, SpeI), MLVA, profilo di delezione dei geni responsabili dell espressione del 2 antigene flagellare

15 Obbiettivo 3: Analizzare isolati di VMST con specifici profili Risultati Il clone di VMST-DT R-type ASSuT STYMXB.0131 circola anche in Italia, come in altri paesi europei e ha causato due distinti outbreak XbaI PFGE non ècaratterizzata da sufficiente potere discriminante per mettere in evidenza la diversitàtra i ceppi correlati ai due outbreak isolati dei due outbreak presentano il medesimo pulsotipo Al contrario, BlnI PFGE and MLVA hanno permesso di mettere in evidenza differenze tra i due outbreak. L elevato potere discriminante di tali metodi ha comunque permesso di identificare differenze anche tra i ceppi nell ambito dello stesso outbreak I metodi di subtipizzazione utilizzati hanno dimostrato un adeguato potere discriminante, che ha permesso di differenziare ceppi epidemiologicamente non correlati e hanno dimostrato adeguata concordanza epidemiologica supportando la valenza del loro impiego nell ambito di analisi di outbreak

16 Obbiettivo 3: Analizzare isolati di VMST con specifici profili Torino, 21 maggio 2014 B A

17 Obbiettivo 3: Analizzare isolati di VMST con specifici profili B A

18 Obbiettivo 3: Analizzare isolati di VMST con specifici profili DT 7a è un fagotipo piuttosto raro che differisce da DT 7 per una marcata reazione dal fago 29 Studio Ceppi VMST DT 7a isolati nell ambito di un outbreak da persone che hanno partecipato d un banchetto di nozze (16) e da campioni di porchetta (5) consumata nello stesso banchetto isolati di ST DT7a ottenuti dai suini dell allevamento di provenienza degli animali produttori della porchetta (3) 50 ceppi di ST e VMST DT7a non epidemiologicamente correlati Obbiettivi: - confermare l outbreak - indagare la variabilità di isolati di DT7a dei due sierotipi analizzando campioni umani, veterinari e ambientali di DT7a Analisi: PFGE (XbaI), MLVA

19 Obbiettivo 3: Analizzare isolati di VMST con specifici profili Tutti i ceppi relativi all outbreak (ST e VMST) presentano lo stesso profilo di PFGE (STYMXB.0079) Lo stesso profilo complessivamente si ritrova in più dell 80% dei ceppi analizzati I ceppi di ST e VMST DT 7a circolanti a livello nazionale sono altamente clonali

20 Obbiettivo 3: Analizzare isolati di VMST con specifici profili - La clonalità del fagotipo è dimostrata anche dall analisi con MLVA: tutti i ceppi analizzati sono classificati in un unico cluster - MLVA, a differenza della PFGE, ha permesso di ottenere una differenziazione superiore dei profili degli isolati - Tuttavia, con l MLVA non è stato possibile identificare un profilo unico per i ceppi dell outbreak il profilo è condiviso con altri ceppi epidemiologicamente non correlati

21 Obbiettivo 4: Identificare le source di infezione La source attribution di casi di malattia attribuibili a microrganismi a trasmissione alimentare rappresenta un prezioso strumento per identificare efficaci misure d intervento nell ambito della sanità pubblica Sono stati descritti numerosi metodi per identificare le potenziali fonti delle infezioni a trasmissione alimentare La metodologia della subtipizzazione microbica rappresenta uno dei metodi più comunemente impiegati per questo specifico scopo Il principio alla base di questo approccio è il confronto tra i profili di tipizzazione (subtypes) degli isolati responsabili di infezione nell uomo e la distribuzione di questi subtipi nelle potenziali fonti (Pires et al., 2009) La metodologia della microbial subtyping source attribution si basa su metodi di tipizzazione di laboratorio al fine di identificare il livello di sovrapposizione tra i subtypes identificati nei ceppi umani e quelli nelle potenziali fonti

22 Obbiettivo 4: Identificare le source di infezione In tale ambito è stato condotto uno studio della letteratura al fine di descrivere: - lo stato dell arte relativamente alla source attribution di Salmonella attraverso la metodologia del microbial subtyping - descrivere i principali modelli utilizzati per analizzare i dati di microbial subtyping e identificare le fonti d infezione - il potenziale impiego nell ambito di studi di source attribution di Salmonella dei metodi di tipizzazione più comunemente utilizzati nei laboratori coinvolti nella sorveglianza di Salmonella

23 Obbiettivo 4: Identificare le source di infezione Metodi di tipizzazione Sierotipizzazione Utilizzo per SSA Sì Applicabilità per SSA Note Il metodo piùcomunemente utilizzato Utile se impiegato assieme ad altri metodi Fagotipizzazione Sì Metodo utile per avere una prima indicazione del livello di correlazione tra isolati di ST e SE Resistenza antimicrobica Sì Instabilitàdei target indagati PFGE No Gold standard protocollo ben standardizzato datbase molto ricchi MLVA No Potenzialmente rappresenta un metodo molto promettente protocolli seirotipi specifici protocolli standardizzati solo per SE e ST Profilo plasmidico No Instabilitàdei target indagati Ribotipizzazione No Complessitàdel metodo manuale alti costi della metodica automatizzata dati piuttosto variabili in merito al potere discriminante MLST No Limitato potere discriminante se utilizzato per caratterizzare isolati del medesimo sierotipo

24 I due studi di source attribution condotti fino ad ora su dati italiani hanno evidenziato che il suino rappresenta la principale fonte di Salmonellosi Pires et al. (2011) hanno messo in evidenza la seguente situazione: Italia Europa Broiler 2.3% 3.4% Suini 73.2% 26.9% Tacchini 5.3% 4.0% Galline ovaiole 2.1% 43.8% Obbiettivo 4: Identificare le source di infezione Mughini Gras et al., (2013) hanno confermato la seguente distribuzione delle source di Salmonella nel periodo in Italia Gallus gallus 32%-33% Suini 44%-47% Tacchini 2%-4% Ruminanti 0-3%

25 Obbiettivo 4: Identificare le source di infezione L pplicazione della source attribution basata sul microbial subtyping richiede: - Una collezione di ceppi isolati dall uomo e dalle potenziali fonti oggetto di indagine - Metodi di subtipizzazione adeguati che permettano di ottenere informazioni comparabili sulla distribuzione dei subtypes nell uomo e nelle potenziali fonti - Un modello per identificare il livello di sovrapposizione tra i subtypes identificati nell uomo e nelle potenziali sources - Isolati nazionali di ST e VMST di origine umana e veterinaria (pollo, tacchino, suino e bovino) Dati di fagotipizzazione e MLVA - Analisi descrittiva minimum spanning tree modello matematico

26 dati preliminari.

27 Obbiettivo 4: Identificare le source di infezione -La combinazione di sierotipizzazionbe tradizionale e un protocollo in PCR che indaghi la presenza del gene fljb sono strumenti efficaci per identificare gli isolati di VMST. Tuttavia, in alcuni casi specifici, per ottenere una definiva valutazione dello status bifasica-monofasico dei ceppi in esame potrebbe essere utile indagare anche gli altri geni dell operone fljab, direttamente coinvolti nell espressione della seconda fase flagellare -VMST sembra originare da specifici cloni di ST, con il quale conserva molte caratteristiche comuni. VMST è caratterizzata da una variabilità molto più limitata rispetto al sierotipo d origine -In Italia, come in Europa, circola il clone di VMST DT193 ASSuT pulsotipo 131. Inoltre, sono stati descritti altri cloni emergenti, come il DT7a, che fino ad ora è stato raramente descritto negli altri paesi europei -La source attribution basata sul microbial subtyping è un valido strumento per identificare le principali fonti d infezione dell uomo attribuibile a tali sierotipi -Il suino sembra rivestire un ruolo importante nella trasmissione di ST e VMST all uomo

28 Grazie per l attenzione