Lezioni di Microbiologia

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1 Lezioni di Microbiologia Informazioni: Prof Eugenio A. Debbia Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche DISC-Sezione di Microbiologia, Viale Benedetto XV, 6, Genova Tel: eugenio.debbia@unige.it W. Churchill 1

2 Testi consigliati Antonelli et al. Principi di Microbiologia Medica II ed. CEA 2017 La Placa Microbiologia Medica. Edises 2014 Jawetz et al. Microbiologia Medica. Piccin 2017 Wessner et al. Microbiologia. CEA, 2015 Brock- 3 Biologia dei microorganismi Pearson 2016 Dehò Biologia dei Microrganismi CEA 2016 Sherris et al. Microbiologia Medica.EMSI 2017 Murray et al. Microbiologia Medica EMSI Mims et al. Microbiologia clinica EMSI Harvey et al. Le basi della Microbiologia (con approfondimenti clinici) Zanichelli Microbiologia Clinica Esculapio

3 Con il microscopio si incomincia a pensare all invisibile E ciò permette la scoperta dei microrganismi 3

4 Olanda 1674 Anton van Leeuwenhoek 4

5 Il microscopio a lente singola di Leeuwenhoek 5

6 Teoria del germe Germania 1840 Friedrich Henle I microorganismi sono responsabili di MALATTIA nell uomo 6

7 Vienna I.F. Semmelweis Tentò di dimostrare che i germi dalla sala di anatomia giungevano alla sala parto, tramite i medici e gli studenti Suggerì la disinfezione delle mani prima di intervenire sulla puerpera. Non fu mai ascoltato 7

8 Francia e Germania viene dimostrato che alcuni microorganismi sono i responsabili di carbonchio, rabbia, peste, colera e tubercolosi Pasteur Koch 8

9 MICROBIOLOGIA Batteri Virus Miceti Protozoi e altri parassiti 9

10 Microrganismi Organismi unicellulari Eucarioti Nucleo evidente con membrana Batteri Nucleo non evidente Alghe Protozoi Miceti Eubatteri Clamidie Spirochete Rickettsie 10 Micoplasmi

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13 Only a minute fraction of the Earth s bacteria have been identified 13

14 Yim et al. Phil. Trans. R. Soc. B (2007) 362,

15 Enterobacterales (Enterobacteriaceae)

16 BATTERI dimensioni Cellula Eucariotica Cellula procariotica Nucleo 16

17 STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICA a) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA Citoplasma Nucleoide Parete cellulare Ribosomi plasmide Membrana citoplasmatica Membrana citoplasmatica Reticolo endoplasmatico Ribosomi Nucleo Nucleolo Membrana nucleare Citoplasma Mitocondrio Cloroplasto 17

18 Composizione: H 2 O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S e macromolecole organiche localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica Membrana Flagello Parete Citoplasma Proteine Nucleoide Ribosomi Polisaccaridi Granuli D accumulo Acidi nucleici Lipidi 18

19 1. Cocchi, 2. Diplococchi, 3. Streptococchi, 4. Stafilococchi 5.Tetradi di cocchi, 6. Coccobacilli 7. Clostridi, 8. Bastoncini, 9. Carbonchi, 10. Fusobatteri 11. Vibrioni, 12. Spirilli 13. Borrelie, 14. Treponemi 15. Leptospira 19

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21 COLORAZIONE semplice DELLE CELLULE PER L OSSERVAZIONE MICROSCOPICA Strisciare la coltura su un vetrino Formando uno strato sottile Asciugare all aria Ricoprire il vetrino con colorante Risciacquare e asciugare Vetrino 100x Olio Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione Porre una goccia d olio (da immersione) sul vetrino; osservare con l obiettivo 100x 21

22 Hans Joachim Christian Gram Il suo nome è legato all'importante scoperta della colorazione di Gram da lui effettuata nel 1884 a Berlino: mentre esaminava del tessuto polmonare di pazienti deceduti per polmonite notò che le cellule batteriche si coloravano più intensamente con cristal violetto e soluzione di lugol Tale colorazione è tutt'oggi essenziale nella classificazione dei batteri 22

23 COLORAZIONE DI GRAM (complessa o differenziale) Fase 1 Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per 2-3 minuti Tutte le cellule si coloreranno di viola Fase 2 Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto Fase 3 Fase 4 G- Le cellule rimarranno viola Decolorare in alcool per circa 1-2 minuti Le cellule Gram-positive risulteranno viola, quelle Gram-negative incolori Colorare con fucsina per 1-2 minuti Le cellule Gram-positive (G+) risulteranno viola, quelle Gram-negative 23 (G-) avranno una tonalità da rosa a rosso G+

24 La colorazione di Gram Un Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo Cocchi Gram positivi Cocchi Gram positivi Bastoncelli Gram negativi 24 misti a cocchi Gram positivi

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26 Colorazione di Ziehl-Neelsen (bacilli alcool-acido resistenti) Fucsina fenicata a caldo 5 m Acido solforico (20%) 30 Alcool 30 Blu di metilene 1 m 26

27 Batteri alcool-acido resistenti: rossi su fondo blu azzurro 27

28 Osservazione a contrasto di fase Un batterio (L. sakei), 400x Un lievito (S. cerevisiae), 400x Una muffa (G. candidum), 400x Un attinomicete 400x Un lievito (Y. lipolytica) 400x Una muffa (R. oligosporus), x

29 Osservazione in campo scuro 29

30 Anatomia della cellula batterica Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano: a) glicocalice o slime b) capsula c) flagelli, pili o fimbrie d) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra grampositivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram) e) membrana citoplasmatica f) mesosomi g) citoplasma cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi. ribosomi corpi inclusi 30

31 Glicocalice Materiale stratificato intorno alla cellula Strato S: distribuzione regolare (cristallina) di sub-unità glicoproteiche piuttosto gommoso Capsula: matrice fibrosa costituita da polimeri di carboidrati. Più comsistente. Possono intrappolare acqua e gli antibiotici senza dare impermeabilità 31

32 FIGURA Le capsule forniscono protezione per le cellule. 32

33 Moto browniano Movimento attivo Flagelli Flagello: unico filamento sprovvisto di membrana flagellina- (diversa in specie batteriche diverse) Chemiotassi positiva e negativa 33

34 Filamento Flagellina STRUTTURA DI UN FLAGELLO BATTERICO Membrana Esterna LPS Uncino Anello L Richiede molta energia ATP Anello P Periplasma Membrana citoplasmatica Proteina Mot Peptidoglicano Anello MS Proteina Fli invertitore del motore 34

35 Bacteria are innumerable live in organized communities can communicate

36 Are they «intelligent»?

37 Intelligence in animals Ability to form association links between events or objects of which it has had noprevious experience Oxford Dictionary of Science 2000 Intelligence in living beings Adaptation to new situations Robert, Dictionnaire de la Langue Française 2002

38 Swimm Tumble t s t s s s t

39 Swimming for food in E. coli Direct swim to the source, up to a certain concentration. Then tumbling/swimming again

40 FIGURA La mobilità indirizzata permette ai batteri di rispondere a segnali chimici esterni. 40

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42 FIGURA Proteus mirabilis iperflagellato. 42

43 Pili o Fimbrie Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli, sono costituite da una proteina detta pilina che gioca un ruolo fondamentale nel processo di adesione dei batteri ad altre cellule (patogenicità). Spesso sono codificati dai plasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie per l'adesività sia come pilo detto sessuale per creare un ponte citoplasmatico tra due cellule batteriche nei processi di coniugazione. 43

44 Afimbrial adhesin Type I fimbriae Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Curli 44

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46 La Parete (Cell-Wall) E lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna e lipolisaccaride (LPS) Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva 46

47 RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DELLA PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI Gram positivi Gram negativi Peptidoglicano Peptidoglicano Membrana citoplasmatica Membrana Periplasma Membrana esterna Lipopolisaccaridi e proteine 47

48 PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI Proteina associata alla parete Acido teicoico Acido lipoteicoico Peptidoglicano Membrana citoplasmatica 48

49 BATTERIO GRAM NEGATIVO Membrana esterna Membrana citoplasmatica Peptidoglicano 49

50 PARETE CELLULARE DEI GRAM NEGATIVI Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico Esterno Membrana esterna Porina Lipide A Lipopolisaccaride (LPS) Periplasma Peptidoglicano Lipoproteina Fosfolipide Membrana citoplasmastica Interno 50

52 Enzimi attivi sulla parete Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e mucosa nasale, Autolisine, contenute negli stessi batteri: glicosidasi, amidasi e peptidasi (enzimi che intervengono sulla sintesi di parete). 52

53 Membrana citoplasmatica Costituita da fosfolipidi e proteine, non contiene steroli (negli eucarioti) presenta invaginazioni: i mesosomi importanti nella formazione del setto vi è attaccato il DNA in certe specie su altri mesosomi vi è un sistema di trasporto attivo (fotosintesi, azoto) 53

54 Doppio strato fosfolipidico della Membrana Citoplasmatica batterica Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++) Regione idrofila Regione idrofobica Acidi grassi H 2 O Fosfato Glicerolo 54

55 STRUTTURA DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Fosfolipidi Esterno Gruppi idrofilici Gruppi idrofobici Interno Proteine integrali di membrana Molecola fosfolipidica 55

56 Membrana citoplasmatica Funzioni permeabilità selettiva e trasporto, trasporto elettroni e fosforilasi ossidativa escrezione enzimi idrolitici contiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene recettori e proteine necessarie alla chemiotassi Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuto alla grande attività per la crescita batterica 56

57 FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Barriera di permeabilità Previene dispersioni e funziona come centro di transito per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula Sito di ancoraggio Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle vie biosintetiche e nella chemiotassi Produzione dell energia Enzimi della catena respiratoria Mesosomi? 57

58 Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso di H+ all esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellula genera ATP. 58

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60 Lo spazio periplasmico E compreso tra la membrana interna e quella esterna, è riempito da un gel formato da peptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sono inoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteine leganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasi alcalina che reagendo con substrati li rendono trasportabili all interno. Molti di questi composti intervengono nella regolazione della pressione osmotica, per esempio, cellule che crescono in ambiente ipotonico aumentano la sintesi di oligosaccaridi. 60

61 LPS, Endotossina: LIPIDE A Ripetizione di unità diverse nelle diverse specie Contribuisce alla tossicità del Lipide A influenzandone l idrosolubilità e la struttura Presenza costante di alcuni zuccheri particolari come l acido cheto-deossioctonico (KDO) e un eptoso rappresentato in genere da L-glicero-D-mannoeptoso Dimero di N acetil glucosamina fosforilata ed esterificata con acidi grassi saturi La struttura del lipide A è molto conservata; in particolare, è praticamente identica in tutte le Enterobacteriaceae 61

62 Struttura UNITA BASALE N-acetilglucosamina (G) Acido N-acetilmuramico (M) Gruppo N-acetile Legami peptidici L-alanina Legame sensibile Al lisozima Acido D-glutammico Acido Meso diaminopimelico D-alanina 62

63 FIGURA I legami crociati tra le catene peptidiche danno resistenza al peptidoglicano. 63

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65 Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Sono NOTI SEI (sette) SISTEMI di esportazione di molecole effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite. L energia necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella faccia interna della membrana citoplasmica. Alla secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle chaperonine che legano il substrato, ne impediscono la degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari sistemi 65

66 Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell ambiente attraverso una porina Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all esterno TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente) Tipo V: la proteina è portata all esterno mediante se stessa (autotrasporto) Tipo VI: la proteina è direttamente iniettata nella cellula bersaglio (eu-procariota) mediante meccanismo attivo (coda di fago) Tipo VII: (MT) la proteina è immessa fuori dalla membrana interna e portata all esterno attraverso un meccanismo non ancora noto 66

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68 Fig. 4. Model for type VII secretion. Both Esx and PE/PPE proteins are exported as dimers by the T7S secretion machinery. Substrate recognition occurs via a C-terminal secretion motif on one of the dimer subunits (indicated by a red box). The cytosolic component EspG specifically recognizes PE/PPE proteins and possibly targets these substrates to the putative membrane channel that consists of EccB, EccC, EccD and EccE. The three nucleotide binding domains of EccC are likely involved in energizing translocation of substrates through this channel. In this model, T7S is a two-step process, in which the channel in the outer membrane refers to a hypothetical, so far unidentified pore. 68

69 Sistemi di secrezione (Gram-positivi) Le proteine elaborate nel citoplasma sono trasferite a livello di membrana citoplasmatica qui alcune proteine vettore (chaperone) mediano il passaggio attraverso la parete durante il quale la proteina si trasforma nella versione funzionale con meccanismo non noto 70

70 FUNZIONI DEL CROMOSOMA Il cromosoma consiste di circa 3,8-4,5 milioni di basi appaiate, esso è diviso funzionalmente in segmenti, ciascuno dei quali determina una sequenza di aminoacidi e quindi la struttura di una proteina. Queste proteine, enzimi, componenti della membrana ecc. costituiscono le proprietà del microrganismo. Un segmento di DNA che determina un prodotto funzionale è chiamato gene. Gli eventi attraverso i quali una sequenza di nucleotidi di un gene determina una proteina sono i seguenti: 71

71 L enzima RNApolimerasi, usando il DNA come modello, forma una singola catena poliribonucleotidica chiamata RNA messaggero (mrna). Questo processo è noto come trascrizione. Questo mrna ha una sequenza nucleotidica che è complementare con una delle catene della doppia elica di DNA. 72

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74 Gli aminoacidi sono attivati enzimaticamente e trasferiti ad una molecola particolare di RNA chiamato RNA transfer (trna). Questi trna hanno una struttura che presenta ad una estremità una tripletta di basi sul mrna, ed all altra estremità hanno legato l aminoacido corrispondente. La tripletta posta sul mrna si chiama codon. 75

75 mrna ed il trna vanno insieme sulla superficie del ribosoma. Il trna trova la tripletta complementare sul mrna. Il ribosoma si muove sul mrna e la sintesi procede. Il processo è noto come traduzione. 76

76 PLASMIDI I plasmidi sono piccoli elementi di DNA circolare che si replicano autonomamente (replicon, fattori R, elementi genetici extracromosomici, geni aggiunti, episomi, profagi non integrati). Codificano per funzioni non indispensabili per la cellula, ma che possono essere fondamentali in particolari ambienti. Diffusione della resistenza agli antibiotici 77

77 Plasmidi o Fattori R Scoperti in Giappone nel 1955 Coniugativi e non Codificano resistenza per uno o più antibiotici Possono quindi essere selezionati da uno qualsiasi degli antibiotici inefficaci Possono codificare anche resistenza ai metalli pesanti Spesso codificano per enzimi inattivanti

78 Origine dei Fattori R Esistevano prima dell era antibiotica Veicolati spesso da microorganismi produttori di antibiotici e/o occupanti le stesse nicchie dei germi produttori di antibiotici Ceppi produttori di antibiotici sintetizzano enzimi simili a quelli specificati dai Fattori R

79 PLASMIDI Elementi genetici extracromosomici DNA circolare, doppia elica replicazione autonoma ( da 1.5 a 400 Kb 1-1,5 Kb = 1 gene 4500 Kb = cromosoma 1 Mdal = 1 milione dalt = 3 Kb 1ųm = 2 Mdal 80

80 PLASMIDI Classificazione Fenotipo Numero di copie Peso molecolare Frammenti di restrizione Gruppo di compatibilità Genetico e biochimico Fattori R coniugativi e non Amplificazione dei geni Batteriocine 81

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83 ENDOSPORE Diversi microorganismi (gram+), quando le condizioni ambientali diventano sfavorevoli, sono in grado di formare endospore (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina ecc.) che poi sono liberate nell ambiente. La spora è una cellula in fase di riposo, altamente resistente al calore, all essiccamento, e agenti chimici, quando le condizioni risultano nuovamente favorevoli la spora germina e produce una cellula vegetativa. 84

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85 Sporulazione La sporulazione comporta la produzione di nuove strutture, enzimi e metaboliti. Circa 200 geni strutturali sono attivati durante il processo. Inizia con una invaginazione della MC sino a racchiudere il nucleo. La prespora si trova così racchiusa tra due membrane capaci di sintetizzare parete nella parte compresa tra loro. La prima struttura che appare si chiama corteccia, con internamente la parete della spora, all esterno delle due membrane si costituisce la tunica sporale (mantello), ed oltre la tunica l esosporio. Tutto richiede una gran quantità di calcio e sintesi di ac. dipicolinico. All interno ove è contenuto il nucleo (core), gli enzimi vegetativi sono degradati e rimpiazzati da costituenti della spora. 86

86 STADI DI FORMAZIONE DELL ENDOSPORA 7-10h Cellula vegetativa Stadio 0 Stadio 1 Parete Membrana citoplasmatica DNA Stadio 7 Esosporio Core Spora libera Stadio 6 Stadio 2 Spora in via di sviluppo Strati corticali Stadio 5 Membrana Core esterna Nucleo Stadio 3 della spora centrale Stadio 4 Disidratazione Membrana interna della spora 87 Esosporio Corteccia iniziale

87 Proprietà Core: contiene il nucleo, tutti i componenti della sintesi proteica ed un sistema per generare energia basato sulla glicolisi. L energia per la germinazione è conservata in 3-fosfoglicerato piuttosto che ATP. La resistenza è dovuta in parte allo stato disidratato e alla presenza nel core di dipicolinato di calcio (intermedio nella sintesi della lisina) 88

88 Proprietà Parete della spora E lo strato più interno di parete che circonda la MI della spora, composta di peptidoglicano (diventerà parete nella cellula quando germinerà) 89

89 Proprietà Cortex E lo strato più spesso dell involucro della spora, contiene peptidoglicano ma con meno legami crociati di quello usuale. Sensibile al lisozima, la sua autolisi è importante durante la germinazione. 90

90 Proprietà Mantello E composto da proteine di tipo cheratinoso aventi molti legami disolfuro. Impermeabile agli agenti chimici. 91

91 Proprietà Esosporio Lipoproteina contenente alcuni carboidrati. 92

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93 Fisiologia della spora Nessun consumo di O 2 Attività enzimatiche assenti Assenza di sintesi macromolecolari Resistenti agli UV e all essiccazione Termoresistenza: stabilità proteine (particolare stabilizzazione della struttura 2 aria e 3 aria ), Ca, acido dipicolinico problema sterilizzazione Possono sopravvivere per decine di anni 94

94 GERMINAZIONE Avviene in tre stadi: attivazione, iniziazione e crescita. Attivazione Anche se posta in ambienti favorevoli la spora non germina se non vi è danno al mantello: calore, abrasione, acidità e composti contenenti gruppi sulfidrici liberi. Iniziazione Una volta attivata la spora, la germinazione avviene se certi effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questo mette in azione l autolisina che degrada il cortex. E assunta acqua, è liberato il dipicolinato di calcio e sono degradati gli altri costituenti della spora. Crescita Si osserva un rigonfiamento all interno (core) e quindi sintesi di nuova parete su quella già presente (parete della spora) con successiva divisione cellulare. 95

95 DIFFERENZE PRINCIPALI TRA ENDOSPORA E CELLULA ORIGINARIA Morfologia e dimensioni Composizione Resistenza agenti chimici e fisici Attività metaboliche Batteri non sporigeni Sporigeni C. botulinum C. tetani Clostridi gangrena gassosa Resistenza Bollitura 330 min 90 min 30 min Inattivazione 80 C, 5-10 min Vapor acqueo 20 min, 121 C, 1 atmosfera Calore secco 90 min, 170 C 96