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1 Il funzionamento delle informazioni Dopo che fu definitivamente dimostrato l effettivo ruolo del DNA, la prima cosa da chiarire fu come esso potesse codificare le informazioni. La parte variabile del DNA è costituita dalle quattro basi azotate, quindi si può supporre che sia la loro successione, o meglio la successione dei nucleotidi, a codificare le informazioni. Non dobbiamo pensare che la limitazione a sole quattro variabili condizioni la quantità di informazioni: basti pensare che l enorme quantità di dati gestiti da un computer è codificata da due soli valori possibili: 0 e 1. Infatti non è tanto importante il numero delle singole varianti, ma le loro combinazioni. Così nel linguaggio, per esempio, le 21 lettere sono variamente organizzate tra loro: più lettere formano una parola, più parole una frase, più frasi un periodo, più periodi un paragrafo e così via: non sono le singole lettere a fornire le informazioni, ma la loro combinazione. Nel linguaggio la parola costituisce la cosiddetta unità minima di informazione, quella al di sotto della quale non si ha significato. Ma qual è il suo corrispondente sul DNA? In altri termini, di quanti nucleotidi è composta una parola sul DNA? Per rispondere a questa domanda bisognerebbe prima sapere a che cosa servono le informazioni. Nel 1958 i genetisti americani George Beadle ed Edward Tatum ipotizzarono che l espressione di un gene potesse avvenire tramite un enzima. Per dimostrarlo utilizzarono la muffa del pane Neurospora crassa. Fecero crescere la muffa su un terreno di coltura minimo dal punto di vista nutrizionale, cioè contenente soltanto zucchero, sali minerali e una vitamina. In questo terreno Neurospora è in grado di crescere normalmente perché possiede enzimi capaci di fabbricare tutto ciò di cui ha bisogno. Beadle e Tatum, utilizzando i raggi X, riuscirono ad ottenere alcuni mutanti di Neurospora che necessitano dell aggiunta di diversi composti al terreno minimo. Poiché era noto che i raggi X provocano alterazioni nel DNA, i due ricercatori dimostrarono che in ogni mutante si erano danneggiate le informazioni necessarie per la produzione di uno specifico enzima. Grazie a questo esperimento i biologi si resero conto che le proteine non erano poi del tutto escluse dal flusso di informazioni, perché il DNA non controlla direttamente le caratteristiche dell organismo, ma affida il compito alle

2 2 Il funzionamento delle informazioni proteine: tutte le funzioni e le strutture cellulari sono a carico delle proteine, persino la loro produzione dipende da altre proteine. Una proteina è costituita da una successione di amminoacidi e perché funzioni correttamente occorre che tutti siano al posto giusto, inseriti secondo un ordine non casuale; spesso, infatti, basta un solo amminoacido sbagliato perché la proteina non funzioni più correttamente. Per esempio nell emoglobina il cambiamento di solo uno degli oltre 500 amminoacidi che la costituiscono può esser sufficiente a renderla non più funzionante 1. Si può allora capire come non sia possibile, per costruire una proteina funzionante, montare gli amminoacidi a caso con la speranza di azzeccare la combinazione giusta. Supponiamo, per esempio, di dover costruire una proteina di soli 10 amminoacidi che, come si sa, possono essere scelti tra 20 tipi diversi: se questi dovessero essere ordinati a caso si avrebbero ben possibilità (più di miliardi!), veramente troppe per poter essere provate tutte nella speranza di riuscire a trovare quella giusta (e la quasi totalità delle proteine hanno ben più di 10 amminoacidi!). Non resta allora che ricorrere ad un progetto, ovvero ad un piano di costruzione cui riferirsi. Infatti, solo seguendo delle istruzioni per così dire di montaggio, la cellula riesce a fabbricare proteine funzionanti senza sprecare enormi quantità di tempo e di energia; in mancanza di tali informazioni la cellula non potrebbe praticamente sintetizzare nessuna proteina utile. Ecco allora la funzione del DNA: fornire le informazioni necessarie alla corretta costruzione di una proteina. Poiché le informazioni del DNA servono alla produzione delle proteine, l unità minima di informazione deve corrispondere ad un amminoacido: in questo modo la successione dei nucleotidi potrebbe corrispondere alla successione degli amminoacidi. Però gli amminoacidi da codificare sono 20, mentre i nucleotidi sono solo 4. Di conseguenza non si può avere una corrispondenza di 1 a 1 (un singolo nucleotide che corrisponde ad un singolo amminoacido), se così fosse potremmo costruire proteine con soli 4 amminoacidi. Proviamo allora a considerare i nucleotidi a coppie (due nucleotidi consecutivi determinano un singolo amminoacido). Neppure in questo caso le cose possono funzionare perché con 4 nucleotidi si formano solo 16 (4 2 ) coppie differenti. Se ne conclude allora che il numero minimo di nucleotidi necessari per codificare un singolo amminoacido è tre: infatti, con tre di essi è possibile comporre ben 64 (4 3 ) diverse triplette, che sono molte più di quante ne occorrono. La tripletta, o codone, è l unità minima di informazione e il tratto di DNA che contiene le informazioni complete per la costruzione di una proteina è detto gene. L intero DNA è dunque una successione di geni che codificano per proteine di vario tipo. Un gene è un tratto di DNA che contiene le informazioni necessarie per costruire correttamente una proteina completa. I geni esplicano la loro attività attraverso le proteine e, tra queste, le più indicate all inizio sembravano essere le proteine a carattere funzionale, gli enzimi. Prendiamo, per esempio, il gene che controlla il colore del fiore nelle piante: esso funziona in modo da determinare la produzione di un enzima in grado di produrre un pigmento colorato. Questo concetto fu efficacemente sintetizzato nell espressione «un gene, un enzima». Ben presto però ci si rese conto che i geni dovevano dirigere non solo la sintesi degli enzimi, ma anche quella delle proteine strutturali. Per comprendere anche queste ultime, l espressione venne allora modificata in «un gene, una proteina» (o meglio una catena polipeptidica, perché alcune proteine sono costituite da più sequenze di amminoacidi ciascuna delle quali codificata da uno specifico gene). Oggi sappiamo che neppure questa affermazione va bene, poiché si conoscono molti geni che non determinano alcuna proteina. LA SINTESI DELLE PROTEINE La costruzione delle proteine non avviene nel nucleo della cellula, ma nel citoplasma, in che modo, allora, l informazione passa dal nucleo al citoplasma? E come può la cellula individuare la sequenza di nucleotidi alla quale far corrispondere gli amminoacidi di una proteina? Per rispondere alla prima domanda Francis Crick, uno degli scopritori della struttura del DNA, propose l ipotesi del messaggero. Egli suppose che dal DNA si formasse una copia complementare di RNA, il cosiddetto RNA messaggero o mrna. Questo poi si 1. È il caso della malattia detta anemia falciforme, così chiamata perché i globuli rossi con l emoglobina difettosa assumono una forma a falce e si rompono. SINTESI PROTEICA.DOCX A. Belli

3 Il funzionamento delle informazioni 3 sposterebbe dal nucleo al citoplasma dove avviene la sintesi delle proteine. Il processo con cui si forma questo mrna si chiama trascrizione. L ipotesi di Crick fu subito messa alla prova e venne ampiamente confermata: ogni sequenza di un gene si esprime come sequenza di RNA. Poi, per spiegare in che modo una sequenza di nucleotidi si possa trasformare nella sequenza di amminoacidi, lo stesso Crick suggerì l ipotesi dell adattatore: una molecola provvista di due regioni, una capace di legarsi ad un determinato amminoacido e l altra capace di riconoscere una specifica sequenza di nucleotidi. Ben presto tali molecole adattatrici furono trovate; si tratta di un RNA noto come RNA transfer, o trna. Attraverso il trna si è dunque in grado di tradurre il DNA in proteine, per questo il processo è chiamato traduzione. La sintesi proteica si realizza attraverso due principali meccanismi: la trascrizione e la traduzione: si inizia da un mrna prodotto a partire dal DNA (trascrizione) che poi, attraverso la traduzione, viene utilizzato per la costruzione di una proteina. La trascrizione La trascrizione consiste nel passaggio delle informazioni dal DNA all RNA. Naturalmente non è necessario copiare tutto il DNA: è sufficiente trascrivere solo il gene per la proteina che interessa in quel momento. Per motivi probabilmente legati all evoluzione, le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte sotto forma di RNA, più precisamente RNA messaggero o mrna. L RNA messaggero è la copia del DNA, quella che serve per la sintesi delle proteine. La trascrizione viene eseguita da un enzima, RNA polimerasi, e può essere suddivisa in tre stadi distinti: inizio, allungamento e terminazione. Il primo stadio, che dà inizio alla trascrizione, richiede un promotore, ovvero una speciale sequenza di DNA alla quale si lega la RNA polimerasi. Per ogni gene c è almeno un promotore, ma non tutti i promotori sono uguali 2. I promotori sono importanti sequenze di controllo che dicono all RNA polimerasi tre cose: da dove far partire la trascrizione, quale filamento trascrivere e in quale direzione procedere. Il promotore possiede due regioni: la sequenza di riconoscimento, in corrispondenza del quale si lega l RNA polimerasi, e il TATA box (così denominato perché ricco di coppie T-A che facilitano l apertura del DNA), la regione da cui il DNA comincia ad aprirsi per dare inizio alla trascrizione. Le due regioni non sono necessariamente adiacenti. Negli eucarioti l RNA polimerasi si lega al promotore solo dopo che si sono posizionate varie proteine dette fattori di trascrizione. Il primo fattore, detto TBP (TATA box Binding Protein), si lega al TATA box, inducendo un cambiamento di forma del DNA, dopodiché si legano in sequenza tutti gli altri fattori di trascrizione per formare il complesso di trascrizione. Negli eucarioti esistono tre diverse RNA polimerasi, ciascuna deputata alla trascrizione di specifici tipi di geni: RNA polimerasi I (per i geni degli RNA ribosomali), RNA polimerasi II (per la maggior parte dei geni strutturali) e RNA polimerasi III (per i geni degli RNA transfer). È soprattutto il tipo di TBP da cui inizia a formarsi il complesso di trascrizione che permette l intervento dell una o dell altra RNA polimerasi. Una volta formato il complesso di trascrizione, l RNA polimerasi ad esso corrispondente si lega alla sequenza di riconoscimento e può iniziare la trascrizione: il DNA si apre e l RNA polimerasi scorre lungo il filamento che va in direzione 3-5 (il cosiddetto filamento stampo), costruendo un RNA ad esso complementare ed antiparallelo. La trascrizione termina quando sul DNA si incontrano particolari sequenze di basi che stabiliscono la fine del gene: i terminatori. La sequenza di DNA compresa tra un promotore e un terminatore è detta unità di trascrizione da cui si ottiene una molecola di RNA detta trascritto primario. Ma perché, se il DNA è formato da due filamenti, ne viene preso in considerazione solo uno e perché proprio quello con direzione 3-5? e poi, perché il DNA non fornisce direttamente le informazioni per la sintesi delle proteine? che bisogno c è di passare attraverso l RNA? Molto probabilmente le risposte sono legate al modo in cui la vita è comparsa sulla Terra. Quasi sicuramente le prime forme di vita codificavano le informazioni sull RNA e non sul DNA, le informazioni erano poi immediatamente tradotte in proteine attraverso un meccanismo molto simile alla traduzione. Successivamente apparve il DNA, una molecola molto più stabile dell RNA e soprattutto composta da due filamenti complementari, così se uno si deteriora le 2. Esistono importanti differenze fra eucarioti e procarioti. Nei procarioti il promotore è in genere uno solo per più geni e spesso l RNA polimerasi vi si lega senza bisogno del complesso di trascrizione.

4 4 Il funzionamento delle informazioni informazioni si possono ricavare dall altro. La comparsa del DNA comportò la necessità di introdurre la trascrizione: il meccanismo di sintesi delle proteine era già funzionante a partire dall RNA e quindi la soluzione più economica fu quella di trasferire le informazioni dal DNA all RNA piuttosto che costruire un nuovo meccanismo di traduzione dal DNA alle proteine. Molto probabilmente l RNA polimerasi era in origine anche l enzima che effettuava la duplicazione dell RNA, costituito da un unico filamento con direzione 3-5, da cui sarebbe derivata la DNA polimerasi. Ecco perché quest ultimo riesce ad aggiungere nucleotidi solo all estremità 3 ed il motivo per cui nella trascrizione solo il filamento 3-5 del DNA fa da stampo. Il codice genetico Per mettere in relazione la sequenza di nucleotidi sull RNA e quella degli amminoacidi delle proteine occorre una tabella di corrispondenza che va sotto il nome di codice genetico, ovvero la relazione tra triplette di nucleotidi dell RNA e gli amminoacidi delle proteine. La decifrazione del codice risale agli anni 60: i primi passi furono compiuti dai biochimici Marshall Nirenberg e Heinrich Matthaei. I due prepararono RNA artificiali costituiti da un unico nucleotide, l uracile. Poi lo misero in una provetta insieme a tutto il necessario per compiere la traduzione e andarono ad analizzare la proteina risultante. Trovarono che era composta da un unico amminoacido: la fenilalanina. Di conseguenza conclusero che la tripletta UUU corrispondeva a quell amminoacido. Successivamente ripetettero la stessa cosa con l adenina e con la citosina (non con la guanina perché, per ragioni chimiche, non è possibile fare un RNA con solo questo nucleotide) e scoprirono che la tripletta AAA corrispondeva alla lisina e CCC alla prolina. Il passo successivo fu quello di costruire altri RNA artificiali via via più complicati (prima con due diversi nucleotidi, poi con tre e così via) e riuscirono così a decifrare l intero codice. Esso presenta tre importanti caratteristiche: 1. è universale: è cioè praticamente lo stesso per tutti gli organismi viventi, dal batterio all uomo, e ciò costituisce un importante prova della comune origine di tutti i viventi; 2. è ridondante: più triplette possono corrispondere ad uno stesso amminoacido: le triplette sono infatti 64 e gli amminoacidi da codificare solo 20, di conseguenza alcune triplette codificano lo stesso amminoacido (non è vero però il contrario: una tripletta non codifica mai più di un amminoacido, il codice non è ambiguo!); 3. è incompleto: delle 64 diverse triplette possibili solo 61 specificano un amminoacido, le altre 3 costituiscono dei segnali di controllo e sono dette triplette non senso. Amminoacido Triplette che lo codificano Amminoacido Triplette che lo codificano Ac. aspartico GAU GAC Leucina UUA UUG CUU CUC CUA CUG Ac. glutammico GAA GAG Lisina AAA AAG Alanina GCU GCC GCA GCG Metionina AUG (è anche il codone d inizio) Arginina CGU CGC CGA CGG AGA ACG Prolina CCU CCC CCA CCG Asparagina AAU AAC Serina UCU UCC UCA UCG AGU AGC Cisteina UGU UGC Tirosina UAU UAC Fenilalanina UUU UUC Treonina ACU ACC ACA ACG Glicina GGU GGC GGA GGG Triptofano UGG Glutammina CAA CAG Valina GUU GUC GUA GUG Isoleucina AUU AUC AUA Istidina CAU CAC Non senso UAA UAG UGA È importante non confondere il codice genetico con le informazioni genetiche. Queste ultime sono costituite dalla successione dei nucleotidi nel DNA e variano da individuo a individuo. Il codice invece è la SINTESI PROTEICA.DOCX A. Belli

5 Il funzionamento delle informazioni 5 corrispondenza tra triplette dell RNA e amminoacidi ed è sostanzialmente uguale per tutti gli organismi. Confondere le cose sarebbe come confondere un testo in inglese con il vocabolario d inglese: quindi non è corretto il comune modo di dire sta scritto nel mio codice genetico. La traduzione Una volta prodotto, l mrna esce dal nucleo e si dirige verso i ribosomi presso i quali avviene la traduzione, così chiamata perché le informazioni passano da un codice (costituito dai nucleotidi) ad un altro (costituito dagli amminoacidi). Per eseguire questo compito sono necessari degli adattatori, gli RNA di trasporto o trna. Si tratta di molecole relativamente piccole che presentano due zone funzionali diametralmente opposte l una all altra: l anticodone e il paracodone. La prima è destinata a stabilire un legame con i codoni dell mrna, l altra lega un amminoacido: in questo modo il trna fa da tramite tra l mrna e gli amminoacidi. In altre parole: il trna rappresenta il vocabolario della cellula, quello che fa corrispondere le triplette agli amminoacidi. Esistono diversi trna che si distinguono l uno dall altro per l anticodone: poiché questa zona comprende tre nucleotidi e con tre nucleotidi si possono fare 64 triplette diverse, ne consegue che possono esistere 64 trna diversi 3. Per legare un amminoacido al suo specifico trna esistono appositi enzimi detti amminoacil-trna-sintetasi che hanno il compito di identificare sia i singoli amminoacidi che i singoli trna 4. Un ruolo determinante nella traduzione è svolto dai ribosomi. Questi organuli sono importanti per assemblare la catena polipeptidica e garantire la corretta scansione in triplette. Ogni ribosoma è costituito da due subunità, una maggiore e una minore. La subunità maggiore è composta da tre molecole diverse di rrna e 45 proteine differenti; la subunità minore contiene una sola molecola di rrna e 33 proteine. L RNA ribosomiale forma i ribosomi e garantisce la corretta costruzione delle proteine. Sulla subunità maggiore del ribosoma si trovano tre siti di legame per i trna: il sito A (attacco), dove l anticodone del trna si lega al codone dell mrna portando l amminoacido da aggiungere alla proteina in crescita; il sito C (condensazione), dove il trna cede il proprio amminoacido alla proteina in crescita. il sito D (distacco), dove il trna che ha lasciato il proprio amminoacido si stacca e torna a legare un nuovo amminoacido per ricominciare il processo. 3. In realtà i diversi tipi di trna sono 61 e non 64 poiché 3 triplette non corrispondono ad alcun amminoacido. 4. L amminoacil-trna-sintetasi è un enzima con due siti attivi: uno per il trna, che riconosce attraverso il paracodone, l altro per l amminoacido, che riconosce tramite il gruppo residuo.

6 6 Il funzionamento delle informazioni La traduzione avviene in tre tappe: inizio, allungamento e terminazione. L inizio avviene con la formazione del complesso di inizio: le due subunità del ribosoma si aprono e tra esse si insinua l estremità 3 dell mrna, la cui prima tripletta è sempre AUG, che codifica per la metionina 5, successivamente un trna che trasporta metionina si lega al codone iniziale e si forma il complesso di inizio. A questo punto il ribosoma scorre e il trna con la metionina viene a trovarsi nel sito C, mentre nel sito A entra il secondo codone dell mrna. Si passa ora all allungamento. Nel sito A entra adesso un trna il cui anticodone è complementare al secondo codone dell mrna. Adesso avvengono tre eventi: 1. nel sito C si rompe il legame fra il trna e il suo amminoacido; 2. nel sito A si forma un legame peptidico fra l amminoacido nel sito C e quello (ancora attaccato al proprio trna) nel sito A. Ora sul trna del sito A si trovano due amminoacidi. 3. Ora l intero ribosoma si sposta di un codone in avanti lungo l mrna: il primo trna, privo di amminoacidi, si viene quindi a trovare nel sito D e si stacca dal ribosoma, mentre il secondo trna, con i due amminoacidi legati, va ad occupare il sito C. Il processo di allungamento continua ripetendo ciclicamente le seguenti tappe: un trna carico entra nel sito A libero e il suo anticodone si lega al codone dell mrna; l amminoacido appena portato forma un legame peptidico con la catena nel sito C; quest ultimo trna carica l intera sequenza mentre il precedente trna si libera; il ribosoma si sposta di nuovo: il trna del sito C si sposta nel sito D, da cui si distacca, e così via. La catena di amminoacidi si allunga quindi progressivamente dalla parte dell amminoacido carbossiterminale (l amminoacido N-terminale rimane sempre la prima metionina che ha iniziato la sintesi). La terminazione avviene quando nel sito A entra uno dei tre codoni di stop: il ciclo di allungamento si arresta e la traduzione ha termine. Non si deve pensare che, con un meccanismo così laborioso come quello appena descritto, la sintesi proteica proceda lentamente, tutt altro: la velocità media è di 4-5 amminoacidi al secondo, per cui la sintesi completa di una proteina di medie dimensioni (500 amminoacidi) si realizza in circa 1 minuto e mezzo soltanto. Da un punto di vista energetico la sintesi delle proteine è un processo anabolico che richiede un elevato consumo di ATP: 4 per ciascun amminoacido aggiunto. 2 ATP sono necessari per 5. Il primo amminoacido di una nuova proteina è sempre la metionina, anche se non sempre verrà poi mantenuto. In molti casi, infatti, dopo la traduzione la metionina iniziale viene rimossa. SINTESI PROTEICA.DOCX A. Belli

7 Il funzionamento delle informazioni 7 caricare l amminoacido sul trna, 1 ATP serve per la formazione del legame peptidico e un altra ATP è necessaria per lo spostamento del ribosoma. Di conseguenza una proteina media richiede ben 2000 ATP per poter essere sintetizzata. IL DOGMA FONDAMENTALE Il dogma fondamentale (o centrale) della biologia molecolare è un principio formulato nel 1958 da Francis Crick secondo cui il flusso dell informazione genetica è strettamente monodirezionale: parte dal DNA, coinvolge l RNA e quindi arriva alle proteine senza possibilità di poter invertire in alcun modo il percorso. Il termine dogma non va inteso in senso assoluto, quello cioè di un concetto non soggetto a discussione, ma come un importante ipotesi che, sebbene plausibile, aveva allora pochi riscontri sperimentali. Oggi sappiamo infatti che tale affermazione è solo parzialmente vera poiché è possibile che le informazioni dall RNA possano tornare al DNA 6, mentre non esiste nessuna osservazione che ne faccia presumere il passaggio da proteine a RNA. Ciò vuol dire che in una cellula (e più in generale in un essere vivente) è possibile introdurre nuove informazioni solo attraverso il DNA o l RNA, ma non attraverso le proteine. L introduzione del dogma fondamentale cambia leggermente il concetto di «un gene, una proteina» che abbiamo visto precedente e lo trasforma in quello di «un gene, un RNA». Poiché nella cellula esistono diversi tipi di RNA, il prodotto finale di un gene può avere diversi aspetti. Se l RNA è strutturale o non codificante, l attività del gene si può identificare con esso, mentre se è messaggero è necessario considerare la proteina che ne deriva: se è una proteina strutturale l attività genica si identifica con quest ultima, se invece è un enzima l attività del gene sarà il prodotto della reazione controllata da quell enzima. RNA non codificanti (1) gene RNA strutturali (2) mrna proteina strutturale (3) proteina funzionale (enzima) reagenti prodotti (4) (1) (2) (3) (4) = prodotti dell attività genica 6. Nei retrovirus, infatti, l informazione genetica è conservata nell RNA e non nel DNA, perciò quando essi infettano una cellula devono convertire il loro RNA in DNA in modo che possa integrarsi con quello cellulare. Per far ciò essi utilizzano un particolare enzima detto trascrittasi inversa (inversa perché, appunto, trasferisce le informazioni dall RNA al DNA, quindi in senso inverso a quello definito dal dogma fondamentale. Inoltre, recentemente, sono stati scoperti i retrotrasposoni, sequenze di DNA che si replicano attraverso una retrotrascrizione dell'rna trascritto dalla propria sequenza.