CODICE GENETICO E TRADUZIONE

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Barbara Colucci
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1 CODICE GENETICO E TRADUZIONE

2 Dogma centrale della Biologia molecolare (Francis Crick): Flusso dell informazione genetica: schematizzato in figura.

4 Gli esperimenti su Neurospora crassa (muffa del pane) hanno rivelato che i geni possono codificare per gli enzimi (esperimenti di Beadle etatum). N.c. può riprodursi in terreno minimo di coltura: contiene zucchero, sali inorganici e la vit. Biotina. Beadle etatum con raggi X hanno indotto mutazioni geniche ceppi mutanti che avevano perso la capacità di sopravvivere in terreno minimo, benchè in grado di crescere su un terreno completo addizionato con diversi amminoacidi, nucleosidi e vitamine! Quindi i mutanti avevano perso la capacità di sintetizzare alcuni Aa o vitamine e potevano sopravvivere solo in terreni addizionati di ciò! Beadle etatum trasferirono i mutanti in una serie di mezzi di coltura, ciascuno contenente in aggiunta un singolo Aa o 1 vitamina individuati una serie di mutanti ciascuno impossibilitato a sintetizzare un particolare Aa o 1 vit. Poiché gli Aa e le vit. sono sintetizzati con vie metaboliche Beadle etatum cercarono di identificare il passaggio difettivo di ciascuna via! Aggiunsero quindi al terreno minimo i precursori metabolici di un Aa o vitamina: trovarono che ciascuna mutazione corrispondeva alla inattivazione di un unico enzima che catalizzava un passaggio responsabile della sintesi di uno specifico Aa formularono l ipotesi della corrispondenza diretta fra un gene un enzima

5 Pauling scoprì mediante l elettroforesi, che l emoglobina delle cellule falciformi migrava con una velocità diversa rispetto all emoglobina normale, suggerendo che le due proteine differiscono nella carica elettrica.

6 Esperimento di Ingram Ingram: Una mutazione genica è in grado di modificare un singolo Aa!

7 UN GENE CODIFICA PER UNA SEQUENZA AMMINOACIDICA (per la struttura quaternaria delle proteine). IN EUCARIOTI SEQUENZE CODIFICANTI E NON C. all interno di un gene Alcuni geni codificano per RNA e non per polipeptidi

8 Proflavina: mutageno (colorante all acridina) causa delezioni o addizioni di basi: MUTAZIONI FRAMESHIFT. Crick e Brenner: stesso tipo di risposte su fagi T4.

10 Nirenberg e Matthei utilizzarono sistemi acellulari per lo studio della sintesi proteica. Mescolarono ribosomi isolati, amminoacidi, una fonte di energia ed un estratto cellulare contenente i componenti solubili del citoplasma. L aggiunta di RNA aumentava la velocità della sintesi proteica Ma come le molecole di RNA aggiunte funzionavano come messaggi determinando la sequenza Aa? Usarono la polinucleotide fosforilasi che produce molecole sintetiche di RNA con composizione in basi predeterminata Costruirono poliu e ottennero polifenilalanina e così via Khorana costruì un mrna sintetico con sequenza alternata: UAUAUA e ottenne un poliaa: contenente solo tirosina e leucina alternati. Ulteriori studi portarono a decifrare il codice genetico:

16 RNA

18 PROTEINE Enzimi fattori trascrizione proteine strutturali proteine contrattili trasporto; pompe; canali ionici ormoni - fattori di crescita recettori deposito anticorpi tossine

19 PROTEINE Struttura chimica Proteine semplici Proteine coniugate (con gruppi prostetici) apoproteine Modificazione post-traduzionale PROTEINE Concatenamento di 20 div. Aa R H 2 N C COOH H

20 Negli mrna che codificano per poche proteine rare, la molecola di mrna si ripiega in modo da legare specifici trna: UGA è utilizzato per specificare incorporazione di selenocisteina. UAG: pirrolisina. TOTALE 22 Aa

22 Corrispondente eucariotico: 80S: 60S + 40S.

Le cellule contengono 20 Aa-tRNA-sintetasi Quando per un determinato Aa esistono più trna, la stessa Aa-tRNA- sintetasi li riconosce tutti Le Aa-tRNA-sintetasi

26 Le cellule contengono 20 Aa-tRNA-sintetasi Quando per un determinato Aa esistono più trna, la stessa Aa-tRNA- sintetasi li riconosce tutti Le Aa-tRNA-sintetasi riconoscono i nucleotidi localizzati in almeno 2 regioni della molecola di trna Alcune Aa-tRNA-sintetasi riconoscono gli Aa non corretti eventualmente legati ai trna.

28 Segmento 5 non tradotto (da ~10 a più di 200 nucleotidi) Sequenza codificante tradotta Segmento 3 non tradotto (da ~50 a più di 200 nucleotidi) Regola la stabilità dei messaggeri cap. AUG T... AAUAAA... Coda di poli(a) OH Il CAP 5 : Codon di inizio 1. Facilità la fase di inizio 2. E un segnale riconosciuto dai complessi del poro 3. Protegge gli mrna dalle ribonucleasi Codon di terminazione (UGA, UAA o UAG (da ~30 a più di 200 nucleotidi) Complessata con una proteina che è vitale per la cellula. Caratteristiche strutturali di un mrna eucariotico. La coda di poli(a) non è presente in alcuni mrna eucariotici; la struttura cap 5 non è presente in alcuni mrna di virus che infettano cellule eucariotiche.

31 La fase d inizio negli eucarioti coinvolge un gruppo diverso di fattori di inizio (eif) Una modalità di assemblaggio del complesso d inizio leggermente Un particolare trna iniziatore che trasporta la metionina - eif 2 + GTP si unisce al trna iniziatore carico prima che il trna si leghi allla subunità ribosomiale minore insieme ad altri fattori d inizio - Il complesso risultante si lega all estremità 5 dell mrna, riconoscendo il CAP al 5 - In seguito al legame di un mrna, la subunità ribosomiale minore con il trna iniziatore a rimorchio, scivola lungo l mrna e normalmente inizia la traduzione a livello del primo AUG che incontra. - ACCAUGG - Quando il trna iniziatore si appaia con il codone d inizio, la subunità ribosomiale maggiore si unisce al complesso.

Meccanismi che promuovono la distruzione degli mrna difettivi: la degradazione mediata da mutazioni non senso [distinzione tra i codoni di stop normali e quelli prematuri è effettutata sulla base

35 Meccanismi che promuovono la distruzione degli mrna difettivi: la degradazione mediata da mutazioni non senso [distinzione tra i codoni di stop normali e quelli prematuri è effettutata sulla base della loro relazione spaziale con il complesso di giunzione degli esoni (EJC)] e la degradazione per assenza di stop (un complesso enzimatico di degradazione si lega al sito A vuoto del ribosoma e degrada mrna difettivo) Nei batteri: Quando la traduzione si arresta alla fine di un mrna privo di codone di stop: tmrna si lega al sito A e dirige l aggiunta di una dozzina di Aa: sequenza segnale per la degradazione della proteina!

36 insulina

37 Polipeptide lungo circa 30 Aa

favorire l interazione con l interno lipidico della membrana una regione polare vicino al sito

39 La sequenza segnale (15-30 Aa) contiene: regione N-terminale carica positivamente promuove l interazione con l esterno idrofilico della membrana del RE Una regione centrale idrofobica può favorire l interazione con l interno lipidico della membrana una regione polare vicino al sito di taglio proteolitico. SRP: particella di riconoscimento del segnale all estremità N- terminale

40 Dopo che i polipeptidi sono stati rilasciati nel lume del RE, si ripiegano per assumere la loro struttura terziaria definitiva e, in alcuni casi, si associano con altri polipeptidi (struttura quaternaria). Il ripiegamento è facilitato dagli chaperoni molecolari. Chaperone BiP (binding protein) della famiglia chaperoni Hsp70, si lega alle regioni idrofobiche delle catene polipeptidiche (particolarmente a quelle ricche di triptofano, fenilalanina e leucina). Negli eucarioti, la formazione di ponti disolfuro è limitata alle proteine sintetizzate nel RE. Il lume del RE contiene l enzima disolfuro isomerasi. Le glicoproteine sintetizzate nel RE, possono essere ulteriormente glicosilate nel complesso di Golgi quindi smistate e distribuite verso altre localizzazioni (sequenze segnale, es: mannosio-6-fostato per enzimi lisosomiali; sequenza KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) all estremità C-terminale per le proteine con destinazione finale RE).

41 L inserzione delle proteine integrali di membrana utilizza sequenze di stop del trasferimento:

La sequenza serina-lisina-leucina (SKL) vicino al C-terminale, indirizza le proteine ai perossisomi (dopo la traduzione); Il segnale di localizzazione nucleare

42 La sequenza serina-lisina-leucina (SKL) vicino al C-terminale, indirizza le proteine ai perossisomi (dopo la traduzione); Il segnale di localizzazione nucleare verso i pori nucleari: nucleo. Per mitocondri e cloroplasti: sequenza di transito all estremità N- terminale (Aa idrofobici e idrofilici). TOM, TIM, TOC, TIC: traslocasi

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