1.2 Sperimentazione ex vivo

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1 La seconda fase riguarda, invece, la scelta del modello cellulare da utilizzare per la sperimentazione. Sulla base della ricerca bibliografica è stata individuata, per il presente lavoro, la linea cellulare MRC-5 (fibroblasti di polmone umano), stabilizzata a partire da tessuto polmonare sano proveniente da feto maschio di 14 settimane. Sempre sulla base della letteratura scientifica, sono stati definiti i test e i target biologici da investigare in seguito all esposizione delle colture cellulari al campo magnetico statico. In particolare, verranno studiati: a. vitalità e proliferazione cellulare, utilizzando test che valutano l integrità della membrana plasmatica e l attività metabolica cellulare; b. apoptosi, per identificare cellule in apoptosi precoce, tardiva e necrosi; c. stato ossido-riduttivo cellulare, mediante la quantificazione della produzione di specie reattive dell ossigeno (ROS); d. danno alla molecola di DNA, con la misura delle rotture a singolo e doppio filamento del DNA. 1.2 Sperimentazione ex vivo La sperimentazione ex vivo sui lavoratori verrà effettuata eseguendo un test di citogenetica, il test del micronucleo, su campioni di mucosa buccale prelevati da un campione rappresentativo della popolazione di operatori di MRI. Lo stesso test sarà applicato ad un gruppo di controllo che presenta caratteristiche simili al gruppo esposto (sesso, età, stile di vita), eccetto che l esposizione al campo. Tale sperimentazione ha come obiettivo quello di valutare se esposizioni prolungate ad intensi campi magnetici statici possono indurre un danno genetico, di individuare un eventuale marcatore di effetto per questo tipo di esposizioni, e di mettere a punto una procedura che può essere utilizzata per il bio-monitoraggio dei lavoratori esposti. La scelta delle cellule della mucosa buccale quale modello cellulare su cui effettuare l analisi citogenetica è dovuta al fatto che si tratta di un tessuto facilmente accessibile, che può essere campionato con un metodo non invasivo, senza causare eccessivo stress ai donatori. 1.3 Monitoraggio dei livelli di esposizione In questa prima fase del progetto, l esposizione degli operatori di RMN al campo magnetico statico è stata valutata mediante l utilizzo di dosimetri personali (Tecnorad, Verona, Italia) dotati di sensori ad effetto Hall isotropi, indossati dagli operatori durante le attività lavorative, che acquisiscono i valori di induzione magnetica ad una frequenza di campionamento di 5 Hz. 2. RISULTATI 2.1 Studi in vitro Il sistema di esposizione, realizzato per gli studi in vitro, consiste nel posizionare il campione biologico tra una coppia di magneti permanenti collocati all interno di una struttura realizzata con materiale conduttore che ne confina la maggior parte delle linee di campo generate. Una soddisfacente uniformità del campo nella zona di interesse per le esposizioni è stata 236

2 Dalla valutazione alla gestione del rischio. Strategie per la salute e la sicurezza sul lavoro raggiunta aggiungendo dei dischi fra i magneti e le colture cellulari da esporre. Essendo infatti la differenza di permeabilità magnetica molto diversa fra i materiali costituenti i dischi e l aria, il campo rimane confinato all interno dei dischi e la sua orientazione risulta perpendicolare al campione. In Figura 1 è rappresentato il modello del sistema di esposizione e in Figura 2 è riportata una fotografia del sistema finale assemblato ed inserito all interno di un incubatore per colture cellulari. Figura 1 - Modello CAD (computer-aided design) del sistema di esposizione Figura 2 - Sistema di esposizione a campi magnetici statici per colture cellulari in vitro 2.2 Studi ex vivo È stato messo a punto un protocollo sperimentale per eseguire il test del micronucleo in cellule della mucosa buccale umana. La metodologia prevede: 1) il prelievo e la raccolta di campioni di mucosa buccale da donatori volontari; 2) la preparazione e colorazione dei vetrini; 3) l analisi e la classificazione, tramite microscopia ottica, delle tipologie cellulari caratteristiche della mucosa buccale e; 4) l individuazione di micronuclei (MNi), che sono l espressione di un eventuale danno genetico indotto dall esposizione. In breve, si distinguono le cellule normali da quelle anormali sulla base delle caratteristiche citologiche e nucleari. Le cellule normali si distinguono in cellule basali e differenziate. Le cellule differenziate hanno un nucleo colorato uniformemente, di solito di forma ovale o sferica. Esse si distinguono dalle cellule basali per la loro più grande dimensione e per un rapporto nucleo/ citoplasma più piccolo. Un immagine da microscopio ottico dei due tipi di cellule, prelevate da uno dei donatori esaminati, è riportata in Figura 3. Le cellule anormali sono indicative del danno al DNA, dei difetti della divisione cellulare e della morte cellulare. Tra queste si distinguono le cellule micronucleate, le cellule con gemme nucleari, le cellule binucleate, le cellule con cromatina condensata, le cellule cariorretiche, le cellule picnotiche e le cellule cariolitiche. In particolare, le cellule micronucleate 237

3 possono contenere uno o più MNi. I MNi sono di solito di forma tonda od ovale ed il loro diametro può variare tra 1/3 e 1/16 del diametro del nucleo principale, Figura 4. Figura 3 - Cellule basali e differenziate Figura 4 - Cellule con micronuclei Nell ambito della procedura sviluppata, sono state considerate solo le cellule basali e differenziate, con un nucleo colorato uniformemente, per lo screening dei MNi. In particolare, sono state analizzate 200 cellule basali e 1000 cellule differenziate. La frequenza di micronuclei è stata calcolata come il rapporto tra il numero di MNi totali ed il numero di cellule contate: Tale procedura è stata validata su 5 donatori volontari sani, di età compresa tra 28 e 49 anni, ai quali è stato precedentemente sottoposto un questionario per tener conto di informazioni quali stile di vita (fumo, alcool), stato generale di salute, assunzione di farmaci, etc. 2.3 Monitoraggio dell esposizione dei lavoratori Sono stati elaborati i risultati delle misure di campo magnetico statico, effettuate tramite i dosimetri personali nell arco temporale di un mese, e relative all esposizione di diversi componenti dello staff di MRI dell Istituto nazionale tumori Fondazione G. Pascale di Napoli, in cui è presente un apparato per MRI con magnete a superconduttore che fornisce un valore massimo di induzione magnetica nella zona paziente pari a 1,5 T. In particolare, i seguenti operatori sono stati coinvolti nell azione di monitoraggio: due medici, due tecnici sanitari di risonanza magnetica, un infermiere ed un ingegnere biomedico. In Figura 5a è riportato, quale caso rappresentativo, l andamento temporale del livello di induzione magnetica a cui è risultato esposto un tecnico sanitario di risonanza magnetica (TSRM) durante una regolare giornata lavorativa. Si è scelto di riportare il caso del TSRM in quanto questa è risultata la categoria professionale maggiormente esposta, essendo coinvolta nelle fasi di assistenza e posizionamento del paziente sul lettino, nonché delle bobine 238

4 Dalla valutazione alla gestione del rischio. Strategie per la salute e la sicurezza sul lavoro di gradiente ed a radiofrequenza per l esecuzione dell esame diagnostico. Rispetto all intero monitoraggio mensile, il grafico riportato in Figura 5b è rappresentativo della giornata in cui si è verificata la maggiore esposizione. In ogni caso, come dimostrato anche in Figura 6, pur essendo stati rilevati dei picchi di esposizione intorno ai 400 mt, il livello di esposizione è risultato sempre al di sotto del limite di 200 mt per 1 ora al giorno fissato dal d.m. 2/8/1991 riguardante l esposizione dei lavoratori al campo magnetico statico. (a) (b) Figura 5 - a) Livelli di esposizione di un tecnico sanitario di risonanza magnetica durante una giornata lavorativa; b) Zoom sugli intervalli di maggiore esposizione. Figura 6 - Istogramma della distribuzione dei livelli di esposizione per un tecnico sanitario di risonanza magnetica (TSRM) durante una giornata lavorativa. 239

5 3. CONCLUSIONI Durante il primo anno del progetto, è stato realizzato e caratterizzato un sistema di esposizione per colture cellulari ad un campo di induzione magnetica di circa 400 mt, e sono attualmente in corso esperimenti su una linea cellulare di fibroblasti umani (cellule MRC-5), secondo un protocollo che prevede l esposizione al campo per 1 ora al giorno per 4 giorni consecutivi, e l esecuzione dei test biologici alla fine del ciclo di esposizioni. Inoltre, è stato messo a punto un protocollo sperimentale per eseguire il test del micronucleo su campioni di mucosa buccale, e la procedura è stata convalidata su campioni provenienti da donatori di controllo. Tale protocollo sarà applicato su campioni provenienti da lavoratori esposti. Si stanno analizzando i primi dati del monitoraggio dei livelli di induzione magnetica cui sono esposti operatori di RMN. I primi dati ottenuti, relativi al periodo di un mese di esposizione occupazionale, hanno confermato il rispetto dei limiti di esposizione per il lavoratori ai campi magnetici statici, secondo il d.m. 2/8/1991. BIBLIOGRAFIA Bradley JK, et al., Occupational exposure to static and time varying gradient magnetic fields in MR units. Journal of Magnetic Resonance Imaging 26: (2007). Icnirp, On limits of exposure to static magnetic fields. Health Physics 96(4): (2009). Directive 2013/35/EU of the european parliament and of the council of 26 june 2013 on the minimum health and safety requirements regarding the exposure of workers to the risks arising from physical agents (electromagnetic fields) (20th individual Directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC) and repealing Directive 2004/40/EC. Kim S and Im W. Static magnetic fields inhibit proliferation and disperse subcellular localization of gamma complex protein3 in cultured C2C12 myoblast cells. Cell Biochem Biophys. 57(1):1-8 (2010). Karpowicz, J., and Gryz, K. Health risk assessment of occupational exposure to a magnetic field from magnetic resonance imaging devices. International journal of occupational safety and ergonomics (Jose), 12(2): (2006). Karpovicz J, et al., Occupational risk from static magnetic fields from MRI scanner, Environmentalist 27(4): ,