Il Controllo Ufficiale della riproduzione animale

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1 Il Controllo Ufficiale della riproduzione animale Martina Benedetti Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana M. Aleandri Malattie animali nella sfera riproduttiva La gestione degli accertamenti diagnostici Empoli, Mercoledì 11 Novembre 2015

2 La Normativa Decreto 19 luglio 2000, n. 403 Approvazione del nuovo regolamento di esecuzione della legge 15 gennaio 1991, n 30 concernente la riproduzione animale Decreto Legislativo 27 maggio 2005, n.132 attuazione della direttiva 2003/43/CE relativa agli scambi intracomunitari ed alle importazioni di sperma di animali della specie bovina Reg. (CE) n. 1266/2007 Delibera Regionale Toscana 30 marzo 2015, n. 385 Disposizioni operative per l attuazione della normativa unionale e statale in materia di riproduzione animale. Regolamento di polizia veterinaria DPR 8/2/1954 n 320 OIE: Terrestrial Animal Health Code Chapter 4.5. General hygiene in semen collection and processing centres Chapter 4.6. Collection and processing of bovine, small ruminant and porcine semen Chapter 4.7/4.8.Collection and processing of in vivo(4.7)/in vitro (4.8) derived embryos from livestock and equids

3 SPECIE BOVINA Decreto Legislativo 27 maggio 2005, n. 132 ALLEGATO B CAPO I Condizioni applicabili all immissione degli animali nei centri riconosciuti di raccolta dello sperma Quali esami di laboratorio bisogna svolgere? punto d) nei 28 giorni precedenti la 40 ena deve essere attestati l esito negativo alla ricerca degli anticorpi ad eccezion fatta della BVD/MD per: -Tubercolosi -Brucellosi -Leucosi -IBR/IPV -BVD/MD (ricerca del virus ed esame sierologico) -Bluetongue

4 SPECIE BOVINA Decreto Legislativo 27 maggio 2005, n. 132 ALLEGATO B CAPO I Condizioni applicabili all immissione degli animali nei centri riconosciuti di raccolta dello sperma Quali esami di laboratorio bisogna svolgere? punto e) durante il periodo di 40 ena -Brucellosi -IBR/IPV -BVD/MD (ricerca del virus ed esame sierologico) -Campylobacter foetus (1 o 3 volte a distanza di tre settimane) -Trichomonas foetus -Bluetongue

5 SPECIE BOVINA Decreto Legislativo 27 maggio 2005, n. 132 ALLEGATO B CAPO II Esami di routine da effettuare su tutti i bovini durante lo stazionamento nel centro riconosciuto 1. tutti i bovini almeno una volta anno devono essere sottoposti con esito negativo alle prove: -Tubercolosi -Brucellosi -Leucosi -IBR/IPV -BVD/MD (ricerca del virus ed esame sierologico) -Campylobacter foetus -Trichomonas foetus -Bluetongue Tutte le prove devono essere effettuate presso un laboratorio riconosciuto dallo stato membro

6 TUBERCOLOSI BOVINA Gli animali vanno testati prima dell ingresso e poi sottoposti almeno una volta anno a profilassi Diagnosi in vita -Intradermoreazione (IDT) -γ-interferon evidenzia la reazione di ipersensibilità di tipo ritardato all iniezione intradermica di Tubercolina

7 BRUCELLOSI BOVINA Gli animali vanno testati prima dell ingresso e poi sottoposti almeno una volta anno a profilassi RBPT (rose/bengal plate agglutination test) -test standardizzato, facile, veloce, economico antigene B. abortus strain 99 acido (ph 3.6) e colorato con Rosa Bengala -ph basso blocca agglutinazione da parte di IgM e favorisce IgG1 riduzione reazioni aspecifiche Fissazione del complemento (CFT) test di elezione e di conferma raccomandato da OIE sensibile e specifico

8 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA Patologia causata da Bovine Herpesvirus (BHV-1 è suddiviso in sottotipi genetici) BHV-1.1 BHV-1.2a BHV-1.2b Lo sviluppo della sintomatologia tipica della rinotracheite piuttosto che quella della vulvovaginite/balanopostite dipende più dalla via di infezione che dal sottotipo virale

9 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA Vie di trasmissione - Trasmissione per contatto diretto e indiretto -via aerogena (5-6 metri di distanza) -via venerea (seme: costante eliminazione virale in fase acuta - poi intermittente) Il seme si contamina con secreti del pene/prepuzio - obbligo di indennità nei centri di produzione seme Dopo infezione per via orale BoHV-1: -replica a livello della mucosa delle prime vie respiratorie e tonsille -si localizza in forma latente nel ganglio trigemino Dopo infezione genitale BoHV-1: -replica a livello della membrana vaginale e prepuziale -si localizza in forma latente nei gangli sacrali Il DNA virale resta latente a livello del sistema nervoso probabilmente per tutta la vita

10 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA A seguito di stress (trasporto, parto, ecc ) -riattivazione del virus -passaggio dalla fase di latenza a quella litica Diffusione intermittente nell ambiente!

11 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA

12 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA Che tipo di campione inviare Quali sono le prove disponibili Quali tipi di tecniche Diagnosi indiretta ricerca degli anticorpi: -tecnica ELISA proteina B -tecnica ELISA proteina E (DIVA test) -test di sieroneutralizzazione (SN) Diagnosi diretta ricerca virus: Isolamento del virus da tampone/organi -coltura cellulare -PCR α-herpesvirus

13 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA Tecnica ELISA sta sostituendo progressivamente la SN Centro di referenza OIE (Reims Germany) Disponibilità dei sieri europei di riferimento Europei EU1, EU2, EU3 per standardizzazione metodi Paesi che hanno eradicato l infezione o applicano piani di eradicazione obbligatori ai sensi della direttiva 64/432

14 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA ELISA o SN? ELISA gb molto sensibile e specifica SN sensibile e specifica

15 RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA tecnica ELISA reattività non specifiche -diversità tra lotti dei kit -campioni esaminati subito dopo prelievo fenomeno freschezza -animali prelevati entro 4 settimane dalla somministrazione vaccini -cattiva qualità del campione (es.. Emolisi) 2 casi presso centro di raccolta seme 1.secretariat 2.manciego

16 DIARREA VIRALE BOVINA (BVD) malattia virale provocata da un pestivirus (BVDV) suscettibili bovini di ogni età BVDV correlato con i virus della peste suina e border desease degli ovini dopo la fase acuta generalmente non si sviluppa latenza feti che nascono dopo infezione in-utero possono sviluppare infezioni persistenti (malattia delle mucose) di solito 1-2% della popolazione bovina forma acuta più frequente nei giovani con febbre, diarrea, sintomi respiratori

17 DIARREA VIRALE BOVINA (BVD) Trasmissione del virus Via classica contatto diretto tra Infezione transitoria acuta Seme embryo transfer Bassa escrezione virale pochi giorni animale ricettivo animale infetto Infezione persistente (infettato prima della nascita) Intensa escrezione virale tutta la vita

18 DIARREA VIRALE BOVINA (BVD) Embrione/feto 0-30 giorni aborto giorni fenomeno dell immunotolleranza giorni malformazioni L animale immunotollerante sviluppa un infezione persistente il virus si moltiplica nel feto e in maniera massiccia per tutta la vita non potendo sviluppare una reazione immunitaria

19 DIARREA VIRALE BOVINA (BVD) diagnosi sierologica diagnosi virologica ricerca degli anticorpi ricerca del virus SN ELISA isolamento ELISA PCR anticorpi strutturali Anticorpi strutturali Anticorpi non strutturali

20 DIARREA VIRALE BOVINA (BVD) La diagnosi sierologica SN ELISA per anticorpi vs proteine strutturali per anticorpi strutturali per anticorpi non strutturali NS2-3 Proteine strutturali: -glicoproteine di membrana -ceppo specifiche -variabili da ceppo a ceppo Proteine non strutturali NS2-3: -Prodotte quando il virus si moltiplica -Stabili per il genere pestivirus

21 DIARREA VIRALE BOVINA (BVD) La diagnosi virologica consiste nella ricerca del virus: -isolamento -ELISA -PCR Matrici utili: sangue e sangue + anticoagulante Da siero: isolamento, PCR, ELISA (proteine strutturali) Dai leucociti: isolamento, PCR, ELISA (proteine strutturali) Nel siero il genoma virale è meno presente

22 DIARREA VIRALE BOVINA (BVD) Nel siero il genoma virale è meno presente non pregiudica la diagnosi del PI la matrice leucocitaria è la più efficace consigliabile il prelievo di sangue con anticoagulante i tori del centro raccolta seme che risultano positivi alla ricerca degli anticorpi devono essere negativi per la ricerca del virus!

23 BLUE TONGUE Patologia virale non contagiosa, trasmessa da vettore interessa ruminanti selvatici e domestici come ovini, caprini, bovini, bufali, caprioli, e vari altri artiodattili. Il virus appartiene alla famiglia reoviridae genere orbivirus La trasmissione prevede la presenza contemporanea di triade virus-vettore-ospite I bovini presentano una fase viremica molto lunga (fino a 60 giorni post infezione) costituendo un serbatoio in grado di garantire al virus, almeno nelle zone temperate, il superamento dei periodi di freddo invernale (cosiddetto overwintering ) Vettore culicoides raggio di volo alcuni km trasportati da vento Numerosi focolai nel bacino mediterraneo Epidemia 2014 ha interessato le province del centro Italia con la prevalente diffusione del sierotipo 1

24 BLUE TONGUE Reg. (CE) n. 1266/2007 REGOLAMENTO DELLA COMMISSIONE relativo alle misure di applicazione della direttiva 2000/75/CE del Consiglio per quanto riguarda la lotta, il controllo, la vigilanza e le restrizioni dei movimenti di alcuni animali appartenenti a specie ricettive alla febbre catarrale. ALLEGATO III Punto B Animali di specie sensibili produttori di sperma degli animali Sono stati sottoposti a prove sierologiche.. almeno ogni 60 giorni durante il periodo di raccolta e tra il ventunesimo e il sessantesimo giorno successivo all ultimo prelievo dello sperma da consegnare Sono stati sottoposti, con esito negativo e conformemente al manuale OIE sugli animali terrestri, a un test di identificazione dell agente condotto su campioni ematici prelevati: ii) durante il periodo di raccolta dello sperma: - almeno ogni sette giorni, nel caso di test di isolamento del virus, oppure - almeno ogni 28 giorni, nel caso della reazione a catena della polimerasi

25 BLUE TONGUE diagnosi sierologica diagnosi virologica ricerca degli anticorpi ricerca del virus ELISA SN PCR

26 Malattie nella sfera riproduttiva del cavallo Anemia infettiva degli equini Morbo coitale maligno Arterite virale equina morva CEM Contagious Equine Endometritis

27 Malattie nella sfera riproduttiva del cavallo Non il nome!

28 ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI UN QUADRO NORMATIVO IN EVOLUZIONE OO. MM. 6/8/2010 (scaduta) concernente il piano di sorveglianza nazionale dell anemia infettiva degli equini. Sono richiamati: - art 99 RPV 320/54 (sequestro, isolamento, disinfezioni); - artt 1 e 3 DM 4/12/76 (test Coggins, definizione positivo, misure negli ippodromi); - art 4, comma 4 a) 3) DPR 243/94 (tempi revoca: due test a tre mesi di distanza dall eliminazione

29 ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI Situazione epidemiologica Nel periodo sono stati analizzati dal CRAIE campioni dalla specie cavallo, 1479 dei quali confermati positivi (0,14%)

30 ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI La situazione epidemiologica in Europa - Anno

31 ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI Diagnosi sierologica ELISA AGID ImmunoBlot gp90 gp45 p26

32 ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI I metodi AGID Metodo Coggins (D.M. 04/12/1976): -doppio strato di AGAR -70 µl di siero -lettura dopo 48 h Metodo OIE (OIE Terrestrial Manual 2013): -unico strato di AGAR µl di siero -lettura dopo 24 h

33 ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI Sensibilità ELISA > sensibilità AGID L'ELISA rileva circa il 20% positivi in più di AGID (C. J. Issel et al. 2013); Le positività in ELISA sono nella maggior parte dei casi confermate in IB ed anche virologicamente (Scicluna et. al. 2013); Limite di rilevabilità di ELISA 10 volte superiore rispetto ad AGID.

34 ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI Malattie da retrovirus sottoposte a sorveglianza epidemiologica aggiornamenti epidemiologici e strumenti diagnostici Convegno aprile 2015 Lo schema di provvedimento riguardante il nuovo piano nazionale per l AIE verrà predisposto congiuntamente al CRAIE una volta definiti tutti gli aspetti tecnici e giuridici dovrà essere sottoposto alla firma del Ministro e quindi pubblicato in G.U. metodo di screening: ELISA AGID riservato alle sole movimentazioni internazionali, fintanto che sarà indicato come prescribed test for international trade

35 MORBO COITALE MALIGNO Patologia contagiosa degli equidi causata da Trypanosoma equiperdum (Doflein, 1901) che si trasmette da animale ad animale durante il coito. Unica patologia provocata da tripanosomi non trasmessa da vettori eradicato in Italia negli anni 40. Dopo una grave epidemia negli anni 70 (casi in Abruzzo, Emilia Romagna, Lazio, Marche, Sicilia, Umbria), è stato nuovamente eradicato. La normativa nazionale che regolamenta la riproduzione animale (Legge 30/91, DM 172/94, DM 403/00) comprende il controllo ufficiale di alcune malattie degli equidi fra cui il MCM Normativa specifica relativa al MCM: - RPV DPR n. 320/54 artt DM 21 ottobre 1975 (abbattimento e distruzione capi infetti) - DPR 243/94 art 4 comma 4 a) 1) (revoca misure: sei mesi da ultimo contatto)

36 MORBO COITALE MALIGNO La situazione epidemiologica internazionale - Anno 2011 (OIE) L'infezione è endemica in molte aree del continente asiatico, dell'africa, in Russia, parte del Medio Oriente e SudAmerica. In Europa le ultime notifiche degli altri Paesi CE risalgono agli anni 50.

37 MORBO COITALE MALIGNO La ricomparsa della malattia in Italia MORBO COITALE MALIGNO La ricomparsa della malattia in Italia La malattia ricompare in Italia nel 2011 (7 focolai): la prima positività riguarda uno stallone testato per l autorizzazione alla monta in provincia di Catania. L esito delle indagini evidenza che l infezione circolava già da alcuni mesi; l origine presunta dei casi si attribuisce ad un attività di monta non controllata e di commercio irregolare. I controlli estesi del 2011 hanno consentito di definire le aree a rischio. I controlli più mirati 2012 hanno consentito di delineare una situazione epidemiologica favorevole: capi esaminati nelle Regioni a rischio e 8628 nelle altre Regioni. Non sono stati confermati ulteriori casi positivi. Il provvedimento del 2013 sancisce la conclusione delle misure straordinarie per il rilievo della bassa prevalenza dell infezione e raccomanda la puntuale applicazione della normativa vigente sulla riproduzione animale e sulla registrazione e identificazione degli equidi.

38 MORBO COITALE MALIGNO

39 MORBO COITALE MALIGNO

40 EVA - Arterite Virale Equina malattia infettiva soggetta ad obbligo di denuncia. L O.M ha pianificato e reso obbligatorio su tutto il territorio nazionale il controllo dell EVA negli equini e prevede il controllo sierologico/virologico dei cavalli di sesso maschile adibiti alla monta L infezione può essere trasmessa tra cavalli nei seguenti modi: - trasmissione diretta durante l accoppiamento - trasmissione diretta o indiretta durante il ruffianamento - con l inseminazione di cavalle con seme di stalloni infetti o con seme contaminato durante la raccolta. Il virus può sopravvivere nel seme congelato o refrigerato senza essere influenzato dagli antibiotici aggiunti al seme - per contatto con feti abortiti o altri prodotti del parto - per via respiratoria, attraverso le goccioline che si emettono tossendo o starnutendo

41 EVA - Arterite Virale Equina In molti paesi, tra cui USA, Inghilterra, Irlanda, Francia, è disponibile un vaccino. Questa sieropositività non può essere differenziata da quella causata dall infezione In Italia la profilassi vaccinale non è legalmente praticabile Gli animali risultati positivi all'accertamento sierologico restano esclusi dalla monta ed il loro sperma non può essere impiegato fino alla conclusione degli ulteriori accertamenti per la ricerca del virus dell'arterite equina nello sperma

42 EVA - Arterite Virale Equina O.M. 13 gennaio 1994, pubblicata nella Gazzetta Ufficiale del 17 gennaio 1994, n. 12. Allegato A Metodi diagnostici per l accertamento dell arterite virale negli equidi riproduttori maschi accertamenti sierologici e virologici le linee direttrici ed i criteri minimi riportati. a) Identificazione degli anticorpi nei confronti del virus dell'arterite virale equina in campioni di sangue 1. Raccolta dei campioni di sangue. Per la diagnosi sierologica il prelievo di sangue deve essere effettuato da riproduttori in buono stato di salute utilizzando provette sterili. Qualora fra gli equini mantenuti assieme ai riproduttori fossero presenti soggetti con sintomatologia clinica riferibile a malattie infettive, il prelievo di sangue dovrà essere effettuato trascorsi 15 giorni dall'ultimo caso di malattia. 2. Prova di sieroneutralizzazione. Uno stallone è considerato sieropositivo se al test di sieroneutralizzazione viene riscontrato un titolo anticorpale a 4.

43 EVA - Arterite Virale Equina b) Isolamento e identificazione del virus dell'arterite virale equina in colture cellulari 1. Raccolta dei campioni di sperma. Per l'isolamento del virus è essenziale disporre dello sperma degli stalloni. Lo sperma deve essere raccolto mediante vagina artificiale a fondo cieco (tipo Colorado o Missouri). Per il lavaggio dei genitali dello stallone prima del prelievo non devono essere impiegate soluzioni disinfettanti e la temperatura interna della vagina artificiale non deve essere superiore a 40 C. Ai fini dell'isolamento virale è necessario raccogliere campioni di sperma contenenti sia la parte liquida sia la frazione cellulare dell'eiaculato. Il campione deve essere quindi conservato in ghiaccio secco e comunque trasportato immediatamente al laboratorio in regime di refrigerazione. 2. Isolamento del virus. Interpretazione dei risultati. Uno stallone sieropositivo viene considerato eliminatore quando il virus, isolato da almeno uno dei 3 campioni di sperma prelevati a distanza di giorni, viene identificato come virus dell'arterite equina. Uno stallone sieropositivo non è da considerare eliminatore se dai 3 campioni di sperma, di cui al precedente paragrafo, non viene isolato il virus ell'arterite equina.

44 MORVA patologia batterica che interessa i perissiodattili grave zoonosi causata da Burkholderia mallei (previously known as Pseudomonas mallei,yabuuchi et al., 1992) trasmissione avviene tramite contatto diretto, mediante aerosol o,indirettamente, con mangime, acqua o oggetti contaminati. asini e muli sviluppano forma acuta con esito letale cavallo generalmente sviluppa la forma sub-acuta cronica a più lento decorso forma nasale esioni a livello del setto nasale con essudato- purulento interessamento linfonodale sottomascellare forma cutanea farcino morvoso con formazione di noduli a livello del derma forma polmonare In Europa occidentale la malattia è stata eradicata persiste in alcune aree in Asia, Africa e Sud-america (Turchia?) Rischi di introduzione tramite importazioni illecite Non esistono vaccini

45 MORVA Diagnosi sierologica fissazione del complemento Positivi titoli > = 1:5

46 Rinopneumonite Virale (Herpesvirus Equino-EHV) L Herpesvirus Equino (EHV) è un virus che si trova tra gli equini di tutto il mondo. I due ceppi più comuni sono l EHV1 che causa aborto, malattia respiratoria e paralisi e l EHV4 che causa solo malattia respiratoria e occasionalmente aborto. L EHV, per effetto del D.P.R. 320/ Regolamento di Polizia Veterinaria-, è considerata una malattia infettiva soggetta ad obbligo di denuncia. L infezione può essere trasmessa tra cavalli nei seguenti modi: -per via respiratoria -per contatto con feti abortiti o cavalle che hanno abortito membrane fetali e fluidi(sono una fonte particolarmente pericolosa di infezione)

47 Rinopneumonite Virale (Herpesvirus Equino-EHV) Diagnosi sierologica su campioni di sangue/siero: Sieroneutralizzazione Diagnosi virologica su tamponi nasali/organi/liquidi di lavaggio PCR Molto diffusa la somministrazione di vaccini

48 Il Controllo Ufficiale della riproduzione animale Grazie per l attenzione Empoli, Mercoledì 11 Novembre 2015