La malattia di Aujeszky: aspetti diagnostici

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1 La malattia di Aujeszky: aspetti diagnostici Stefano Nardelli Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie Isola della Scala (VR)

2 STORIA (1813) (1902) (1934) prima descrizione USA prurito pazzo Aujeszky identifica l agente infettivo come un virus il virus causale è identificato come Herpesvirus

3 Eziologia Herpesvirus suino tipo 1 (SuHV-1) Sierologicamente unico Ceppi a virulenza variabile Struttura simile all IBR

4 STRUTTURA DEL VIRUS SuHV-1 ENVELOPE gb NUCLEOCAPSIDE DNA ge Altre... Delezione!!! Glicoproteine di membrana proteine virus-specifiche; variabili da ceppo a ceppo inducono anticorpi neutralizzanti

5 Principali glicoproteine del virus di Aujeszky GLICO PROTEINA RUOLO NELLA REPLICAZIONE VIRALE E NELLA VIRULENZA IMMUNITA Essenziale Adsorbimento Penetrazione Diffusione Virulenza Umorale Cellulare B ? ++ + C / D ? E G H ? +? I ? - L ??? Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

6 Spettro d ospite Ospite principale suino (serbatoio!) FORMA NERVOSA (suinetti) FORMA RESPIRATORIA (ingrasso) FORMA GENITALE (scrofe) Ospiti occasionali altri mammiferi molto sensibili: gatto, ovicaprini, bovini moderatamente sensibili: gli altri in genere poco sensibili: primati FORMA NERVOSA (prurito!) CON ESITO LETALE (nb: morte di tali animali indicazione di sospetto)

7 Trasmissione del virus TRASMISSIONE DIRETTA aerosol (la più importante) escreti/secreti via venerea TRASMISSIONE INDIRETTA EVIDENZA DI TRASMISSIONE AEROGENA A LUNGA DISTANZA (DIFFERENZA CON IBR: elevato numero animali?)

8 Patogenesi (nel suino) A partire dalla via di ingresso (di norma oronasale) Forma nervosa nervi olfattori SNC Forma respiratoria torrente circolatorio epiteli respiratori, macrofagi alveolari Forma genitale torrente circolatorio barriera placentare riassorbimento, aborto LATENZA! (nel bulbo olfattorio - ganglio del trigemino) RIATTIVAZIONE!

9 Patogenesi (nel cinghiale) Popolazione selvatica in grado di mantenere autonomamente il virus Tendenzialmente ceppi più attenuati rispetto a quelli isolati nel suino domestico (anche nei confronti di mammiferi diversi dal suino) Possibile ritardo nella sieroconversione (il 45% dei cinghiali con virus nelle tonsille, ma non nei gangli del trigemino, è sieronegativa)

10 Sintomatologia Forma nervosa suinetti incoordinamento, tremori, paralisi treno posteriore morte (specie per animali =< 3 settimane, anche 100%) Forma respiratoria magroni, grassi dispnea, tosse, scolo nasale, starnuti morte (casi limitati), complicanze batteriche Forma genitale riassorbimento (primo terzo di gestazione) aborto (secondo e terzo terzo di gestazione) spesso assente risentimento generale POSSIBILI ANCHE FORME SUBCLINICHE

11 Diagnosi di laboratorio DIRETTA Cervello, tonsille, polmoni, tamponi nasali, feti Isolamento Immunofluorescenza PCR (differenziale per ceppi di campo ge+ / vaccinali ge-) INDIRETTA Siero di sangue Anticorpi totali SN, ELISA Ac tot, ELISA Ac gb Anticorpi ge ELISA Ac ge NB: persistenza Ac materni 2 3 mesi sieroconversione 7 10 gg

12 Perché 57 campioni?

13 Tabella campionamento prevalenza attesa 5% - errore 5% Numero capi In azienda Da controllare 7-27 sino a sino a >

14 Tabella campionamento prevalenza attesa 5% - errore 5% probabilità che UN campione scelto a caso sia positivo = 5% = 0,05 sia negativo = 95% = 0,95 totale = 1,00

15 Tabella campionamento prevalenza attesa 5% - errore 5% probabilità che DUE campioni scelti a caso siano positivo-positivo = 0,05 x 0,05 = 0,0025 siano negativo-positivo = 0,95 x 0,05 = 0,0475 siano positivo-negativo = 0,05 x 0,95 = 0,0475 siano negativo-negativo = 0,95 x 0,95 = 0,9025 totale = 1,0000

16 Tabella campionamento prevalenza attesa 5% - errore 5% probabilità che DUE campioni scelti a caso siano positivo-positivo = 0, siano negativo-positivo = 0, siano positivo-negativo = 0, siano ALMENO UNO positivo = 0,0975 siano negativo-negativo = 0,9025 totale = 1,0000

17 Tabella campionamento prevalenza attesa 5% - errore 5% probabilità che ALMENO UNO di n campioni sia positivo P = 1 - Pneg Pneg = probabilità che TUTTI gli n campioni siano negativi

18 Tabella campionamento prevalenza attesa 5% - errore 5% Pneg - PROBABILITA CHE TUTTI I CAMPIONI RISULTINO NEGATIVI N. campioni Pneg(1) Pneg(2) Pneg(3) Pneg(4) Pneg 1 0,95 0,95 1 = 0,95 = 0,05 PROBABILITA CHE ALMENO UN CAMPIONE RISULTI POSITIVO (1 Pneg) 2 0,95 0,95 0,95 2 = 0,9025 = 0, ,95 0,95 0,95 0,95 3 = 0, = 0, ,95 0,95 0,95 0,95 0,95 4 = 0, = 0, ,95 56 = 0,057 = 0, ,95 57 = 0,053 = 0,947(*) 58 0,95 58 = 0,051 = 0, ,95 59 = 0,048 = 0,952 (*) ARROTONDATO = 0,95

19 Perché troviamo i falsi positivi?

20 Qualsiasi test diagnostico è soggetto a due tipi di errore ESITO FALSAMENTE POSITIVO ESITO FALSAMENTE NEGATIVO E possibile quantificare l errore del test diagnostico definendone Sensibilità diagnostica (Se): probabilità che ha un campione positivo di risultare positivo al test Specificità diagnostica (Sp): probabilità che ha un campione negativo di risultare negativo al test Se, Sp possono assumere un valore compreso fra 0 1

21 ESITO falso pos REAZIONE ELISA COMPETITIVA (PHV-1 ge) Fenomeno dell impedimento sterico SUBSTRATO INCOLORE COLORATO ENZIMA ANTICORPO CONIUGATO ANTI - ge ESITO neg SIERO IN ESAME (positivo Ac gb) Glicoproteina B Glicoproteina E PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS PHV-1

22 Specificità di gruppo (Sp g ) Sp g = Probabilità che, dato un gruppo di n animali veri negativi, cui viene applicato un test con specificità Sp, tutti gli animali del gruppo risultino negativi Sp g = Sp n Quindi, dato un gruppo di 57 scrofe negative Aujeszky che vengono controllate con ELISA ge competitiva avente Sp=0,99, la specificità di gruppo Sp g risulta essere: Sp = 0,99 Sp g = 0,99 57 = 0,56 Nel 44% dei casi almeno uno dei 57 capi risulta falso pos PER OVVIARE: si applicano due test combinandoli in serie

23 Combinando due test diagnostici... E POSSIBILE APPROCCIO IN PARALLELO: rendere massima la sensibilità (l animale è positivo se reagisce ad almeno una delle due prove) ad es. ELISA + SN per ingresso tori centro genetico APPROCCIO IN SERIE: rendere massima la specificità (l animale è positivo se reagisce ad entrambe le prove) ad es. conferma gb su positivi IBR anticorpi totali

24 IPOTIZZANDO L IMPIEGO DI DUE TEST INDIPENDENTI, ENTRAMBI CARATTERIZZATI DA Se = 0,99 Sp = 0,99 Test singolo 2 Test in parallelo ( A + B) 2 test in serie (A B [+]) Se 0,99 0,9999 0,98 Sp 0,99 0,98 0,9999

25 I due test devono essere INDIPENDENTI NEI SUINI NON VACCINATI ELISA (Ac tot, gb) seguita da sieroneutralizzazione ELISA (Ac tot) seguita da ELISA gb NEI SUINI VACCINATI CON DELETO Non esiste (per ora) un secondo test indipendente: i test commerciali sono tutti sostanzialmente strutturati nella stessa maniera

26 Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky: Confronto fra test sierologici ge MONOCLONALI ANTI-gE IZSLER 3E3 4F5 3H1 1D9 2E1 2B6 2A8 2F5 3G12 5A6 3D5 KIT 1 P P P P P P P N N N N KIT 2 P P P N N N N N N N N KIT 3 P P P P P P P N N N N KIT 4 P P P P P P P N N N N KIT 5 P P P P P P N N N N N KIT 6 P P P P P P N N N N N Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

27 Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky: Confronto fra test sierologici ge 117 sieri sperimentali, prodotti attraverso 6 diverse infezioni in suini negativi o vaccinati, sono stati testati con 6 kit commerciali e non per la ricerca anticorpi anti ge Tutti i presieri e i sieri da animali vaccinati sono risultati negativi con tutti i kit Sieri precoci (5-6 g p.i.) hanno dato esito negativo con tutti i test (falsi negativi) Sieri prelevati dai 7-15 g p.i : risultati discordanti Sieri prelevati oltre i 15 g sono stati rilevati come positivi da tutti i kit Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

28 Ag ricombinante REAZIONE ELISA (SuHV-1 ge) SUBSTRATO INCOLORE COLORATO Ag tradizionale ESITO neg ENZIMA ANTICORPO CONIUGATO ANTI - ge ESITO neg SIERO IN ESAME (positivo Ac gb) Glicoproteina B Glicoproteina E PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS SuHV-1

29 Test ELISA con Ag ricombinante Attualmente a livello sperimentale (no kit commerciale) Difficoltà nel produrre l antigene ricombinante Epitopo ge conformazionale Epitopo ge glicosilato ( espressione in vettore eucariota)

30 Ma i positivi isolati sono sempre falsi positivi? UN POSITIVO ISOLATO PUO ESSERE Un falso positivo Un primo positivo (inizio sieroconversione possibile, ma poco probabile) Un ultimo positivo (fase finale eradicazione) Un unico positivo (ceppi a bassa capacità di diffusione Bartha)

31 Ma i positivi isolati sono sempre falsi positivi? In alcuni soggetti è possibile riattivare l infezione con trattamento cortisonico(*) In altri soggetti è possibile identificare la presenza del genoma virale nei gangli del trigemino / bulbi olfattori, MA NON si riesce a riattivare l infezione con trattamento cortisonico ( esperienza svedese) (*) trattamento molto più energico rispetto al bovino mg/kg desametasone x 5 gg SUINO - 0,1 mg/kg desametasone x 5 gg BOVINO

32 Quante volte succede di avere positivi isolati?

33 Sierologia Aujeszky ge - Anno 2010 Veneto + Trentino +Friuli VG N. 306 prelievi con 35 campioni, ripartiti in n. 174 aziende (aziende con consistenza 38 capi) N. 286 prelievi (156 aziende) tutti negativi N. 20 prelievi (18 aziende) almeno un campione positivo 2 prelievi 1 campione positivo (nella stessa azienda!) 2 prelievi 2 campioni positivi 1 prelievo 3 campioni positivi 1 prelievo 4 campioni positivi 14 prelievi 8 campioni positivi

34 Come controlliamo le prestazioni delle prove ELISA?

35 DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 21 febbraio 2008 che stabilisce garanzie supplementari per la malattia di Aujeszky negli scambi intracomunitari di suini, e fissa i criteri relativi alle informazioni da fornire su tale malattia (2008/185/CE)

36 PER L APPROVAZIONE DELLA PROVA La sensibilità della prova deve essere di livello tale da catalogare come positivi i seguenti sieri di riferimento CE: Siero di riferimento CE ADV 1 alla diluizione 1:8 Siero di riferimento CE ADV-gE A Siero di riferimento CE ADV-gE B Siero di riferimento CE ADV-gE C Siero di riferimento CE ADV-gE D Siero di riferimento CE ADV-gE E Siero di riferimento CE ADV-gE F

37 PER L APPROVAZIONE DELLA PROVA La specificità della prova deve essere di livello tale da catalogare come negativi i seguenti sieri di riferimento CE: Siero di riferimento CE ADV-gE G Siero di riferimento CE ADV-gE H Siero di riferimento CE ADV-gE J Siero di riferimento CE ADV-gE K Siero di riferimento CE ADV-gE L Siero di riferimento CE ADV-gE M Siero di riferimento CE ADV-gE N Siero di riferimento CE ADV-gE O Siero di riferimento CE ADV-gE P Siero di riferimento CE ADV-gE Q

38 PER L APPROVAZIONE DEI SINGOLI LOTTI Siero di riferimento positivo CE ADV 1 alla diluizione 1:8 deve risultare positivo Uno dei sieri di riferimento negativi (ADV ge G Q) deve risultare negativo Controllo grossolano

39 RING TEST CENTRO REFERENZA IZSLER 2010/2011

40 DISEGNO DEL RING TEST PANNELLO = 20 SIERI No. 2 = suini neg ac totali (SPF) No. 6 = suini neg ac ge / pos ac totali (vaccinati da 1 a 3x) No. 12 = suini positivi ac tot / ge - 4 = 10 gg PI (suini neg ac tot) - 8 = da 15 a 24 gg PI (suini vacc da 1 a 5x) N. LABORATORI PARTECIPANTI = 21 N. KIT ELISA UTILIZZATI = 4 IZSLER Idexx IdVet - Synbiotics

41 RISULTATI DEL RING TEST SOLO QUATTRO CAMPIONI HANNO DATO RISULTATI DISCORDANTI corrispondono ai 4 prelievi effettuati da suini 10 gg PI (=> esito atteso = positivo) QUESTI QUATTRO CAMPIONI RISULTANO TUTTI POSITIVI ALLA PROVA ELISA gb (eseguita in 9 dei 21 laboratori partecipanti)

42 Aujeszky Aladár medico e veterinario ungherese