USO DEGLI ENZIMI PER PRODURRE AMMINOACIDI E PEPTIDI

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1 USO DEGLI ENZIMI PER PRODURRE AMMINOACIDI E PEPTIDI Biocatalisi sintesi biocatalitica Forma L Asimmetrica Per risoluzione con enzimi idrolitici Forma L e D Aggiunta di ammoniaca al doppio legame di un acido carbossilico α-β-insaturo liasi (es. fumarasi) Idrolisi di esteri alchilici a carbossili mediante esterasi o proteasi Amminazione riduttiva deidrogenasi Idrolisi di ammidi a carbossili mediante ammidasi Idrolisi di gruppi acilici a carbossili mediante acilasi

2 Aspartame: polipeptide ottenuto per biocatalisi Dipeptide Asp-Phe-OMe Acido aspartico (ammino protetto con il gruppo benzilossicarbonilico) Proteasi stereospecifica Fenilalanina metilestere (racemica) Sale cristallizzato

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4 BIOCATALISI: catalisi enzimatica Reazione accelerata da catalizzatori biologici (enzimi isolati o cells integre) Caratteristiche degli enzimi: 1. Chemoselettività: capacità dell enzima di dirigere l azione catalitica su uno specifico gruppo funzionale 2. Regioselettività: capacità dell enzima di dirigere l azione catalitica su uno specifico gruppo funzionale tra uguali gruppi funzionali 3. Stereoselettività e Stereospecificità: capacità di produrre molecole chirali pure sfruttando la stereochimica dell enzima (elevate richieste di dingoli enantiomeri in campo farmaceutico, agroalimentare e dei materiali)

5 Biotrasformazioni: vantaggi vs svantaggi Vantaggi: 1. Elevata selettività 2. Condizioni blande ed ecologicamente compatibili 3. Ottenimento di prodotti naturali partendo da substrati naturali Svantaggi: 1. Bassa stabilità nelle condizioni di operazione 2. Basse rese 3. Basso numero di biocatalizzatori disponibili in commercio 4. Elevati tempi per la messa a punto del processo su scala industriale Ad oggi interesse maggiore nelle sintesi chemoenzimatiche: strategia sintetica che coinvolge passaggi di chimica organica e passaggi di biotrasformazione (generalmente per introdurre la selettività richiesta dal prodotto finale) esempio acido ascorbico.

6 PRODUZIONE DI ACIDO ASCORBICO L-sorbosio Glucosio D-sorbitolo

7 TECNICHE DI BIOTRASFORMAZIONE 1. Enzima isolato VS Cellule intere dipende dalla richiesta di cofattori (costi non sostenibili) e dalla stabilità dell enzima 2. Cells intere: 1. Colture in crescita: solo nella fase di screening variabilità significativa e presenza di metaboliti 2. Cellule non proliferanti: si ottengono per rimozione fase liquida del brodo di fermentazione con aggiunta di una soluzione acquosa con il necesario per garantire l attività enziamtica 1. Cellule secche (liofilizzazione) 2. Cellule permeabilizzate (tensioattivi, antibiotici) enzimi intracellulari 3. Immobilizzazione

8 MIGLIORAMENTO DELLE BIOTRASFORMAZIONI 1. Elevata produttività 2. Conversione molare S/P vicina al 100% 3. Prodotto con elevata purezza chimica e stereochimica

9 ESEMPI DI ENZIMI DI BIOTRASFORMAZIONE: IDROLASI Funzione degradativa di molecole complesse a molecole più semplici da utilizzare a livello metabolico. Esempi: lipasi, esterasi, proteasi, amidasi e glicosidasi. Caratteristiche: 1. Localizzazione extracellulare Enzimi isolati 2. Non richiedono cofattori 3. Stabili e attivi anche in solventi organici IDROLASI Glicosidasi Esterasi Lipasi Es. idrolisi dell'amido miscela di glicosidasi (amilsi, glicosidasi e glucoamilasi)

10 APPLICAZIONI DELLE LIPASI 1. Arricchimento di particolari acidi grassi (es. idrolisi selettiva di acidi grassi polinsaturi a partire da oli di pesce) 2. Produzione di esteri in ambienti a bassa attività di acqua (es. solventi organici, substrati liquidi in eccesso) esempio analogo del burro di cacao ottenuto per esterificazione interna dell olio di palma con l acido stearico 3. Produzione di alcoli, acidi carboossilici ed esteri enantiopuri di interesse farmaceutico 4. Produzione di ammidi e/o ammine enantiopure APPLICAZIONI DELLE ESTERASI 1. Naproxene: antiinfiammatorio non steroideo prodotto da esterasi di Bacillus subtilis 2. Penicillin-acilasi batteriche per la produzione dell acido 6-aminopenicillanico da penicillina G o V

11 ESEMPI DI ENZIMI DI BIOTRASFORMAZIONE: OSSIDOREDUTTASI 1. Deidrogenasi: non utilizzano O2 come accettore, ossidano alcoli, legami C-C, legami C-N e riducono doppi legami (chetoni e aldeidi) e legami insaturi. Proteine di membrana o periplasmatiche. Richiedono cofattori (costi, garantirne la conversione con reazioni accoppiate (substrati o enzimi accoppiati), cells intere o sistemi id rigenerazione elettrochimica o fotochimica). Applicazioni campo farmaceutico (trimegestone (menopausa) e benzodiazepine sintetiche). 2. Ossigenasi: utilizzano l O2 come accettore, degradano idrocarburi in alcoli. Poco regioselettive, poco stabili, richiedono cofattori (no enzimi isolati). Applicazioni farmaceutiche: ipocolesterolemico pravastatina

12 APPLICAZIONI INDUSTRIALI : MODIFICAZIONI DI STEROIDI E STEROLI Principali modificazioni: 1. Idrossilazioni (monossigenasi) 2. Degradazione selettiva catena laterale 3. Riduzioni carbonili Ox alcoli Introduzione doppi legami (deidrogenasi) Limiti: 1. Idrossilazioni multiple non selettive 2. Degradazione non selettiva cicli fusi essenziali per l attività biologica: 1. Modificazione reversibile struttura ciclica per prevenire l attacco 2. Impiego di inibitori specifici enzimi di attacco 3. Impiego di ceppi mutanti privi degli enzimi di attacco

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