PLATELIA CMV IgM TEST

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1 PLATELIA CMV IgM TEST DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI IgM ANTI-CYTOMEGALOVIRUS NEL SIERO O NEL PLASMA UMANO MEDIANTE DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO

2 1. USO PREVISTO Platelia CMV IgM è un dosaggio che utilizza il metodo ad immunocattura per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM anti-cytomegalovirus nel siero o nel plasma umano. 2. INTERESSE CLINICO Il cytomegalovirus umano (CMV) è un virus ubiquitario diffuso in tutte le aree geografiche del mondo e in tutti i gruppi socio-economici. Il CMV appartiene alla famiglia degli Herpesvirus e si trasmette attraverso il contatto con i liquidi biologici (urina, saliva, latte materno, sangue, lacrime, liquido seminale e secrezioni vaginali). Dopo l infezione, il CMV può rimanere latente per numerosi anni nell organismo del soggetto contaminato e talvolta riattivarsi causando infezioni ricorrenti con conseguente potenziale rischio di trasmissione ad altri individui. L infezione primaria si contrae attraverso diverse modalità di trasmissione e in diversi periodi della vita (infezioni congenite, infezioni post-natali). Dopo la fase di latenza, l infezione secondaria può insorgere sia mediante reinfezione attraverso un virus esogeno, sia mediante riattivazione del virus latente. Una percentuale compresa fra il 50 e l'85% della popolazione contrae l infezione prima dell età adulta, ma la maggior parte delle infezioni rimane asintomatica e solo il 2% dei pazienti presenta sintomi atipici quali febbre, astenia, dolori muscolari o articolari. Ciononostante, l infezione da CMV può essere pericolosa se colpisce donne in gravidanza, neonati o pazienti immunocompromessi. Durante la gravidanza, una percentuale compresa tra l 1 e il 3% delle donne contrae il CMV e la trasmissione al feto mediante passaggio transplacentare si osserva nel 40-50% dei casi. Il 95% delle infezioni fetali sono asintomatiche, ma, nel 5% dei casi, le complicazioni sono estremamente gravi: epatosplenomegalia, microcefalia, idrocefalia, prematurità, ritardo psicomotorio e morte fetale. Nel 10% delle infezioni asintomatiche, i neonati presenteranno complicazioni ritardate quali sordità o cecità parziale o totale. Nei pazienti immunocompromessi (AIDS, riceventi di organi, malattie linfoproliferative o cancro), la gravità delle complicazioni è legata all infezione disseminata e/o viscerale: splenomegalia, corioretinite, epatite, polmonite, miocardite, encefalite. In questi pazienti, l infezione può essere fatale. A distanza di alcune settimane dall infezione da CMV, la risposta immunitaria determina la comparsa di anticorpi IgM specifici, seguita alcuni giorni più tardi dalla comparsa di anticorpi IgG specifici. La diagnosi sierologica dell infezione da CMV viene confermata da una sieroconversione o un significativo aumento del titolo di anticorpi IgG. Il rilevamento di anticorpi IgM anti-cmv specifici è utile per confermare la diagnosi di infezioni primarie e infezioni da CMV congenite. 66

3 3. PRINCIPIO Platelia CMV IgM è un test qualitativo per la determinazione degli anticorpi IgM anti-cytomegalovirus nel siero o nel plasma umano mediante immunodosaggio enzimatico con cattura degli anticorpi IgM in fase solida. Gli anticorpi anti-catene µ umane sono adesi alla fase solida (pozzetti della micropiastra). Come coniugato viene utilizzata una miscela dell'antigene CMV e dell'anticorpo monoclonale anti-antigene CMV marcato con perossidasi. Il test prevede le seguenti fasi: Fase 1 I campioni dei pazienti, il calibratore e i controlli vengono diluiti in rapporto 1/21, quindi distribuiti nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, gli anticorpi IgM presenti nel campione si legano agli anticorpi anti-µ adesi ai pozzetti della micropiastra. Gli anticorpi non specifici non legati e altre proteine seriche vengono eliminati dai lavaggi successivi all'incubazione. Fase 2 Il coniugato (miscela di antigene CMV e anticorpo monoclonale anti-cmv marcato con perossidasi) viene aggiunto nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, il coniugato si lega agli anticorpi IgM specifici anti-cmv. Il coniugato non legato viene eliminato dai lavaggi successivi all'incubazione. Fase 3 La presenza di immunocomplessi (Anti-catene µ umane / IgM anti-cmv / Antigene CMV / anticorpo anti-cmv marcato con perossidasi) viene dimostrata attraverso l'aggiunta di una soluzione di sviluppo enzimatica in ogni pozzetto. Fase 4 Al termine del periodo di incubazione a temperatura ambiente (18-30 C), la reazione enzimatica viene bloccata attraverso l'aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N. La lettura della densità ottica ottenuta con uno spettrofotometro impostato su 450/620 nm è proporzionale alla quantità di anticorpi IgM anti-cmv presenti nel campione. 67

4 4. INFORMAZIONI SUL PRODOTTO Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l'esecuzione di 96 test. Tutti i reagenti sono destinati esclusivamente all uso diagnostico in vitro. Marcatura Natura dei reagenti Presentazione R1 Microplate Micropiastra (Pronta per l'uso) : 12 strip con 8 pozzetti divisibili, sensibilizzati con anticorpi anti-catene µ umane 1 R2 R3 Concentrated Washing Solution (20x) Negative Control Soluzione di lavaggio concentrata (20x) : Tampone TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Conservante:< 1,5% ProClin 300 Controllo negativo : Siero umano negativo per anticorpi IgM anti- CMV e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R4 Calibrator Calibratore : Siero umano reattivo per anticorpi IgM anti- CMV e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R5 Positive Control Controllo positivo : Siero umano reattivo per anticorpi IgM anti- CMV e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin 300 R6a Antigen Antigene CMV : Antigene CMV liofilizzato Conservante: < 1,5% ProClin 300 R6b Conjugate (101x) Coniugato (101 x) : Anticorpo monoclonale murino anti-cmv marcato con perossidasi Conservante: < 1,5% ProClin 300 R7 Diluent Diluente per campioni e coniugato : (Pronto per l'uso) : Tampone Tris-NaCl (ph 7,7), siero di vitello fetale, siero di capra, IgG di topo, rosso fenolo Conservante: < 1,5% ProClin x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 6 x qsp 4,5 ml 1 x 0,4 ml 1 x 80 ml 68

5 R9 Marcatura Natura dei reagenti Presentazione Chromogen Cromogeno (Pronto per l'uso): 1 x 28 ml TMB 3,3.5,5 tetrametilbenzidina (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) R10 Stopping Solution Soluzione bloccante (Pronta per l'uso): Soluzione di acido solforico 1N 1 x 28 ml Pellicola adesiva per micropiastre 4 Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza, consultare le indicazioni riportate sulla confezione. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle buone prassi di laboratorio riportate di seguito: Non utilizzare reagenti scaduti. Non mischiare né combinare reagenti provenienti da lotti diversi in una stessa seduta analitica OSSERVAZIONE: per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo etichetta: 20x color verde), il Cromogeno (R9, identificativo etichetta: TMB color turchese) e la soluzione bloccante (R10, identificativo etichetta: 1N color rosso) è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, a condizione che i reagenti siano strettamente equivalenti e venga utilizzato un unico lotto in una stessa seduta analitica OSSERVAZIONE: Inoltre, la Soluzione di Lavaggio (R2, identificazione dell etichetta : 20X di colore verde ) può essere miscelata con le altre 2 soluzioni di lavaggio incluse in vari kit di reattivi Bio-Rad (R2, identificazioni delle etichette : 10x di colore blu o 10x di colore arancione) una volta adeguatamente ricostituite, a condizione che all interno di una seduta analitica venga utilizzata solo una miscela. Prima dell'uso, attendere circa 30 minuti per consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente (18-30 C). Ricostituire o diluire con cura i reagenti evitando contaminazioni. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e di aldeide) o polvere potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica del coniugato. Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure vetreria perfettamente lavata e sciacquata con acqua deionizzata Il lavaggio della micropiastra è una fase essenziale della procedura: eseguire il numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti. 69

6 Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra la fine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino in contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o il cromogeno. La soluzione di cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu indica che il reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà essere sostituito. Utilizzare puntali diversi per ogni campione. Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento delle altre strumentazioni. 70 ISTRUZIONI DI SICUREZZA E IGIENE Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione dei reagenti è stato analizzato e classificato non reattivo per l'antigene di superficie dell'epatite B (HBs Ag), gli anticorpi per il virus dell'epatite C (anti-hcv) e i virus dell'immunodeficienza umana (anti-hiv1 e anti-hiv2). Dato che nessun metodo può garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi, manipolare i reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente infetti. Qualsiasi materiale, comprese le soluzioni di lavaggio, che entri direttamente in contatto con campioni e reagenti contenenti materiali di origine umana deve essere considerato potenzialmente in grado di trasmettere malattie infettive. Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti. Non pipettare con la bocca. Evitare di rovesciare campioni o soluzioni contenenti campioni. Pulire le superfici contaminate con candeggina diluita al 10%. Se il liquido contaminante è un acido, neutralizzare le superfici con bicarbonato di sodio, quindi pulire con candeggina diluita al 10% e asciugare con carta assorbente. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato in un contenitore speciale per rifiuti contaminati. Dopo la decontaminazione, eliminare i campioni dei pazienti, i reagenti contenenti materiale di origine umana, compreso il materiale e i prodotti contaminati mediante uno dei seguenti metodi: - immersione nella candeggina alla concentrazione finale di 5% di ipocloruro di sodio per 30 minuti, - oppure lavaggio in autoclave a 121 C per almeno 2 ore. ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti ipocloruro di sodio nell'autoclave

7 Evitare qualsiasi contatto dei reagenti, compresi quelli considerati non pericolosi, con la pelle e le mucose. La manipolazione e l'eliminazione dei residui chimici e biologici devono essere eseguite attenendosi alle buone prassi di laboratorio. Tutti i reagenti forniti nel kit sono destinati esclusivamente all uso diagnostico in vitro. Attenzione: alcuni reagenti contengono ProClin 300 < 1,5% R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle S28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e Xi - Irritante abbondantemente con acqua e sapone. Indossare guanti adatti 6. PRELIEVO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 1. Il siero e il plasma (EDTA, eparina o citrato) sono i tipi di campione raccomandati. 2. Per la manipolazione, l'elaborazione e la conservazione dei campioni ematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni: Prelevare tutti i campioni di sangue secondo le precauzioni in uso. Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima di procedere alla centrifugazione. Assicurarsi che le provette siano sempre chiuse. Dopo la centrifugazione, separare il siero o il plasma dal coagulo o dai globuli rossi e conservarlo in una provetta chiusa ermeticamente. È possibile conservare i campioni a una temperatura compresa fra 2 e 8 C a condizione che il test venga eseguito entro 7 giorni. Se il test non viene eseguito entro 7 giorni, o per motivi di consegna, congelare i campioni a una temperatura di -20 C o inferiore. Non utilizzare campioni scongelati più di cinque volte. I campioni precedentemente congelati devono essere miscelati bene (Vortex) dopo lo scongelamento e prima del test. 3. I campioni contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina non coniugata, i campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di trioleina (trigliceride) e i campioni sottoposti ad emolisi contenenti fino a 10 g/l di emoglobina non influenzano i risultati. 4. Non riscaldare i campioni. 7. PROCEDURA 7.1 Materiale richiesto, ma non fornito Agitatore tipo Vortex. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 nm e 620 nm (*). Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su 37±1 C (*). 71

8 Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per micropiastre (*). Acqua distillata o deionizzata sterile. Guanti monouso. Occhiali di sicurezza o antispruzzo. Carta assorbente. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml. Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e ml. Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio. Contenitore per rifiuti biologici. Provette monouso. (*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultare il nostro reparto tecnico. 7.2 Ricostituzione dei reagenti R1: Prima di aprire la bustina di plastica, lasciare 30 minuti a temperatura ambiente ( C). Estrarre il vassoio, riporre immediatamente le strip non utilizzate nella bustina e verificare la presenza di essiccante. Richiudere con cura la bustina e conservarla a +2-8 C. R2: Diluire in rapporto 1/20 la soluzione di lavaggio R2 in acqua distillata: ad esempio 50 ml di R2 e 950 ml di acqua distillata per ottenere la soluzione di lavaggio pronta per l'uso. Preparare 350 ml di soluzione di lavaggio diluita per una piastra da 12 strip in caso di lavaggio manuale. R3, R4, R5: Diluire in rapporto 1/21 nel Diluente (R7) (esempio: 15 µl di R µl di R7). R6a: L antigene CMV è liofilizzato. Per l elaborazione di 2 strip, ricostituire un flacone di antigene liofilizzato aggiungendo 4,5 ml di Diluente (R7). Miscelare bene. Dopo la diluizione, la soluzione antigenica (R6a+R7) deve essere perfettamente limpida. R6 (R6a+R6b) - Soluzione di lavoro del coniugato: Aggiungere estemporaneamente 45 µl di coniugato (R6b) in ogni flacone di antigene CMV ricostituito (R6a diluito). La soluzione di lavoro del coniugato deve essere utilizzata immediatamente dopo la ricostituzione. 7.3 Conservazione e validità dei reagenti aperti e / o ricostituiti Il kit deve essere conservato a 2-8 C. Se viene conservato a 2-8 C prima dell'apertura, ogni componente può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta riportata sul kit. 72

9 R1: Dopo l'apertura, le strip mantengono la stabilità fino a 8 settimane, se conservate a 2-8 C nella stessa bustina sigillata (verificare la presenza di essiccante). R2: Dopo la diluizione, la Soluzione di lavaggio può essere conservata per 2 settimane a 2-30 C. La Soluzione di lavaggio concentrata conservata a 2-30 C, in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. R3, R4, R5, R6b, R7: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a 2-8 C mantengono la stabilità fino a 8 settimane. R6 (R6a+R6b): Dopo la ricostituzione, la soluzione di lavoro del coniugato deve essere utilizzata immediatamente. R9: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a 2-8 C mantengono la stabilità fino a 8 settimane. R10: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente conservato a 2-8 C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. 7.4 Procedura Seguire attentamente la procedura descritta di seguito e le buone prassi di laboratorio. Prima dell'uso, consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente ( C). Se si utilizzano pozzetti divisibili, prestare particolare attenzione durante la manipolazione. Utilizzare il calibratore, i controlli negativi e positivi in ogni seduta per convalidare i risultati del test. 1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione per il calibratore, i controlli e i campioni dei pazienti. 2. Preparare la Soluzione di lavaggio diluita (R2) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 4. Diluire il calibratore (R4), i controlli (R3, R5) e i campioni dei pazienti (S1, S2 ) nel Diluente (R7) per ottenere una diluizione in rapporto 1/21: 15 µl di campione e 300 µl di Diluente (R7) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. Vortexare i campioni diluiti. 5. Distribuire in ogni pozzetto 200 µl di calibratore, di controlli diluiti e di campioni dei pazienti secondo lo schema riportato di seguito: 73

10 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 7. Preparare la soluzione di lavoro del coniugato R6 (R6a+R6b) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 8. Al termine del primo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 9. Distribuire 200 µl della soluzione di lavoro del coniugato (R6) in tutti i pozzetti. Agitare leggermente la soluzione prima dell'uso. 10. Ricoprire la micropiastra con la pellicola sigillante adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra in un bagnetto termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 11. Al termine del secondo periodo di incubazione, rimuovere il nastro sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 12. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µl di Cromogeno (R9). Far sviluppare la reazione al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente (18-30 C). Non utilizzare nastri sigillanti adesivi durante questo periodo di incubazione. 74

11 13. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µl di Soluzione bloccante (R10) in ogni pozzetto. Utilizzare la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione utilizzati per la soluzione di sviluppo. 14. Asciugare accuratamente il fondo della piastra. Leggere la densità ottica a 450/620 nm mediante un lettore nei 30 minuti successivi alla reazione. Non esporre le strip alla luce prima della lettura. 15. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la lettura e il piano di distribuzione delle piastre e dei campioni. 8. CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 8.1 Calcolo del valore soglia (cut-off) (CO) Il valore di Cut-Off (CO) corrisponde al valore medio delle densità ottiche (DO) dei duplicati del Calibratore (R4): CO = media di DO R4 8.2 Calcolo del rapporto Campione Il risultato per un campione viene espresso sotto forma di rapporto mediante la seguente formula: Rapporto Campione = DO campione/co 8.3 Controllo di qualità Includere il calibratore e tutti i controlli in ogni micropiastra e per ogni seduta di lavoro e analizzare i risultati ottenuti. Per la validazione del test, è necessario che siano soddisfatti i seguenti criteri: Valori delle densità ottiche: CO > 0,200 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 1 < 1,20 x CO 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 2 < 1,20 x CO (La singola DO di ogni duplicato del calibratore (R4) non deve differire più del 20% dal valore CO). Rapporti delle densità ottiche: Rapporto R3 (DO R3 / CO) < 0,50 Rapporto R5 (DO R5 / CO) > 1,60 Se non vengono rispettati i criteri del controllo di qualità, la seduta analitica dovrà essere ripetuta. 75

12 8.4 Interpretazione dei risultati Rapporto campione Risultato Interpretazione Rapporto < 0,90 Negativo Il campione è considerato non reattivo per la presenza di anticorpi IgM anti-cmv. 0,90 Rapporto < 1,10 Equivoco Il campione è considerato equivoco per la presenza di anticorpi IgM anti-cmv. Il risultato deve essere confermato da un altro test eseguito su un secondo campione prelevato ad almeno 3 settimane di distanza dalla data della prima analisi. Rapporto 1,10 Positivo Il campione è considerato reattivo per la presenza di anticorpi IgM anti-cmv. In caso di sospetta infezione recente, potrebbe essere utile condurre ulteriori test sierologici, come la determinazione dell avidità degli anticorpi IgG, per confermare la diagnosi. 8.5 Guida alla risoluzione dei problemi Le reazioni non convalidate o non ripetibili spesso sono causate da: Lavaggi della micropiastra inadeguati. Contaminazione dei campioni negativi tramite siero o plasma con alto titolo di anticorpi. Contaminazione della soluzione di sviluppo tramite agenti chimici ossidanti (candeggina, ioni metallici...). Contaminazione della Soluzione bloccante. 9 EFFICACIA Le prestazioni del kit Platelia CMV IgM sono state valutate in 2 siti su un totale di 824 campioni di donne in gravidanza e donatori di sangue. 9.1 Prevalenza La prevalenza degli anticorpi IgM anti-cmv mediante il test Platelia CMV IgM è stata determinata su di un pannello di 300 campioni di donne in gravidanza provenienti dalla regione parigina (Francia). 5 campioni sono risultati positivi per gli anticorpi IgM anti-cmv. La prevalenza determinata mediante il test Platelia CMV IgM si attesta intorno al 1,7% (5/300). 9.2 Specificità La specificità relativa è stata determinata su di un pannello di 740 campioni provenienti da 2 siti in Francia e ripartiti come segue: 252 sieri di donatori di sangue 488 sieri di donne in gravidanza 76

13 I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti mediante due testi EIA, considerati metodo di riferimento. Popolazione analizzata / sito Sito 1 Sito 2 Donne in gravidanza Donatori di sangue Donne in gravidanza Numero di sieri Negativo Equivoco Positivo Specificità ,0% [96,5 99,9] (203/205) 98,8% [96,6 99,7] (249/252) 99,7% [98,1 100,0] (282/283) 99,2% Totale [98,2 99,7] (734/740) I resultati equivoci sono stati considerati positivi per il calcolo de la specificita [IC 95%] = intervallo di confidenza 95%. 9.3 Sensibilità La sensibilità relativa è stata determinata su di un pannello di 113 campioni provenienti da 2 siti in Francia e ripartiti come segue: 35 campioni da 16 pazienti con una cinetica tipica di infezione primaria (centro 2) 49 campioni da 3 pannelli di sieroconversione commerciali (centro 1) 29 campioni singoli positivi per anticorpi anti-cmv IgM (centro 1) I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti mediante due testi EIA, considerati test di riferimento. Dei 35 campioni CMV di primo-infezione, la presenza di anticorpi IgM è stata rivelata in 29 campioni usando i diversi metodi. Tutti questi 29 campioni avevano anticorpi IgG anti-cmv con bassa avidità. 2 campioni sono risultati positivi per anticorpi IgM con il test di riferimento, ma non con il Platelia CMV IgM. Questi 2 campioni presentavano anticorpi IgG anti-cmv con avidità intermedia e risultavano essere campioni prelevati un poco dopo l inizio della infezione. I risultati ottenuti su 3 pannelli di sieroconversione sono stati i seguenti: Per un pannello, il Kit Platelia CMV IgM ha rilevato la presenza di anticorpi IgM anti-cmv 10 giorni prima rispetto al test di riferimento. Per un pannello, la rivelazione di anticorpi IgM anti-cmv è stata simultanea (dubbio con il test di riferimento e positivo con il Platelia CMV IgM) 77

14 Per un pannello, il Kit Platelia CMV IgM ha rivelato la presenza di anticorpi IgM anti-cmv 3 giorni più tardi rispetto al test di riferemento (dubbio con il test di riferimento e negativo con il Platelia CMV IgM). In conclusione 28 dei 29 campioni singoli sono stati confermati positivi con il Kit Platelia CMV IgM e un campione è stato considerato dubbio. 9.4 Reattività crociata Un pannello di 156 campioni costituito da 115 campioni positivi per Toxoplasmosi, Rosolia, EBV, HSV, VZV, Orecchioni, Morbillo e HIV e 41 campioni positivi per il fattore reumatoide, auto-anticorpi, anticorpi eterofili e da campioni di pazienti affetti da mieloma è stato testato con il test Platelia CMV IgM e un test EIA per lo screening degli anticorpi IgM anti-cmv. Fra questi campioni, solo 2 sono risultati positivi con il Kit Platelia CMV IgM: 1 siero positivo per IgG anti-rubella e negativo con il test di riferimemnto, 1 siero con fattore reumatoide e concordante con il test di riferimento. 9.5 Precisione Precisione intra-saggio (ripetibilità): Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, un campione negativo e tre campioni positivi sono stati analizzati 30 volte durante la stessa seduta analitica. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni: Precisione intra-saggio (ripetibilità) N=30 Campione negativo Campione debolmente positivo Campione positivo Campione fortemente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Media 0,11 1,13 1,90 3,75 DS 0,01 0,07 0,09 0,09 % CV 11,4% 6,2% 4,8% 2,3% Precisione inter-saggio (riproducibilità): Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, tutti e quattro i campioni (uno negativo e tre positivi) sono stati analizzati in duplicato in due sedute analitiche al giorno per un periodo di oltre 20 giorni. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni: 78

15 Precisione inter-saggio (riproducibilità) N=80 Campione negativo Campione debolmente positivo 10. LIMITI DELLA PROCEDURA La diagnosi dell'infezione da CMV può essere stabilita solamente sulla base di una combinazione di dati clinici e biologici. Il risultato di un singolo test di titolazione degli anticorpi IgM anti-cmv non costituisce una prova sufficiente per una diagnosi di infezione recente da Cytomegalovirus. Solo una combinazione di dati clinici e biologici (significativo aumento degli anticorpi IgG anti-cmv in 2 sieri prelevati da uno stesso paziente a distanza di 3 settimane e analizzati in una stessa seduta analitica, presenza di un livello significativo di IgM anti-cmv, determinazione di IgG a bassa avidità) può confermare la diagnosi di un infezione recente. La sola presenza di anticorpi IgM anti-cmv non costituisce una prova sufficiente per confermare un infezione recente poiché gli anticorpi IgM possono persistere per numerosi mesi o persino per anni dopo l infezione. In presenza di IgM, è necessario eseguire una determinazione quantitativa degli anticorpi IgG anti-cmv, nonché un controllo dell evoluzione degli anticorpi anti-cmv su almeno un secondo campione prelevato tre settimane più tardi. Se un campione viene analizzato troppo precocemente durante una primoinfezione, gli anticorpi IgM anti-cmv potrebbero non essere ancora presenti. In caso di dubbio, è necessario eseguire un secondo prelievo circa 3 settimane più tardi sul quale verrà ripetuta la ricerca delle IgM. 11. CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è conservata presso Bio-Rad. 12. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI Vedere la versione Inglese. Campione positivo Campione fortemente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Media 0,18 1,06 1,76 3,28 DS 0,041 0,11 0,18 0,30 % CV 22,5% 9,9% 10,3% 9,1% 79

16 12. REFERENCES 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S Demmler G.J Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: Revello M.L., Gerna G Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306:

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