Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

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1 Protecting and improving the nation s health Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE Batteriologia I B 44 I Emissione no: 2 I Data emissione: I Pagina 1 di 35 Crown copyright 2016

2 Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico Ringraziamenti Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i revisori medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Ringraziamo anche il dottor Atkins Bridget della Bone Unit Infection, Nuffield Orthopaedic Centre, Oxford e lo UK Standards for Microbiology Investigation Working Group for Clinical Bacteriology per il loro notevole apporto specialistico Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ standards@phe.gov.uk Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare Website: Numero di accesso alle pubblicazioni PHE: Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di: I loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione : Pagina: 2 di 35

3 Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico Contenuti RINGRAZIAMENTI... 2 TABELLA MODIFICHE... 4 SMI RU: SCOPO E OBIETTIVO... 6 SCOPO DEL DOCUMENTO... 9 INTRODUZIONE... 9 INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE PROCEDURA DI REFERTAZIONE NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE APPENDICE: RICERCA CON COLTURA SU IMPIANTO ORTOPEDICO ASSOCIATO A INFEZIONI BIBLIOGRAFIA NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio Informazioni più dettagliate sull accreditamento possono essere consultate: Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione : Pagina: 3 di 35

4 Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico Tabella delle Modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@phe.gov.uk I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità. Modifica No/data. 4/ Emissione eliminata. no 1.3 Emissione inserita no. 2 Sezione(i) interessate Intero documento. Scopo. Introduzione. Informazione tecnica/limitazioni. Considerazioni sulla sicurezza Modifica Titolo cambiato in 'Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico. Bibliografia completamente aggiornata. Aggiunti i dispositivi di fissaggio ai tipi di campione. Scopo di applicazione aggiornato in accordo al nuovo titolo e all'utilizzo delle tecniche molecolari. Ri-strutturato e semplificato per chiarezza. L informazione relativa ai tipi di campione, campionamento, procedura sul campione e metodi molecolari è stata inserita e aggiornata (in precedenza presente nelle Informazioni Tecniche / Limitazioni). Incluso il cut-off per il conteggio dei globuli bianchi del liquido sinoviale per le infezioni acute e croniche della protesi ortopedica. Sezione sulle tecniche rapide ampliata per includere MALDI-TOF MS. Inclusa informazione sulla sonicazione. Nei casi di revisioni elettive la colorazione Gram non deve essere considerata per la diagnosi di infezione. Si raccomandano la coltura del brodo di carne cotta o l emocoltura con monitoraggio continuo fino a 5 giorni, in alcuni casi prolungate fino a 14 giorni. Inclusa Informazione sulla sonicazione, varianti piccole delle colonie, contaminazione ed effetto dell'uso degli antibiotici. Evitare strumenti taglienti, ove possibile. Aghi siringhe sono disponibili per l'uso con flaconi per la coltura del sangue. Idealmente l analisi dovrebbe essere effettuata in una cabina di Classe II. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione : Pagina: 4 di 35

5 Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico Se possibile, interrompere la somministrazione di antibiotici 2 settimane prima di un intervento chirurgico. Prelievo del campione L uso dei tamponi non è consigliato. Nelle sale operatorie dovrebbero essere prelevati campioni multipli (da 3 a 5). Trasporto e conservazione del campione L IDSA (Infectious Diseases Society of America) raccomanda che i campioni siano trattati entro 2 ore. Idealmente l analisi dovrebbe essere effettuata in una cabina di Classe II. In alcune situazioni possono non essere richieste piastre primarie. L arricchimento in brodo di coltura/emocoltura deve essere incubato per 5 giorni, (in determinate situazioni esteso a 14 giorni). Incluso metodo per conteggio totale e differenziale dei leucociti. Aggiornata tabella dei terreni di coltura, condizioni e microrganismi: Processo/procedura sul campione. Terreni standard o AAE (agar anaerobi esigenti), lettura a 3 e 5 giorni. o Uso di sistema per emocoltura con monitoraggio continuo o Incubazione del brodo fino a 5 giorni, estendibile in alcune occasioni fino a 14 giorni.. Terreni supplementari o Agar Sabouraud, incubare per 14 giorni. Aggiunta di tecniche moleculari (NAAT). Identificazione gli isolati devono essere conservati almeno per 2 settimane. Test di sensibilità antimicrobica aggiornato per ottenere antibiogrammi estesi. Aggiornata per includere i conteggi totali e differenziali dei leucociti. Procedura di refertazione Aggiornata refertazione della coltura per adeguamento al nuovo modello operativo. Aggiunta refertazione della ricerca molecolare. Appendice Aggiornata la sezione Coltura, condizioni e microrganismi. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione : Pagina: 5 di 35

6 Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico SMI del RU # : Scopo e Obiettivo Utilizzatori delle SMI Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione Informazioni di Base per le SMI Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova. La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le attività di ricerca e di sviluppo Collaborazione Paritaria La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.l'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione. Assicurazione di Qualità Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte dall Ottobre del La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si # Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione : Pagina: 6 di 35

7 Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti ell accreditamento con la promozione di procedure d elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Queste stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI. Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno. Coinvolgimento del Paziente e della Comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l accesso libero al nostro sito web. Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili La PHE è un organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti. Dichiarazione Legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI da un operatore finale, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche e anche essere a conoscenza che la PHE e le organizzazioni partecipanti non si assumono alcuna responsabilità per tali modifiche. Per evitare ogni altro equivoco, poiché le SMI sono state sviluppate per l'applicazione all'interno del RU, Il rischio di qualsiasi applicazione al di fuori di questo territorio sarà a carico dell'utente. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell ente accreditato NICE. I diritti d autore delle SMI sono della Crown e questi dovrebbero essere riconosciuti quando appropriato. Citazione suggerita per questo documento Public Health England. (2016). Investigation of orthopaedic implant associated infections. UK Standards for Microbiology Investigations. B 44 Emissione 2. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione : Pagina: 7 di 35

8 Ricerca su infezioni associate a impianto ortopedico Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione : Pagina: 8 di 35

9 Scopo del Documento Tipo di campione Aspirato da protesi articolari. biopsia periprotesica, campioni intra-operatori (sbrigliamento e ritenzione o revisione della protesi), protesi, dispositivi di fissaggio Questa SMI descrive la ricerca microbiologica delle infezioni associate all impianto ortopedico e include informazione sulle tecniche molecolari. Per informazioni sui campioni d osso e tessuto associati all osteomielite, fare riferimento alla B 42 Investigation of bone and soft tissue associated with osteomyelitis. Questa SMI deve essere usata con le altre SMI Introduzione Dopo la prima sostituzione dell anca, effettuata nel RU nei primi anni 60 dal pioniere Sir John Charnley, la sostituzione delle articolazioni (artroplastica) è divenuta una procedura diffusa. Questo intervento è eseguito più frequentemente per osteoartrite ed artropatie infiammatorie quali l artrite reumatoide. Per le fratture dell anca, una delle opzioni nel trattamento chirurgico precoce è l emiartroplastica. Le sostituzioni dell anca e del ginocchio sono più frequenti rispetto a quelle della spalla, gomito, caviglia e delle articolazioni interfalangee 1. Le Sostituzioni bilaterali per osteoartrite sono frequenti nelle articolazioni che sopportano carichi e quelle articolari multiple sono frequenti solitamente nell artrite infiammatoria. L intervento di revisione è eseguito dopo il fallimento articolare (di solito per allentamento o lussazione recidivante) e la maggior parte di loro sono 'asettici'. Circa il 15% delle revisioni sono dovute ad allentamento 'settico 2. Fattori di rischio per infezione 3,4 Le percentuali d infezione sono ora molto inferiori rispetto a quando la sostituzione delle articolazioni era stata inizialmente introdotta. Persiste comunque ancora un rischio associato a ciascuna procedura. Questo è valutato in circa 1-2% per sostituzioni elettive dell anca e ginocchio ed è maggiore per operazioni di emergenza traumatica quale l emiartroplastica 5,6. Il rischio d infezione in una sostituzione dell'articolazione è aumentato da fattori riguardanti il paziente inclusi lo sviluppo precoce di un'infezione della sede chirurgica che apparentemente non sembra coinvolge la protesi; una valutazione della National Healthcare Safety Network (NHSN) assegna uno score di rischio di uno su due per presenza di neoplasie o precedente artroplastica 3,7,8. Il riscontro della NHSN comprende sia fattori chirurgici sia quelli correlati ai pazienti, come durata dell'intervento, grado di contaminazione della ferita e condizione di salute preoperatoria del paziente 8. Altri co-fattori di rischio, come immunosoppressione, diabete, insufficienza renale, malattie cardiache o polmonari, fumo e obesità aumentano il rischio di infezione postoperatorio, prolungano il tempo di drenaggio postoperatorio della ferita e favoriscono la formazione di ematomi 9. La sorveglianza delle infezioni del sito chirurgico può essere utilizzata come mezzo di prevenzione di queste infezioni che sono associate a notevole morbilità e prolungata degenza ospedaliera 10,11. Patogenesi e microbiologia 4 I microrganismi possono essere introdotti nell articolazione durante l'intervento di impianto chirurgico primario, per via ematogena (circolatoria) o per contaminazione postoperatoria della ferita 12. Questi possono causare infezioni acute o croniche. In presenza di corpo estraneo l infezione in situ è causata da una concentrazione batterica minore rispetto alle altre. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 9 di 35

10 Lo Staphylococcus aureus (meticillina sensibile o resistente) è il microrganismo più frequente che causa infezioni acute e nelle infezioni croniche lo sono sia lo S. aureus che stafilococchi coagulasi negativi. Si stima che fino al 30% di batteriemia da S. aureus possa essere associata ad artrite settica in soggetti con protesi articolare pre-esistente 12. Numerosi altri microrganismi possono essere introdotti per inoculo diretto o per via ematogena, compresi quelli della flora cutanea, streptococchi, coliformi, enterococchi e raramente anaerobi, micobatteri o fungi 5,13,14. Una volta insediata l'infezione in una protesi articolare, i microrganismi possono formare un 'biofilm' 15. I batteri possono secernere sostanze extracellulari per produrre un complesso glicocalice, talvolta particolarmente strutturato, nel quale sono immersi. In queste popolazioni batteriche, che possono essere polimicrobiche, alcuni microrganismi, si moltiplicano lentamente o per nulla, altri possono anche acquisire una condizione simile al letargo. Il biofilm deve essere disaggregato per isolare i microrganismi in coltura ed ottenere la diagnosi microbiologica d infezione 16. E molto difficile uccidere i batteri prigionieri all interno del biofilm, ed è pertanto arduo eradicare l infezione senza rimuovere la protesi. Se questa è mantenuta in sede, si utilizzeranno antibiotici efficaci nei confronti dei microrganismi presenti all interno di questa struttura, ma la sensibilità ottenuta con i metodi standard non è predittiva dell attività antimicrobica richiesta 17. I modelli di prova dell attività in vitro degli antimicrobici nei confronti dei batteri presenti nei biofim non sono attualmente disponibili presso i laboratori di routine. Esordio clinico Le infezioni delle protesi articolare possono esordire in modo acuto, di solito con sviluppo di calore, gonfiore e dolore articolare. Spesso il paziente è febbrile e può sviluppare manifestazioni cliniche di tipo settico. Di solito sono aumentati in modo significativo gli indici infiammatori come la proteina C reattiva (PCR) e la velocità di eritrosedimetazione (VES) 17. Questa sintomatologia deve essere differenziata dalle artriti infiammatorie acute quali artrite reumatoide, gotta, o pseudogotta e pure dall ematoma acuto (ematico) dell articolazione. Diversamente, le infezioni dell articolazione possono manifestarsi in forma cronica. L articolazione può essere semplicemente dolente e rigida. Alla radiografia può manifestarsi allentamento della protesi. Gli indici infiammatori possono essere lievemente aumentati, ma anche questi non sono specifici 17. Queste manifestazioni cliniche sono spesso difficili da differenziare dal dolore di tipo meccanico o dalla mobilizzazione asettica 18. La presenza di fistola secernente è comunque indice di infezione profonda della protesi. Diagnosi L insorgenza acuta dell infezione della protesi articolare, oltre ad una completo controllo clinico del paziente, può richiedere l emocoltura e il prelievo di un aspirato articolare. L'ecografia può aiutare e chiarire se è presente liquido nell articolazione stessa. Il liquido sinoviale può essere chiaramente purulento o semplicemente torbido. Si possono eseguire semplici radiografie per verificare mobilizzazione precoce, frattura o altre patologie. Semplici radiografie possono evidenziare una mobilizzazione, ma non differenziare la forma settica da quella asettica. Nelle protesi articolari cronicamente infette, la diagnosi è molto più difficile. Un anamnesi pregressa di precoce infezione della ferita post-operatoria aumenta la probabilità di infezione profonda. Se i cambiamenti sono rapidamente progressivi, l'infezione è più probabile. La radiologia nucleare può avere importanza diagnostica, ma le scansioni possono essere aspecifiche o tecnicamente difficili da eseguire. La MRI (Magnetic Resonance Imaging) e la CT (computerised tomography sono raramente utili. Gli indici infiammatori possono essere solo moderatamente aumentati e non sono né specifici né sensibili. Le colture da secrezione della fistola non sono utili poiché i microrganismi isolati non sono predittivi dell agente causale dell infezione profonda 19. Le prove più specifiche per il rilievo del l infezione sono l aspirato articolare per il conteggio cellulare, l esame colturale e istologico, o la biopsia Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 10 di 35

11 periprotesica articolare per la microbiologia a l istologia (usando gli ultrasuoni o altre immagini dinamiche). Poiché i microrganismi possono essere ancorati al biofilm (invece che planctonici e dispersi nel liquido, la sensibilità dell aspirato articolare può essere scarsa. Tipi di campione Aspirazione articolare percutanea Questo è un campione diagnostico importante per verificare le infezioni articolari acute e croniche. E eseguita in modo asettico, preferibilmente in radiologia o nelle sale chirurgiche. Nelle infezioni acute, è utile la colorazione Gram, sebbene un risultato negativo non escluda la possibilità d infezione. Nelle infezioni croniche la sensibilità della colorazione Gram è <10% 20,21. Il conteggio semi-quantitativo dei leucociti presenti nel liquido sinoviale è utile per differenziare le artriti infiammatorie dalle non infiammatorie; è comunque meno utile per differenziare l'infezione dall infiammazione 2. Il conteggio totale delle cellule del liquido sinoviale può essere utile in alcune condizioni cliniche Per la diagnosi di infezione della protesi articolare, in alcuni studi è stato definito il valore soglia del conteggio totale e quello differenziale dei leucociti presenti nel liquido sinoviale 25,26. I valori soglia erano compresi fra 1100 cellule/µl e più di 4000 cellule/µl 24, L intervallo di differenziazione dei leucociti neutrofili era compreso fra il 64% e 80% 24, Questi valori soglia sono inferiori a quelli riscontrati nei casi di artrite settica 27,28.La specificità e la sensibilità variano rispettivamente da 82 a 98% e 84-97% 24, Nei pazienti con malattia infiammatoria soggiacente, i conteggi possono essere elevati anche in assenza di infezione. Quando appropriato, il liquido sinoviale dovrebbe essere esaminato per la ricerca di cristalli. Può anche essere considerata la biopsia sinoviale. I valori soglia per l'infezione acuta della protesi articolare che si manifesta entro sei settimane dall intervento chirurgico, come concordato al proceedings of the international consensus meeting on periprosthetic joint infections (con notevole consenso), sono: conteggio dei globuli bianchi del liquido sinoviale (CGB)> cellule/µl percentuale polimorfo nucleati nel liquido sinoviale (PMN%)> 90% Il valore soglia approssimativo per l'infezione cronica della protesi articolare, applicabile ai test effettuati più di sei settimane dopo il più recente intervento chirurgico, sono di seguito riportati 26 : conteggio dei globuli bianchi liquido sinoviale (CGB)> cellule/µl percentuale di neutrofili del liquido sinoviale (PMN%)> 80% Le brodocolture di arricchimento sono importanti in quanto al paziente possono essere già stati somministrati antibiotici, e nei casi cronici il numero di microrganismi liberi (planctonici) può essere molto ridotto. In presenza di una protesi articolare, qualsiasi microrganismo sviluppato in coltura può essere rilevante e dovrebbe essere identificato, con esecuzione delle prove di sensibilità ed essere refertato. Molte infezioni croniche sono causate dalla "flora cutanea". Per questo motivo, nel campione ottenuto da un aspirato, è difficile differenziare l infezione dalla contaminazione. Inoltre la sensibilità di un aspirato da infezione cronica può essere scarsa. Potrebbe essere presa in considerazione una biopsia del tessuto peri-protesico con incluso l esame l'istologico. Biopsia percutanea Con il supporto dell ecografia od altri sistemi ad immagine continua, quale la fluoroscopia, si può prelevare una biopsia peri-protesica. In teoria, se la protesi è mobile, la biopsia potrebbe essere prelevata dall interfaccia del cemento osseo o da quella dall osso con la protesi. Questa tecnica Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 11 di 35

12 presenta un vantaggio rispetto al solo ago aspirato, permettendo di evidenziare i neutrofili all accertamento istologico, e può essere eseguita se si neseguono biopsie multiple. Biopsia intraoperatoria Nelle infezioni cronicizzate della protesi infetta le biopsie intra-operatorie possono essere eseguite esclusivamente a scopo diagnostico, come parte di una procedura di sbrigliamento e di ritenzione, o per revisione dell articolazione. Quest ultima è una procedura frequente, eseguita di solito per la mobilizzazione asettica. L infezione può non essere evidente, comunque in tutti i casi è opportuno prelevare campioni multipli per l accertamento microbiologico ed istologico. Quando possibile, in alcuni casi, questi possono essere associati all esame sul preparato istologico congelato per aiutare a prendere una decisione chirurgica,32. Protesi espiantate Le protesi espiantate possono essere inviate per le indagini microbiologiche. Sono spesso difficili da gestire se non si usano contenitori particolarmente grandi che comportano un maggiore rischio potenziale di contaminazione. Alcuni laboratori sottopongono a sonicazione le protesi e seminano la coltura del fluido sonicato. Questa procedura può essere eseguita in aggiunta ai campioni multipli, ma non sostituirli. Quando usata, la sonicazione aggiunta alla coltura convenzionale, ha dimostrato di migliorare la sensibilità della diagnosi microbiologica dell infezione della protesi articolare Si utilizzano gli ultrasuoni per distruggere il biofilm batterico presente sul materiale protesico. Il miglioramento della sensibilità è più facilmente osservato nei pazienti in terapia antibiotica nei 14 giorni precedenti l intervento chirurgico 33,36. Campionamento Nei casi in cui si rimuove l articolazione, dovrebbero essere prelevati campioni di liquido, pus, sinovia, tessuto di granulazione, membrana (tessuto che si forma all'interfaccia osso-cemento o osso-protesi) e ogni eventuale area anomala. Ciascun campione deve essere prelevato con un set separato di strumenti, e inserito in un contenitore separato. Per questo motivo possono essere predisposte confezioni pre-sterilizzate. A questo punto può anche essere eseguito, se disponibile e necessario, un accertamento su sezione congelata, per decidere tra la sostituzione in una o due fasi. Nei centri in cui è disponibile la sonicazione, la protesi, od i suoi componenti, possono essere inviati al laboratorio in un contenitore impermeabile sterile. Procedura sul campione 37,38 I campioni possono essere trasferiti al laboratorio utilizzando i tempi di routine (vale a dire in poche ore piuttosto che minuti). In ambiente ortopedico, non sono disponibili pubblicazioni di confronto o validazioni dei diversi metodi e procedure di manipolazione dei tessuti. Il metodo di scuotimento con palline di vetro è relativamente semplice, comporta un basso rischio di contaminazione e ha dimostrato sperimentalmente di essere superiore al solo scuotimento in brodo per il recupero di spore di Bacillus dalle superfici dei polimeri 39. I risultati di uno studio suggeriscono che l'uso di perline di vetro per l esame microbiologico intra-operatorio dei campioni periprotesici intra operatori può effettivamente essere un utile aggiunta alla coltura convenzionale perché aumenta le percentuali della diagnosi microbiologica con una frequenza di contaminazione relativamente bassa 40. La sonicazione dei componenti rimossi è stata valutata come mezzo di frammentazione del biofilm batterico delle protesi vascolari ed ortopediche 41. E stato ora effettuato un considerevole numero di studi confrontando la sonicazione della protesi in un contenitore sterile con le colture Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 12 di 35

13 convenzionali 18, Diversi centri hanno ora adottato questo metodo nella loro routine 1, Microscopia e colture 49 Nei casi di revisione elettive per la diagnosi di infezione, la colorazione di Gram non deve essere considerata in quanto ha scarsa sensibilità 20,21,26,50,51. La colorazione di Gram può comunque essere utilizzata nelle infezioni acute per differenziare tra aggregati di batteri staccati dai biofilm con ultrasuoni da altri detriti e batteri contaminanti 21. Questi possono apparire come singole cellule o in gruppi molto piccoli. Tuttavia, la colorazione Gram negativa, non esclude l'infezione. Le colorazioni di Gram false positive associate alle infezioni periprotesiche sono rare, ma possono avere gravi conseguenze se utilizzate come base per il trattamento 20. Una ricerca ha valutato le false colorazioni intraoperatorie Gram-positive nella diagnosi di infezione riportando rispettivamente una sensibilità e specificità del 9% e 99% 20. Un altro studio ha concluso che la colorazione Gram ha un'applicazione limitata per quanto riguarda l infezione dei dispositivi ortopedici, riportando rispettivamente sensibilità e specificità del 7% e del 92% 52. I metodi di coltura dovrebbero includere un brodo di arricchimento. Il brodo di carne cotta e quelli con monitoraggio continuo dei sistemi automatici per emocoltura (MCSAE), hanno una sensibilità equivalente, e sono più sensibili delle piastre di agar per anaerobi esigenti in infezioni collegate a presidi ortopedici 38, Automazione 55 Alcuni laboratori con un numero significativo di campioni di dispositivi ortopedici hanno scelto di utilizzare l'automazione con (MCSAE) per ridurre il lavoro e la subcoltura precoce della brodo dalla coltura 38,53. Durata della coltura Tradizionalmente i campioni ortopedici sono stati coltivati per un massimo di cinque giorni. Più recentemente i risultati hanno suggerito che può essere necessario isolare microrganismi meno virulenti, quali propionibatteri e difteroidi con incubazione prolungata a 14 giorni 26, I metodi descritti omettono qualsiasi sottocoltura precoce se non per brodi torbidi. Il controllo visivo dei brodi non è molto accurato; molte positività precoci sono state perse e il tempo per il rilevamento può dipendere dalla frequenza con cui sono controllate le culture 61. Alcuni metodi che usano brodo di arricchimento richiedono incubazione per 14 giorni, tuttavia, con il protocollo che si avvale dell uso del vortex con perline sterili e arricchimento in brodo di carne cotta con subcoltura terminale dopo 5 giorni, la sensibilità del brodo di arricchimento dopo 5 giorni era quasi equivalente alla sensibilità ottenuta con due emocolture (aerobiche ed anaerobiche) nonostante fosse stato utilizzato un inoculo inferiore per il brodo. Se si utilizzata un set di flaconi aerobi e anaerobi per l'arricchimento, il controllo delle loro caratteristiche da parte dell operatore-ricevente (COR) ha dimostrato che non è necessaria un incubazione superiore a 5 giorni 38,55. L'automazione completa utilizzando flaconi per emocoltura (MCSAE) suggerisce che> 98% dei risultati significativi sono segnalati entro 3 giorni 55. Questa SMI raccomanda pertanto la coltura fino a 5 giorni utilizzando brodo di carne o sistemi di emocoltura con monitoraggio in continuo 41,55,62. Tuttavia, nei casi di sospetta infezione della protesi articolare, con microrganismi a bassa virulenza, o dove le culture pre-operatorie non sono riuscite a dimostrare la crescita e il quadro clinico è coerente con l'infezione della protesi articolare, la coltura può essere prolungata a 14 giorni 26,63,64. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 13 di 35

14 Interpretazione dei risultati La definizione dei microrganismi come indistinguibili in campioni separati può essere difficile. Uno o due differenze in un antibiogramma esteso possono non sempre indicare ceppi di diversa origine clonale. Inoltre, si può riscontrare infezione della protesi con più ceppi 2. È importante eseguire test di sensibilità su tutti gli isolati da tutti i campioni in quanto l'antibiogramma esteso è un modo semplice ed economico per identificare ceppi indistinguibili nelle colture multiple e il riscontro di ceppi resistenti influenzerà l'esito della terapia. I microrganismi possono essere coltivati nel 60-70% dei campioni prelevati da protesi ritenute infette 2. Poiché i microrganismi che causano l'infezione cronica della protesi articolare sono spesso gli stessi che contaminano i campioni microbiologici, l interpretazione dei risultati è difficile quando sono prelevati solo uno o due campioni. Quando sono prelevati cinque campioni, la percentuale di falsi positivi con due o tre campioni positivi è <5%, mentre la percentuale riscontrata di falsi positivi è quasi il 30% con un solo campione positivo 2. La crescita di un microrganismo indistinguibile in due o più campioni manifesta sensibilità del 71% e specificità del 97%. Il riscontro di un microrganismo indistinguibile da tre campioni manifesta sensibilità del 66% e specificità del 99.6%. Ottenere i microrganismi da un singolo campione di tessuto pone quindi significative difficoltà d interpretazione. Anche con un'attenta campionatura e culture prolungate, si manifesta ancora una significativa percentuale di colture negative, anche quando l esame l'istologico è positivo. Ciò può essere dovuto a un errore di campionamento (distribuzione dei microrganismi può essere irregolare), esiguo numero di organismi che non si sviluppano nelle condizioni di coltura di laboratorio, l'incapacità di separare i microrganismi dal biofilm, microrganismi non coltivabili o risultati istologici falsi positivi. Studi con Immunofluorescenza e molecolari suggeriscono che, in alcuni casi, possono essere presenti microrganismi anche quando le culture tradizionali sono negative 2. Tecniche rapide Sierologia Le tecniche sierologiche utilizzate per la diagnosi di infezione della protesi articolare sono state studiate nel contesto della ricerca, ma non sono ancora ritenute di pratica utilità clinica. Il problema tende ad essere imputabile alla specificità 65. Metodi molecolari 27,66 Tecniche di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT nucleic acid amplification test) Le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici NAAT (es. PCR) per l'identificazione di batteri, funghi, parassiti e virus da campioni clinici hanno dimostrato di essere particolarmente specifiche e sensibili. I target della PCR sono i geni conservati del genoma, che permettono la rapida identificazione dei microrganismi, compresi quelli a lenta crescita o di quelli non coltivabili. I risultati sono disponibili in breve tempo soprattutto se si utilizza la PCR multiplex real-time. I saggi NAAT tra cui PCR, 16s rrna gene PCR e la ionizzazione PCR-elettrospray (ESI) / MS sono stati sviluppati come metodi di identificazione rapida, sensibile per microrganismi associati alle infezioni delle protesi articolari La PCR ha dimostrato di essere più sensibile della coltura convenzionale per l'isolamento di alcuni microrganismi esigenti, come ad esempio Kingella kingae, e la PCR-ibridazione dopo sonicazione ha dimostrato di migliorare la diagnosi delle infezioni connesse agli impianti 46,74. Sono tuttavia presenti alcuni problemi con l'analisi NAAT. Una ridotta Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 14 di 35

15 sensibilità può essere osservata a causa del ridotto volume dei campioni processati, in alcuni casi si possono verificare interferenze con il DNA umano proveniente da campioni di tessuto, e non sono disponibili informazioni sulla sensibilità agli antibiotici 17,75. Gli sviluppi futuri potrebbero includere l'associazione della vasta disponibilità di PCR con la nuova generazione di sequenziamento che consente l'analisi del microbioma totale presente nell impianto ortopedico associato alle infectioni 71. MALDI-TOF spectrometria di massa 76,77 I recenti sviluppi nella identificazione di batteri e funghi includono l'uso di profili proteici ottenuti con il Matrix assisted laser desorption ionisation time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry 76. I picchi di massa ottenuti dai ceppi saggiati sono confrontati con quelli dei ceppi di riferimento noti. E 'possibile identificare un microrganismo da un isolato in breve tempo ed il metodo è sempre più usato nei laboratori in quanto fornisce un robusto sistema d identificazione 67. Per la diagnosi di infezione associata alle protesi ortopediche, sono disponibili dati limitati sull'uso del MALDI-TOF MS; tuttavia, una ricerca ha dimostrato che questo può essere un utile strumento diagnostico per identificare gli isolati da pazienti con infezioni associate agli impianti ortopedici, fornendo un identificazione affidabile a livello di specie che può essere utilizzata per differenziare i contaminanti dai patogeni 78. Informazione tecnica/limitazioni Limitazioni dellesmi del RU Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house siano stati validati e siano idonei allo scopo Contenitori per campione Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE per descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a questi scopi''. Sonicazione 4,27,37 I batteri Gram-positivi sono stati riconosciuti resistenti all azione degli ultrasuoni; i microrganismi Gram negativi possono essere più sensibili 48. L'effetto della sonicazione sui funghi e specie Mycobacterium è sconosciuto. Si può incorrere nel rischio di contaminazione del fluido sottoposto a sonicazione durante il prelievo o la procedura eseguita sul campione. Particolare cura deve essere presa nella fase di apertura e chiusura del coperchio del contenitore, per garantire che non venga in contatto con la Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 15 di 35

16 superficie interna del coperchio. La contaminazione è di solito segnalata da uno scarso numero di batteri ambientali. Varianti a colonie piccole 82,83 Se si utilizzano le piastre primarie, queste devono essere esaminate con ingrandimento poiché dai campioni profondi possono essere isolate piccole varianti delle colonie di stafilococchi 83. Queste possono essere evidenti nelle colture solo dopo prolungata incubazione 84. Gli autotrofi timidina dipendenti di solito non crescono su agar sangue e su agar cioccolato assumono un aspetto coloniale atipico, simile a quello degli emofili o degli streptococchi 85. La vera prevalenza e rilevanza clinica delle forme con colonie piccole nelle infezioni delle protesi articolari non e stata definita. Contaminazione Le ripetute sottoculture dal brodo di arricchimento durante l'incubazione possono portare a contaminazione; l'uso di flaconi per emocoltura con monitoraggio continuo riduce questo rischio 38. Effetto dell uso di antibiotici Nei casi in cui una protesi articolare è cronicamente dolente, mal funzionante e/o allentata, è richiesta una revisione elettiva. I pazienti non devono essere in terapia antibiotica da almeno 2 settimane 33,86,87. Uno studio di confronto tra la coltura dei campioni di periprotesi-tessuto ottenuti dopo esposizione agli ultrasuoni e quella convenzionale, ha dimostrato che la sensibilità di entrambi i metodi è ridotta nei pazienti sottoposti a terapia antibiotica nei 14 giorni precedenti l intervento chirurgico 33. L'effetto di una singola dose di antibiotico sulla sensibilità della coltura microbiologica è sconosciuto e, se il sospetto di infezione è ridotto, la tempestiva somministrazione di antibiotici profilattici è fondamentale (cioè nei minuti prima incisione cutanea) 82. Il momento per la somministrazione della profilassi antibiotica è una decisione rischio-beneficio. La revisione artroplastica comporta la rimozione della protesi e lo sbrigliamento articolare ed è seguita dal re-impianto. Il re-impianto può o non può essere eseguito durante la stessa operazione. Nei pazienti con una nota infezione articolare cronica o in un paziente con evidente infezione (presenza di pus) riscontrato durante l intervento, l'opzione preferita in molti centri è quello di rimuovere l articolazione e fare un sbrigliamento completo senza immediato re-impianto. Questa è definita 'prima fase' di una revisione a due stadi. In alcuni centri, in casi selezionati tuttavia, la revisione in una sola fase è portata a termine anche in presenza di infezione 88,89. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 16 di 35

17 1 Considerazioni sulla sicurezza 79,80, Prelievo, trasporto e conservazione del campione 79,80,90-93 Porre attenzione per evitare traumatismi accidentali quando si utilizzano taglienti. Ove possibile, dovrebbe essere evitato l'uso di questi strumenti. Sono disponibili in commercio confezioni sterili di siringhe senza ago e dispositivi per il trasferimento asettico del sangue che possono essere utilizzati per la semina di campioni omogeneizzati in flaconi per emocoltura. Usare tecnica asettica Inserire i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marchiatura CE e trasportarli in sacchetti sigillati di plastica sterili. E essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti. 1.2 Procedura sul campione 79,80, Livello di Contenimento 2. Tutte le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza 96. Per ridurre il rischio di contaminazione del campione e per proteggere l'operatore, in teoria, l'analisi microbiologica dovrebbe essere effettuata in cabina microbiologica di Classe II, con tecnica asettica, 38,49. Fare riferimento alle vigenti linee guida sulla sicurezza per la manipolazione di tutti i microrganismi riportati in questa SMI. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio 2 Prelievo del Campione 2.1 Tipo di campione Aspirato da protesi articolari, campioni intra-operatori (sbrigliamento, e ritenzione o revisione chirurgica), protesici, dispositivi di fissaggio 2.2 Tempo ottimale e metodo di prelievo 105 Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1. Prelevare i campioni prima della terapia antimicrobica, se possibile 105. Se possibile, interrompere la terapia antibiotica due settimane prima dell intervento e considerare di non somministrare la profilassi pre-chirurgica fino a campionamento eseguito 33,86,87. Raccogliere i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marcatura CE e inserirli in sacchetti di plastica sigillati. Per consentire una gestione clinica tempestiva, i campioni devono essere processati con urgenza. L'uso dei tamponi deve essere scoraggiato. Tuttavia, se inviati, i tamponi per la coltura batterica e fungina devono essere inseriti in terreno di trasporto adeguato e trasporti in sacchetti di plastica sigillati. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 17 di 35

18 2.3 Quantità adeguata e numero appropriato di campioni 105 Per gli aspirati e le biopsie guidate radiologicamente è di solito è possibile inviare un campione alla microbiologia. Nelle sale operatorie le campionature multiple (quattro a cinque campioni) devono essere effettuate utilizzando strumenti separati per i campioni microbiologi. Una serie equivalente deve essere prelevata per l'esame istologico. La dimensione del campione dovrebbe essere di circa 1 ml. Piccoli volumi di liquido sinoviale (<1 ml) possono ostacolare l'isolamento dei microrganismi. Il numero e la frequenza della raccolta del campione dipendono dalle condizioni cliniche del paziente. 3 Trasporto e Conservazione del Campione 79, Condizioni Ottimali di Trasporto e Conservazione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1 I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile 105. Le linee guida della Diseases Society of America (IDSA) raccomandano che i campioni siano trasportati a temperatura ambiente, e trattati immediatamente, comunque entro un massimo di 2 ore 105. Se la procedura è ritardata la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura ambiente Processo/Procedura sul campione 79, Selezione della prova N/D 4.2 Aspetto N/D 4.3 Preparazione del Campione I campioni non ripetibili dovrebbero avere la priorità. Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione Pretrattamento Campioni di tessuto molle L obiettivo è quello di ridurre al minimo la manipolazione e il numero di aperture di ciascun contenitore, in modo di contenere la possibilità di contaminazione del campione. Per le sale operatorie delle le unità operative che richiedono numerosi esami colturali potrebbe essere considerata la fornitura di contenitori impermeabili con marchiatura CE contenenti circa 10 microbiglie e 5 ml di soluzione di Ringer o normale soluzione fisiologica per sala operatoria. Non è infrequente, comunque, che i contenitori del campione per la microbiologia ed istologia siano confusi causando difficoltà nella procedura operativa del campione. Il prelievo delle biopsie in sala Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 18 di 35

19 chirurgica può diminuire il rischio di contaminazione durante le procedure di laboratorio. In questo caso l omogeneizzazione può essere eseguita nel contenitore originale. In alternativa, il campione può essere inviato al laboratorio in un contenitore impermeabile con marchiatura CE senza microbiglie. Microbiglie, soluzione di Ringer o fisiologica possono essere aggiunte in laboratorio, osservando diligentemente l asepsi. In teoria, la procedura sui campioni dovrebbe essere eseguita in cabina microbiologica di Classe II 38,49. L omogeneizzazione con le microsfere può essere ottenuta, per esempio, con agitazione a 250 rpm per 10 minuti in un portaprovette coperto ed un agitazione circolare, o, in alternativa, con vortex per 15 secondi (40 Hz). (possono essere usati metodi alternativi di omogeneizzazione) 32. Per diluire le microsfere di vetro e i tessuti si dovrebbe utilizzare la soluzione di Ringer o soluzione fisiologica. Se si devono eseguire analisi molecolari utilizzare acqua sterile per questo tipo di analisi e i nuovi contenitori per PCR di uso comune.. Per mantenere la sensibilità della prova il volume usato non deve superare 2 ml. Opzionale N/D Trattamento dei campioni Per ridurre il rischio di contaminazione del campione e per proteggere il l operatore, l'analisi microbiologica deve essere effettuata in cabina microbiologica di Classe II, se disponibile, con tecnica asettica 38,49. Seminare le piastre e il brodo dopo omogeneizzazione dei campioni dei tessuti molli e delle protesi, o direttamente con il liquido aspirato. Inoculare una goccia di soluzione in ciascuna piastra di agar (se utilizzato) con una pipetta sterile (consultare Q 5 - Inoculation of culture media for bacteriology). Possono non essere richieste piastre primari per revisioni elettive, nelle unità ad elevato volume e campionamento da sedi multiple. Inoltre, seminare parte della soluzione in brodo di arricchimento. Se sono necessarie colture per micobatteri, questa soluzione può quindi essere utilizzata per la loro semina. Questa è preferibilmente eseguita dopo 24 ore, quando sono state lette le piastre primarie, per decidere se è necessaria la decontaminazione del campione. Per informazioni riguardanti le condizioni di incubazione e la sua durata, fare riferimento a B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species. Incubare il brodo di arricchimento per 5 giorni (in alcune condizioni la coltura può essere prolungata a 14 giorni), esaminando giornalmente per l accertamento della crescita 26. Eseguire le sottocolture se il brodo assume aspetto torbido, in caso contrario, eseguire la sottocoltura finale dopo 5 giorni. In alternativa al brodo di arricchimento, i campioni possono essere incubati in un sistema di coltura automatico per emocoltura con monitoraggio continuo per 5 giorni (protratto a 14 giorni in determinate situazioni) 26,38,55,62,64. Eseguire sottocoltura solo per flaconi segnalati come positivi, non richiesta la subcoltura terminale a 5 giorni. Per l'isolamento di colonie singole diffondere l'inoculo con un'ansa sterile. Se seminate, le piastre primarie devono essere esaminate con ingrandimento per rilevare le varianti piccole delle colonie 83,84. Prestare attenzione per distinguere i piccoli frammenti di tessuto presenti sulla piastra dalle piccole colonie. Le varianti a piccole colonie sono spesso timidinadipendenti se al paziente è stato somministrato cotrimossazolo. Questi isolati non possono crescere in modo adeguato su agar sangue di cavallo a causa della loro lisi parziale e del rilascio di timidina fosfochinasi dai globuli rossi. Il riscaldamento utilizzato per produrre agar cioccolato distrugge la timidina fosfochinasi. Batteriologia B 44 Emissione no: 2 Data emissione: Pagina: 19 di 35