IL RUOLO DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE

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1 IL RUOLO DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE Anna Barbui S.C. Microbiologia e Virologia U Città della Salute e della Scienza di Torino Torino 15 maggio 2018

2 RISULTATI DI 13 ANNI DI ATTIVITÀ ( )

3 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO AOU - CDSS- S.C. Microbiologia e Virologia U Laboratorio ospedaliero: Esami urgenti di primo livello Ricerca mediante PCR agenti batterici meningite liquor Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Laboratorio di riferimento Microbiologia CDSS Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae Tipizzazione molecolare di H.influenzae Stoccaggio e spedizione ceppi

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5 Diagnosi di laboratorio delle meningiti: I punti FONDAMENTALI corretta raccolta dei campioni clinici non esiste un esame di laboratorio con affidabilità, rapidità,sensibilità, specificità ottimali UTILIZZARE SEMPRE TUTTI I TEST DI LABORATORIO DISPONIBILI: Esame chimico- fisico Esame microscopico Esame colturale (liquor e sangue) Ricerca antigeni (liquor e urina) PCR (in laboratori adeguatamente attrezzati) tutte le metodiche in PCR per target batterici devono essere considerate di impiego esclusivamente epidemiologico mancandone l adeguata validazione clinica. (PDM AMCLI 2008)

6 Diagnosi di laboratorio delle meningiti: I punti FONDAMENTALI: cosa è cambiato corretta raccolta dei campioni clinici non esiste un esame di laboratorio con affidabilità, rapidità,sensibilità, specificità ottimali UTILIZZARE SEMPRE TUTTI I TEST DI LABORATORIO DISPONIBILI: Esame chimico- fisico Esame microscopico Esame colturale (liquor e sangue) Ricerca antigeni (liquor e urina) PCR (in laboratori adeguatamente attrezzati) Sono disponibili test molecolari rapidi di facile esecuzione anche in urgenza, ma che devono essere utilizzati con appropriatezza e valutati nel contesto clinico

7 FILMARRAY PCR Multiplex per Patogeni meningite/encefalite Risultati disponibili in poco più di 1 ora

8 FILMARRAY PCR Multiplex per Patogeni meningite/encefalite Laboratorio Microbiologia e Virologia U - CDSS Da gennaio 2017: 460 test patogeni identificati negativi 92% positivi 8% 14 casi controllati con real time PCR singole (parametri non suggestivi) SP: 1 caso non confermato NM: 1 caso non confermato

9 Diagnosi di laboratorio delle meningiti: I punti FONDAMENTALI: cosa è cambiato corretta raccolta dei campioni clinici non esiste un esame di laboratorio con affidabilità, rapidità,sensibilità, specificità ottimali UTILIZZARE SEMPRE TUTTI I TEST DI LABORATORIO DISPONIBILI: Esame chimico- fisico Esame microscopico Esame colturale (liquor e sangue) Ricerca antigeni: SCONSIGLIATA PCR: se unico parametro positivo da confermare con test molecolare alternativo

10 Ricerca del DNA batterico con real time PCR Test di conferma (laboratorio di riferimento) Real time PCR multiplex MICRORGANISMI IDENTIFICATI: Neisseria meningiditis Streptococcus pneumoniae Haemophylus influenzae Escherichia coli Klebsiella spp Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes In caso di sospetto clinico per altri patogeni è possibile allestire test per la ricerca di MTB complex, microrganismi agenti di sepsi e sequenziamento regione 16rRNA del genoma batterico

11 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO AOU - CDSS- S.C. Microbiologia e Virologia U Ricerca mediante PCR agenti batterici meningite - liquor PCR negativa 51% S.pneumoniae 25% N.meningitidis 14% Altro 2% Listeria 2% H.influenzae 3% S.agalactiae 3% con PCR: Diagnosi/Conferma 49% dei casi

12 Ricerca mediante PCR agenti batterici meningite liquor Microrganismi identificati nei 386 liquor inviati dal 2005 al Negativo S.pneumoniae N.meningitidis H.influenzae S.agalactiae Listeria Altro

13 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO AOU - CDSS- S.C. Microbiologia e Virologia U Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Da gennaio 2009: 117 Tipizzazioni Ceppi NM 78 DNA Liquor/sangue B C W-135 Y 29E NT

14 Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Andamento % della distribuzione dei sierotipi B C W Y

15 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO AOU - CDSS- S.C. Microbiologia e Virologia U Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae La capsula è il principale fattore di virulenza Di distinguono circa 90 antigeni capsulari Circa un quarto sono frequentemente causa di malattia invasiva Si utilizzano: Pool di antisieri (n.12): checkerboard Antisieri di gruppo (n. 21) Antisieri di tipo (n. 25) Antisieri fattoriali (n.64)

16 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae n.147 Ceppi di S. pneumoniae isolati da sangue o liquor in pazienti da 0 a 14 anni di età periodo Vaccinazione 13 V

17 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae n. 147 Ceppi di S. pneumoniae isolati da sangue o liquor in pazienti da 0 a 14 anni di età periodo Sgr. NON vaccinali Sgr. 13 V 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Vaccinazione 13 V

18 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae Distribuzione sierotipi nella popolazione pediatrica 22F 19F NT 6B 23F 19A 3 7F 14 1 BAMBINI N. 62 ceppi pre-vaccino F 11A 8 BAMBINI N. 50 ceppi post-vaccino A NT 19A 3 7F 12F

19 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae n.1043 Ceppi inviati di S. pneumoniae isolati da sangue o liquor in pazienti ADULTI (>14 anni di età) periodo Tipizzati 980 ceppi Sgr. NON vaccinali Sgr. 13 V % % 60% 40% 20% 0%

20 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae Confronto della distribuzione sierotipi nella popolazione adulta e pediatrica 8 3 ADULTI N Ceppi 1 19A 18A 6A 4 7F 22F NT 14 12F 1 14 BAMBINI N. 147 ceppi 10A NT 19A 3 7F 12F 8

21 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae Confronto della distribuzione sierotipi nella popolazione adulta e pediatrica 8 3 ADULTI N Ceppi 1 19A 18A 6A BAMBINI N. 62 ceppi pre-vaccino 4 7F 22F NT 14 12F BAMBINI N. 50 ceppi post-vaccino B 23F 22F 19F NT 19A 3 7F F 11A 10A F NT 19A 3 7F

22 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae n.1043 Ceppi adulti: variazioni distribuzione sierotipi più rappresentati F 14 22F 7F 4 6A 18A 19A V 9N 23F 5 6B NT NV

23 Sierotipizzazione ceppi Streptococcus pneumoniae n.147 Ceppi pediatrici: variazioni distribuzione sierotipi più rappresentati F 7F 3 19A 10A 11A 19F 22F 23F 6B 15B NT NV

24 Sensibilità ceppi Streptococcus pneumoniae S I/R 7,4 12 3,4 3, ,9 2,1 1,8 92, ,6 96, ,1 97,9 98,2 adulti bambini adulti bambini adulti bambini adulti bambini PENICILLINA CEFTRIAXONE ERITROMICINA LEVOFLOXACINA

25 Percentuale di resistenza ceppi di S. pneumoniae (circa 800 ceppi) Penicillina 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0, Penicillina Ceftriaxone Eritromicina Levofloxacina

26 Percentuale di resistenza ceppi di S. pneumoniae (circa 800 ceppi) Eritromicina 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0, Penicillina Ceftriaxone Eritromicina Levofloxacina

27 Sensibilità ceppi Streptococcus pneumoniae SIEROTIPO % DEI CEPPI % Eritromicina = R/I 3 11% 8.9% % 3.4% % 25.3% 19 A 3.4% 8.9% 6 A 3.0% 10.2% 33F 1.4 % 8.9%

28 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO AOU - CDSS- S.C. Microbiologia e Virologia U Tipizzazione molecolare di Haemophilus influenzae PCR multiplex da campione o da ceppo Identificazione/conferma di H. influenzae (gene ompp2) Presenza della capsula (gene bexa) Identificazione dei sierogruppi con primers specifici per a, b, c, d, e, f

29 Tipizzazione molecolare di Haemophilus influenzae Non capsulato B F E NT Da gennaio 2012: 80 ceppi o campioni di liquor con PCR apr-18 sepsi 69% meningite 19% polmonite 11% altro 1%

30 QUALI CAMPIONI DI LIQUOR DEVO INVIARE? I campioni di Liquor di cui si sospetti una eziologia batterica (meningite primitiva) con test microbiologici negativi (microscopico, antigeni batterici, PCR e coltura) I campioni di Liquor di cui si sospetti una eziologia batterica (meningite primitiva) con microscopico e/o antigeni positivi e coltura negativa I campioni di Liquor di cui si sospetti una eziologia batterica (meningite primitiva) con PCR positiva e coltura negativa: in caso di NM ed HI è possibile identificare il sierotipo mediante l analisi del DNA Nel caso di campioni di Liquor con sospetta meningite è possibile eseguire altri test: ricerca del DNA batterico di specie diverse con sequenziamento ricerca del DNA di MTB complex ricerca dell antigene e del DNA di Aspergillus spp ricerca del DNA fungino di specie diverse con sequenziamento ricerca dell antigene o del DNA di Criptococcus spp Ricerca acidi nucleici virali

31 COME DEVO CONSERVARE I CAMPIONI DI LIQUOR? Conservazione del campione Conservare a 4 C Non congelare Mantenere le condizioni di sterilità Se si centrifuga il campione: non inviare il surnatante, risospendere ed inviare tutto.

32 COME DEVO INVIARE I CAMPIONI DI LIQUOR? Quantità di campione Ideale 1 ml Minimo 200 ul Compilare l allegato 2 Dati anagrafici necessari: Cognome Nome Data di nascita Luogo di nascita (CF) + E possibile inviare i campioni dal lunedi al venerdi dalle 8 alle 15 Non è necessario telefonare preventivamente

33 COME RICEVERO I RISULTATI? Il laboratorio esegue i test richiesti in ore dal ricevimento del campione Possono essere necessari test di conferma che richiedono più tempo E emesso un referto che viene inviato via mail al SeREMI Il SeREMI inoltra i referti ai referenti delle ASL o AO Il costo dei test è a carico del laboratorio di Riferimento Per i campioni di liquor, se la ricerca del DNA batterico o altri test di approfondimento hanno significato diagnostico e sia necessario allegarli alla documentazione clinica deve essere inviata la richiesta per la prestazione vistata dalla direzione sanitaria.

34 QUALI CEPPI BATTERICI DEVO INVIARE? Ceppi di S. pneumoniae N. meningitidis H. influenzae L. monocytogenes Isolati da siti sterili (sangue, liquor, liquidi cavitari, biopsie, ecc.) COME DEVO CONSERVARE I CEPPI DA INVIARE? Conservare i ceppi a temperatura ambiente in busta CO 2. Questi ceppi sono molto delicati: se non è possibile inviarli effettuare sottocolture ogni 24 o al massimo 48 ore. Non conservare le colture in frigo

35 COME DEVO INVIARE I CEPPI BATTERICI? Inviare sottocolture recenti (per Sp 24 ore) Preferibilmente non inviare i ceppi il venerdì e prefestivi Accompagnare il ceppo con copia dell allegato 2 completo di tutte le informazioni richieste Compilare l allegato 2 Dati anagrafici necessari: Cognome Nome Data di nascita Luogo di nascita (CF)

36 CLINICI DIALOGO ISTITUZIONI LABORATORI OSPEDALIERI LABORATORI DI RIFERIMENTO MIGLIORAMENTO DISPONIBILITA Corretta raccolta dei campioni clinici Rafforzare il ruolo dei laboratori nella diagnosi eziologica Corretta gestione dei campioni da inviare per analisi successive Rispondere alle esigenze dei clinici e dei laboratoristi Valutazione delle problematiche della sorveglianza epidemiologica

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