METABOLISMO DEI COMPOSTI AZOTATI

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1 METABOLISMO DEI COMPOSTI AZOTATI

2 CATABOLISMO DEI COMPOSTI AZOTATI Tutti gli organismi possono convertire l NH 3 in composti organici azotati, sono invece molti di meno gli organismi che possono sintetizzare l NH 3 a partire da azoto molecolare N 2 o dallo ione nitrato. Quindi l azoto organico è da considerarsi una RISORSA LIMITATA e quindi è opportuno pensare in termini di economia dei gruppi amminici. Azoto (N 2 ) 78.0 % Ossigeno (O 2 ) 20.9 % Argon (Ar) 0.9 % Altri gas 0.1 % Oltre a questi gas l'atmosfera può contenere grandi quantità di vapore acqueo (fino al 4 %),

3 FABBISOGNI PARTICOLARI PER LIMITATA DISPONIBILITA Un adulto ben nutrito è in EQUILIBRIO DI AZOTO o possiede un NORMALE BILANCIO DELL AZOTO Dietologi: grammi assunzione giornaliera A.A. essenziali V 1 = V 2 V 1 V 2 DIETA AZOTO org. CATABOLISMO A.A. insufficienti SINTESI catabolismo Proteine corporee

4 CATABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI

5 DESTINO METABOLICO DEI GRUPPI AMMINICI FEGATO animali ammoniotelici (vertebrati acquatici e larve anfibi) citosol mitocondri Animali ureotelici (vertebrati terrestri) Animali uricotelici (uccelli e rettili)

6 ESCREZIONE DELL AZOTO AMMONIOTELICI Le specie acquatiche che eliminano l azoto come ammoniaca UREOTELICI Gli animali terrestri che eliminano l azoto sotto forma di urea URICOTELICI Uccelli e rettili che eliminano l azoto come acido urico Negli organismi ureotelici l ammoniaca accumulata nei mitocondri degli epatociti è convertita in urea mediante il CICLO DELL UREA.

7 Ingresso di una proteina nello stomaco stimola secretina cellule adelomorfe pepsinogeno autoattivazione pepsina Attiva a ph acido autocatalisi ormone colecistochinina

8 PRIMA TAPPA: TRANSAMMINAZIONE Il piridossal fosfato partecipa al trasferimento dei gruppi amminici all -chetoglutarato transamminasi Il risultato è quello di raccogliere i gruppi amminici che derivano da diversi amminoacidi in un unico composto: L-glutammato. Le diverse transamminasi sono specifiche per l - chetoglutarato come accettore del gruppo amminico e differiscono per la specificità dell amminoacido donatore, da cui traggono il loro nome (alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, ecc.). Sono tutte reazioni facilmente reversibili. Tutte hanno come gruppo prostetico il PIRIDOSSAL FOSFATO (PLP).

9 PIRIDOSSAL FOSFATO Lys metil aspartato

10 DIAGNOSTICA CLINICA L aspartato aminotransferasi (AST, detta anche glutammato-ossalacetato transaminasi, GOT) e l alanina amminotransferasi (ALT; detta anche glutammato-piruvato transamminasi o GPT) sono importanti markers diagnostici. AST o S-GOT glutammato + ossalacetato -chetoglutarato + aspartato ALT o S-GPT Glutammato + piruvato -chetoglutarato + alanina Enzimi abbondanti nel cuore e nel fegato, vengono rilasciati dalle cellule in conseguenza di un danno cellulare come quello che può verificarsi nell infarto del miocardio, nelle epatiti infettive ed in altri danni a carico di questi organi.

11 L AMMONIACA SI FORMA DAL GLUTAMMATO NEL FEGATO Negli epatociti il glutammato viene trasportato dal citosol ai mitocondri dove viene sottoposto a DEAMMINAZIONE OSSIDATIVA. La GLUTAMMATO DEIDROGENASI è presente solo nella matrice mitocondriale. Enzima allosterico costituito da 6 subunità identiche. L azione combinata delle amminotransferasi e della glutammato deidrogenasi viene detta TRANSDEAMMINAZIONE.

12 a.a. + -chetoglutarato chetoacido + glutammato Glutammato + NAD(P) + + H 2 O -chetoglutarato + NAD(P)H + H + + NH4 + a.a. + NAD(P) + + H 2 O -chetoacido + NAD(P)H + H + + NH 4 + Il processo netto è la deaminazione di un aminoacido e la formazione del chetoacido corrispondente, con produzione di ammoniaca. Dopo che è stato rimosso l azoto, lo scheletro carbonioso può procedere verso l ossidazione nel ciclo di Krebs, oppure può essere utilizzato per la biosintesi dei carboidrati, a seconda dello stato fisiologico dell organismo.

13 CATABOLISMO DEGLI AMINOACIDI 10, 15% dell energia totale 20 processi catabolici che convergono verso la formazione di 5 prodotti CO 2 e H 2 O BIOSINTESI

14 LA GLUTAMMINA TRASPORTA L AMMONIACA ATTRAVERSO IL SANGUE Nella maggior parte dei tessuti Forma di trasporto non tossica dell ammoniaca Fonte di gruppi amminici per reazioni di biosintesi NH 4 che si forma dalla degradazione dei nucleotidi L azoto amminico viene rilasciato solo a livello dei mitocondri epatici (meno in quelli renali). Nel fegato questa reazione rappresenta un ulteriore fonte di NH 4 che deve essere eliminata mediante la sintesi dell urea. I reni normalmente ricevono poca glutammina, se non in condizioni di acidosi. L NH 4 che si libera dalla glutamminasi viene escreto direttamente nelle urine, formando sali con gli acidi metabolici. La decarbossilazione dell -chetoglutarato nel ciclo dell acido citrico produce bicarbonato che andrà a tamponare il sangue.

15 CICLO DEL GLUCOSIO ALANINA Alanina come trasportatore di gruppi amminici in forma non tossica e di scheletro carbonioso del piruvato dal muscolo al fegato. Anche il lattato viene trasportato dal muscolo al fegato. MUSCOLO IN ATTIVITÀ ANAEROBICA Alanina: degradazione aminoacidi Piruvato e lattato: dalla glicolisi Il ciclo del glucoso-alanina e il ciclo di Cori realizzano questa economia energetica

16 CICLO DELL UREA Nella matrice dei mitocondri Ciclo dell acido citrico Il ciclo inizia all interno dei mitocondri, ma tre tappe avvengono nel citosol cellulare Carbamil fosfato sintetasi 1

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18 IL CICLO DELL ACIDO CITRICO E DELL UREA SONO COLLEGATI ISOFORME CITOSOLICHE FUMARATO IDRATASI MALATO DEIDROGENASI

19 RIDUZIONE DEL COSTO ENERGETICO DOVUTO ALLA SINTESI DELL UREA 2NH HCO ATP + H 2 O urea + 2ADP + 4P i + AMP + 5H + Conversione di ossalacetato in fumarato (via aspartato) Rigenerazione di ossalacetato RIDUZIONE DEL COSTO ENERGETICO

20 GLI AMMINOACIDI ESSENZIALI

21 COENZIMI NEL CATABOLISMO DEGLI AMINOACIDI Coinvolti nel trasferimento di gruppi contenenti un atomo di carbonio con stati di ossidazione differenti. _ CH 3 CO 2 STATI DI OSSIDAZIONE INTERMEDI TUTTI E TRE TRASFERISCONO UN ATOMO DI CARBONIO CON STATI DI OSSIDAZIONE DIFFERENTI

22 Trp PRECURSORE DI IMPORTANTI BIOMOLECOLE

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24 AMINOACIDI A CATENA RAMIFICATA NON SONO DEGRADATI NEL FEGATO ma nel muscolo, nel rene e e nei tessuti adiposo e nervoso.

25 AMINOACIDI GLUCOGENICI E CHETOGENICI Triptofano, fenilalaina, tirosina e isoleucina sono ambivalenti.

26 I mammiferi sono in grado di produrre solo metà dei venti a.a. standard ( a.a. non essenziali); gli altri devono essere recuperati dal cibo (a.a. essenziali). Tutti gli a.a. non essenziali derivano da intermedi della glicolisi, del ciclo di Krebs o della via del pentoso fosfato. Possono essere suddivisi in sei famiglie, a seconda del loro precursore metabolico Biosintesi degli amminoacidi

27 MOLECOLE CHE DERIVANO DAGLI AMMINOACIDI ORMONI COENZIMI NUCLEOTIDI ALCALOIDI PORFIRINE ANTIBIOTICI PIGMENTI NEUROTRASMETTITORI

28 Biosintesi di alcuni neurotrasmettitori derivati da amminoacidi

29 La biosintesi dei carboidrati Durante periodi di digiuno di durata superiore ad un giorno, il glucosio deve essere sintetizzato da altri precursori che non siano le riserve di glicogeno. Ciò è vero anche durante una intensa attività fisica.

30 La gluconeogenesi PRINCIPALI PRECURSORI SONO: lattato, aminoacidi, alanina (prodotta dal muscolo attraverso il ciclo piruvato- alanina), propionato (degradazione di alcuni a.a) e glicerolo Avviene nel citosol, anche se alcuni precursori sono prodotti nei mitocondri. L organo in cui avviene la maggior parte della gluconeogenesi è il fegato, sebbene in minor quantità avvenga anche nella midollare dei reni.

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33 La piruvato carbossilasi catalizza la conversione ATP- e Biotinadipendente del piruvato ad ossalacetato REAZIONE ANAPLEROTICA La fosfoenolpiruvato carbossichinasi catalizza la conversione GTPdipendente dell ossalacetato a fosfoenolpiruvato

34 La reazione avviene nella matrice mitocondriale. Per essere utilizzato, l ossalacetato deve attraversare la membrana mitocondriale ed essere poi trasformato in PEP nella seconda reazione. La membrana è però impermeabile all ossalacetato, ma non lo è al malato

35 SISTEMI NAVETTA Stesso sistema che viene utilizzato per trasferire equivalenti di riduzione dal citosol nella matrice mitocondriale alternativamente glutammato + ossalacetato -chetoglutarato + aspartato L aspartato può attraversare la membrana mitocondriale Nella maggior parte delle cellule animali la PEP carbossilasi è localizzata nel citosol, ma in alcune specie è stata trovata anche nei mitocondri. Nell uomo l enzima è equamente distribuito tra i due compartimenti. La forma citosolica è comunque la più importante per la gluconeogenesi, come è dimostrato dal fatto che la sua concentrazione citoplasmatica è controllata da condizioni ormonali che controllano anche la gluconeogenesi.

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37 Fruttosio-1,6-bisfosfato + H 2 O fruttosio-6-fosfato + Pi G = -16,3 kj/mole Fruttoso-1,6-bisfosfatasi Glucoso 6-fosfatasi enzima localizzato principalmente nel reticolo endoplasmatico degli epatociti

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39 PRECURSORI NELLA GLUCONEOGENESI AMINOACIDI GLUCOGENICI RAGGRUPPATI PER SITO D INGRESSO

40 REGOLAZIONE DELLA GLUCONEOGENESI Gluconeogenesi e glicolisi si svolgono in gran parte nel citosol e devono essere regolate in modo reciproco. La regolazione reciproca è in gran parte legata alla carica energetica degli adenilati. I tre cicli dei substrati che differenziano la glicolisi dalla gluconeogenesi rappresentano i siti primari di regolazione reciproca di queste vie metaboliche.

41 La glucosio-6-fosfatasi non è regolata allostericamente, ma la sua Km per il glucosio-6- fosfato è molto più alta della concentrazione intracellulare di questo metabolita; regolata quindi secondo una cinetica di primo ordine. ADP L inibizione della piruvato chinasi, nei tessuti gluconeogenici (soprattutto da parte dell alanina) permette la regolazione (attivazione) della gluconeogenesi. ATP

42 Anche l acetil-coa può essere visto come un regolatore reciproco della glicolisi e della gluconeogenesi, in quanto agisce sugli enzimi che interconvertono il piruvato e il fosfoenol-piruvato. L eccesso di piruvato può quindi essere convertito a glucosio.

43 IL FRUTTOSIO-2,6-BISFOSFATO è IL PIU IMPORTANTE REGOLATORE DELLA GLUCONEOGENESI PFK-1 Fruttoso-1,6-bisfosfatasi Effettore allosterico: modulatore i cui livelli riflettono i livelli di glucagone nel sangue

44 REGOLAZIONE DEL LIVELLO DI FRUTTOSIO-2,6-BISFOSFATO Proteina bifunzionale PFK2 e Fruttosio 2,6 bisfosfatasi-2 (FBPasi-2)

45 IL GLUCAGONE Aumenta il livello di glucosio nel sangue grazie a due meccanismi: 1. Regolazione ad opera del camp del meccanismo a cascata che porta alla demolizione del glicogeno. 2. Depressione, sempre ad opera del camp, del livello del fruttosio-2,6-bisfosfato, che stimola la gluconeogenesi. Inoltre, controlla i livelli dell enzima chiave della gluconeogenesi, PEPCK, attivando la trascrizione del suo gene strutturale, mentre deprime la sintesi della piruvato chinasi.

46 Le condizioni che attivano la demolizione del glicogeno inibiscono la sintesi del glicogeno, e viceversa L adrenalina e il glucagone inibiscono la sintesi del glicogeno con gli stessi meccanismi con cui ne promuovono allo stesso tempo la demolizione.

47 Glicogeno sintasi: proteina tetramerica che, come la fosforilasi, può essere fosforilata su di un residuo di serina di ciascuna subunità.

48 BIOSINTESI DEGLI ACIDI GRASSI Come le altre vie biosintetiche, le sequenze di reazioni sono endoergoniche e riduttive, utilizzano ATP come fonte di energia metabolica e necessitano di equivalenti riducenti sotto forma di NADPH.

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50 ACETIL-CoA CARBOSSILASI La formazione di malonil-coa, a partire da acetil-coa e HCO 3 -, è la tappa iniziale della biosintesi.

51 Gli acidi grassi vengono sintetizzati mediante una sequenza di quattro reazioni ripetute. Tutte le reazioni sono sintetizzate da un complesso multienzimatico, chiamato ACIDO GRASSO SINTASI, costituito da almeno sette proteine differenti con sette siti attivi diversi. -OSSIDAZIONE BIOSINTESI Accettori di e- NAD + ; FAD NADPH Gruppo coenzima A gruppi SH legati all enzima attivante (-SH)

52 Le proteine cooperano tra loro per formare acidi grassi a 16 atomi di carbonio, a partire da Acetil-CoA e da Malonil-CoA.

53 Gli intermedi che si formano durante il processo restano legati covalentemente ad uno dei due gruppi tiolici del complesso

54 La catena di acido grasso cresce di 2 atomi per volta donati dal malonato attivato con perdita di una molecola di CO 2. Un punto di legame è l SH di un residuo di Cys in una delle 7 proteine (la -chetoacil-acp sintasi). L altro è l SH della proteina trasportatrice degli acili (ACP).

55 4 -fosfo-panteteina: Intermedio della sintesi del CoA Ha la funzione di braccio flessibile che ancora le catene dell acido grasso in fase di crescita sulla superficie del complesso dell acido grasso sintasi e trasporta gli intermedi delle reazioni da un sito attivo all altro.

56 REAZIONE COMPLESSIVA DELLA SINTESI DEL PALMITATO Prima parte 7 Acetil-CoA + 7 CO ATP 7 malonil-coa + 7 ADP + 7 Pi Seconda parte Acetil- CoA + 7 malonil-coa + 14 NADPH +14H + palmitato + 7 CO CoA +14 NADP H 2 O REAZIONE COMPLESSIVA 8 Acetil-CoA + 7 ATP + 14 NADPH +14H + palmitato + 8 CoA +14 NADP H 2 O + 7 ADP + 7 Pi

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58 FONTI DI NADPH PER LA SINTESI DEGLI ACIDI GRASSI Enzima malico VIA DEL PENTOSO FOSFATO

59 L acetil-coa sintetizzato nei mitocondri viene trasportato nel citosol sotto forma di citrato

60 REGOLAZIONE DELLA BIOSINTESI DEGLI ACIDI GRASSI Il citrato è anche l inibitore dell attività della fosfofruttochinasi-1 BIOSINTESI DEGLI A. GRASSI

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62 Il CoA-SH mitocondriale è separato da quello citosolico, il primo è coinvolto nella degradazione ossidativa del piruvato, degli acidi grassi e di alcuni AA, mentre il secondo per la biosintesi degli acidi grassi. L aciltransferasi I viene inibita dal malonil-coa, il primo intermedio della sintesi degli acidi grassi.

63 Vie di sintesi di altri acidi grassi

64 Gli eicosanoidi sono acidi grassi poliinsaturi a 20 atomi di carbonio

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66 La via lineare da arachidonato a leucotrieni

67 Biosintesi del colesterolo

68 Alcuni intermedi della biosintesi del colesterolo possono avere destini diversi

69 Ormoni steroidei derivati dal colesterolo

70 LE MEMBRANE BIOLOGICHE Definiscono i confini esterni delle cellule e regolano il traffico di molecole attraverso questi confini. Nelle cellule eucariotiche dividono lo spazio interno in compartimenti discreti, segregando nel loro interno specifici componenti e processi. Resistenti flessibili Autosigillanti Selettivamente permeabili Supporto per processi cellulari Membrana plasmatica Membrana mitocondriale

71 Le quantità relative di lipidi e proteine variano a seconda del tipo di membrana e riflettono le differenze delle loro funzioni biologiche.

72 Modello a mosaico fluido della struttura della membrana Asimmetria funzionale

73 I lipid rafts

74 Proteine di membrana Integrali Periferiche Saldamente legate alla membrana mediante interazioni idrofobiche. Si associano alla membrana mediante interazioni elettrostatiche e legami idrogeno con le teste polari dei lipidi di membrana.

75 PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA Dato che è nota la configurazione strutturale di poche proteine integrali di membrana, queste sono di solito rappresentate nella conformazione più probabile ( -eliche).

76 MEMBRANA SEMI-PERMEABILE Pochi sono i COMPOSTI che attraversano la membrana per semplice diffusione: O 2 ;N 2 ;NH 4 e l H 2 O. Le variazioni di energia che accompagnano il passaggio di un soluto idrofilo attraverso il doppio strato lipidico di una membrana biologica sono paragonabili allo stato di transizione di una reazione chimica catalizzata da un enzima SUPERAMENTO DI UNA BARRIERA DI ATTIVAZIONE G * * Molto grande

77 DIFFUSIONE FACILITATA O TRASPORTO PASSIVO Vi sono proteine che hanno la capacità di trasportare i loro substrati da un compartimento all altro, ma non li modificano chimicamente. Queste proteine di membrana sono chiamate TRASPORTATORI opermeasi. Come i catalizzatori, anche le permeasi legano il loro substrato con specificità stereochimica, mediante molte interazioni deboli non covalenti. I trasportatori attraversano almeno una volta il doppio strato lipidico, di solito più volte per formare un canale transmembrana rivestito di catene laterali di a.a. idrofilici.

78 I trasportatori del glucosio Trasportatori di glucosio GLUT-1 Localizzazione Muscolo Encefalo Eritrociti Tipo di trasporto Trasporto facilitato (secondo gradiente) in condizioni basali GLUT-2 Fegato Trasporto facilitato (secondo gradiente) in entrata ed in uscita GLUT-3 Membrane dei neuroni Trasporto facilitato GLUT-4 Trasportatore di fruttosio GLUT-5 Muscolo Cuore Adipociti Muscolo Adipociti Spermatozoi Trasporto stimolato da insulina e da impulsi nervosi Trasporto facilitato (secondo gradiente) facilmente saturabile

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80 IL TRASPORTATORE DEL GLUCOSIO DEGLI ERITROCITI Il metabolismo che produce energia nei globuli rossi dipende dal rifornimento di glucosio dal plasma Diffusione facilitata volte più elevata di quella non facilitata GluT1 è una proteina integrale di membrana costituita da 12 segmenti idrofobici, forse con struttura ad elica di ogni segmento. Cavità centrale del canale rivestito da residui polari Rappresentazione a ruota dell elica

81 IL PROCESSO DI TRASPORTO DEL GLUCOSIO PUO ESSERE DESCRITTO IN MODO ANALOGO AD UNA REAZIONE ENZIMATICA Kt come Km misura l affinità del trasportatore per il substrato; più basso è il valore di Kt più alta è l affinità.

82 MODELLO DI TRASPORTO DI GLUT1 Il sistema non è in grado di accumulare glucosio all interno della cellula, si può solo raggiungere un equilibrio che è però raggiunto ad una velocità notevolmente superiore. Trasportatore specifico per il D-glucosio (Kt 1,5 mm) ma in misura minore per mannosio (20 mm) e galattosio (30 mm). Nel fegato GluT2, trasporta glucosio anche in senso opposto (Kt 66 mm) Muscolo e tessuto adiposo posseggono anche loro un trasportatore del glucosio: GluT4.

83 ATTIVAZIONE DI GLUT-4 DA PARTE DELL INSULINA

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85 Meccanismo di attivazione GLUT-4

86 SISTEMI DI TRASPORTO

87 TRASPORTO ATTIVO Accumula soluto da un lato della membrana, quindi è termodinamicamente sfavorito e deve essere accoppiato ad un processo esoergonico: assorbimento della luce solare, reazione di ossidazione, demolizione di ATP od accoppiamento al trasporto di un altra specie nella direzione del suo gradiente elettrochimico. La X molto spesso è lo ione sodio

88 TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO Il trasporto è accoppiato direttamente ad una reazione esoergonica TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO Quando il trasporto endoergonico di un soluto è accompagnato da un flusso esoergonico di un altro soluto che era stato accumulato in precedenza TRASPORTO ELETTROGENICO Quando il soluto è uno ione il suo movimento, senza il contemporaneo spostamento di un altro ione con la stessa carica in direzione contraria, determina la separazione endoergonica delle cariche positive da quelle negative, producendo un potenziale elettrico Ci sono diversi tipi di trasportatori attivi ATP-dipendenti ATPasi STRUTTURA MECCANISMO LOCALIZZAZIONE

89 I DIVERSI TIPI DI TRASPORTO

90 REGOLAZIONE ORMONALE

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92 REGOLAZIONE ORMONALE

93 REGOLAZIONE ORMONALE

94 PRINCIPALI SISTEMI ENDOCRINI E LORO TESSUTI BERSAGLIO