Acquisizione e Stabilità della struttura terziaria delle proteine

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1 Acquisizione e Stabilità della struttura terziaria delle proteine

2 FORZE CHE STABILIZZANO LA STRUTTURA TERZIARIA DELLE PROTEINE 1. Legame covalente S-S (forte): non è presente in tutte le proteine che, quindi, possono mantenere la loro struttura IIIa anche solo con legami deboli. 2. Legami H tra gruppi R di AA di anse adiacenti. Es. un OH di una Ser e un N di una His. 3. Attrazione ionica tra gruppi R con cariche opposte. Es. COO - di un acido glutammico ed + NH 3 di una lisina. 4. Forze di Van der waals tra residui polari e apolari 5. Ioni metallici (non sempre presenti) che possono formare legami di coordinazione con i gruppi R di AA lontani. 6. Interazioni apolari N

3 PROTEINA GLOBULARE: UNA STRUTTURA ALTAMENTE ORDINATA L avvolgimento dalla catena polipeptidica grazie all instaurarsi di una serie ben precisa di legami e contatti porta alla formazione di una STRUTTURA ALTAMENTE ORDINATA che viene definita conformazione nativa della proteina: tuttavia il raggiungimento spontaneo di questa struttura sembra andare contro il II principio della termodinamica a causa della DIMINUZIONE DI ENTROPIA DEL SISTEMA ordinato PROTEINA. Non è così : anche l acquisizione della forma globulare della proteina risponde alla II legge della termodinamica. Bisogna considerare nel suo insieme il SISTEMA PROTEINA-SOLVENTE: che nel caso della cellula è l acqua ponte disolfuro a-elica con legami idrogeno interazioni idrofobiche interazioni idrofiliche metalli e legami di coordinazione scheletro polipeptidico catene laterali degli AA legami covalenti legami deboli come legami H e interazioni elettrostatiche

4 Nelle proteine globulari quasi tutti i residui polari sono sulla superficie del globulo,rivolti verso l esterno a contatto con l ambiente acquoso e tutti quelli apolari verso l interno, a costituire il NUCLEO IDROFOBICO. Residui polari possono essere presenti all interno e stabilire efficienti ponti H o legami salini, per es. con il substrato (hanno in tal caso un ruolo funzionale). Mentre 1., 2., 3., 4. e 5. costituiscono il CONTRIBUTO ENTALPICO alla variazione di G ( G) che determina il ripiegamento spontaneo della proteina nella struttura terziaria e la sua stabilizzazione, 6. rappresenta il CONTRIBUTO ENTROPICO. E frequente che la superficie di una proteina globulare si ripieghi in alcuni punti generando fessure o cavità ricche di residui apolari: TASCHE IDROFOBICHE con precise esigenze funzionali. Es. siti catalitici dell Enzima, sito per l EME nell Hb.

5 -PROTEINA DISTESA gruppi idrofobici esposti all H 2 O un maggior n.ro di molecole di H 2 O è costretto ad assumere una disposizione ordinata -PROTEINA RIPIEGATA gruppi idrofobici sottratti all H 2 O gruppi idrofilici esposti all H 2 O, un maggior n.ro di molecole di acqua libera di disporsi disordinatamente. La struttura terziaria stabile (nativa) delle proteine si raggiunge quando l aumento di entropia S delle molecole di H 2 O supera la diminuzione di S dovuta all ordinato instaurarsi di legami e contatti tra i gruppi della proteina con il suo conseguente avvolgimento.

6 La STABILITÀ DELLA STRUTTURA TERZIARIA è data dal delicato equilibrio tra -la tendenza della catena ad aprirsi in una forma più disordinata (random coil) e - la forza entalpica dell E di legame (a cui contribuiscono: legami H, ionici e forze di van der Waals) e la forza entropica del sistema proteina-solvente che tende a liberare dal core idrofobico le molecole d acqua.

7 ALTRE CARATTERISTICHE DELLA STRUTTURA TERZIARIA Le proteine globulari risultano spesso costituite da DOMINI STRUTTURALI: regioni tridimensionali la cui struttura si definisce autonomamente rispetto al resto della proteina (da 30 a 400 AA). Formano STRUTTURE COMPATTE catena. collegate da brevi segmenti di Ai domini strutturali spesso corrispondono DOMINI FUNZIONALI : entità funzionali autonome con funzioni specifiche. Es. NADH deidrogenasi { leg. Substrato { leg. NADH RNA pol. DNA dipendente { leg. Stampo {leg. Nucleotide Proteine diverse che hanno in comune una funzione possono avere domini strutturali simili. Per es. le NADH deidrogenasi hanno domini strutturali simili, per legare il NADH, codificati dagli stessi tratti di DNA (principio di economicità della cellula), e domini strutturali diversi per funzioni diverse: per es. riconoscere i diversi substrati.

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9 La struttura terziaria nativa è generalmente la forma termodinamicamente più stabile che la proteina può raggiungere nelle condizioni ambientali (ph e T )della cellula -La struttura terziaria nativa non è tuttavia sempre la forma termodinamicamente più stabile. Essa non è assolutamente rigida e fissa. Come ha dimostrato la tecnica del NMR (Nuclear Magnetic Resonance) che studia le proteine pure in soluzione molte proteine globulari subiscono normalmente variazioni conformazionali nel corso della loro funzione biologica. Es. - l Hb varia conformazione legando e cedendo indotto) l O 2 (Hb respira) - enzimi che legano il substrato (adattamento

10 STRUTTURA TERZIARIA DELLA MIOGLOBINA (Kendrew, 1950) Mioglobina Prima proteina di cui è stata identificata la struttura terziaria.

11 MIOGLOBINA: una proteina coniugata = apoproteina + gruppo EME AA - 1 EME - lega reversibilmente l O 2 e aumenta il suo trasporto ai mitocondri delle cellule muscolari - 8 segmenti relativamente diritti e interrotti da curvature - ciascun segmento lineare consiste in un α-elica (23 7AA) - ~ 75% AA α-elica - struttura molto compatta (solo 4 molecole di H 2 O all interno) - i gruppi R occupano tutti gli spazi liberi tra le anse - quasi tutti i gruppi R idrofobici sono rivolti all interno - tutti i gruppi R polari (tranne 2 istidine) sono rivolti all esterno in contatto con l H 2 O - ciascuna delle 4 Pro concorre a formare un ripiegamento, altri ripiegamenti sono dovuti ad altri AA incompatibili con l α-elica se strettamente giustapposti (Ser, Thr,) - tutti i legami peptidici sono nella conformazione planare trans - il gruppo EME piatto è posto in una fenditura o tasca idrofobica della molecola - la conformazione generale è uguale nelle mioglobine di tutte le specie studiate, sebbene la composizione in AA non sia del tutto uguale. Evidentemente, i residui invarianti o costanti sono sufficienti a dettare il preciso avvolgimento della struttura III a

12 LA SEQUENZA AA DETERMINA LA STRUTTURA TERZIARIA: PROVA SPERIMENTALE E possibile distruggere la forma NATIVA di una proteina provocandone la DENATURAZIONE, cioè dando luogo a conformazioni aperte e casuali (random coil) AGENTI DENATURANTI: fisici (temperatura), chimici RISCALDAMENTO rende instabili i legami deboli AGENTI CHIMICI DENATURANTI acidi, basi concentrate, detergenti, urea, guanidina concentrata, alterano la ionizzazione dei gruppi o si sostituiscono nella formazione dei legami deboli. Solventi organici AGENTI OSSIDANTI O RIDUCENTI dei ponti S-S: acido performico, mercaptoetanolo DENATURAZIONE perdita attività biologica Per alcune proteine questo processo è reversibile Se le proteine vengono raffreddate o portate a ph fisiologico riacquistano SPONTANEAMENTE la loro attività biologica: RINATURAZIONE

13 Anfinsen (1950) dimostrò che la RNAsi bovina (una proteina con 4 S-S) poteva essere denaturata e rinaturare spontaneamente. Ne dedusse che la struttura terziaria delle proteine dipende dalla struttura primaria ossia dalla specifica sequenza dei suoi aminoacidi

14 DENATURAZIONE Termolabili : proteine globulari si denaturano a T > 60 0 C Termostabili : proteine stabili al calore (poche, es. TAQ Polimerasi estratte da batteri esterofili) Random coil DENATURAZIONE : è dovuta alla rottura dei legami deboli responsabili della struttura tridimensionale delle proteine con conseguente perdita dell attività biologica e, di solito, della solubilità in acqua. In molti casi è reversibile Il coaugulo bianco insolubile, quando si fa bollire il bianco d uovo, è dovuto ad una denaturazione proteica. Esperimento di ANFINSEN

15 da: Napoli La perdita della struttura tridimensionale e dell a-elica fa aumentare l assorbimento spettrofotomentrico a 280nm delle proteine.

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17 Da: Nelson & Cox

18 RIPIEGAMENTO DELLE PROTEINE GLOBULARI: un processo COOPERATIVO Le proteine sono sintetizzate nelle cellule dalla estremità NH2 term. verso quella COOH term. a grande velocità 100 AA in ~5 a 37 C (E.coli) Occorrerebbero anni perchè la proteina (100 AA) provi tutte le conformazioni possibili intorno ad ogni singolo legame e si avvolga spontaneamente e con un processo casuale nella sua conformazione nativa. NON E POSSIBILE UN PROCESSO PROVA-E-SBAGLIA assolutamente CASUALE: devono esistere delle vie preferenziali La stabilità della forma nativa di una proteina si perde in uno strettissimo intervallo di temperature tipico di un processo niente o tutto. Tm = T di melting (fusione) = t in cui il 50% delle molecole ha perso la struttura terziaria. Tm è caratteristico di ogni proteina Non si sa se il ripiegamento inizia ad una estremità, al centro, o in più punti, ma si ritiene che sia un processo COOPERATIVO stabilità della forma nativa 1/2 Curva di fusione termica di una proteina

19 da: Ritter Processo cooperativo nel ripiegamento delle una volta che si sono formati proteine: nel modo corretto alcuni legami deboli aumenta di molto la probabilità che il resto della catena si avvolga correttamente.

20 Oggi risulta sempre più evidente che per il ripiegamento in vivo dei polipeptidi nella loro conformazione nativa e per l organizzazione di strutture oligomeriche è necessaria l assistenza di proteine dette chaperon molecolari (chaperonine = accompagnatori): essi mediano il ripiegamento di una catena polipeptidica fino a raggiungere una certa conformazione governata solo dalla sequenza AA delle proteine. Molti chaperon hanno attività ATPasica. da: P. Ritter

21 Oggi L Enzima disolfuro isomerasi che catalizza reazioni di interscambio di disolfuri in proteine è uno chaperon molecolare: la RNasi casuale, random coil (vedi fig. 6.27) rinatura: in 2 min in presenza di questo E; in 10 h in presenza di piccole quantità di 2-mercaptoetanolo che catalizza reazioni di interscambio tra solfuri Formazione 4 ponti S-S in RNAsi: 8 SH interessati (vedi esperimento di Anfinsen) 1 ponte S-S probabilità casuale 1/7 2 corretto 1/5 3 1/ /7 x 1/5 x 1/3 x 1/1 = 1/105 Gli 8 residui di cisteina avrebbero potuto ricombinarsi casualmente in modo da formare 4 ponti disolfuro in 105 modi diversi.

22 STRUTTURA QUATERNARIA DELLE PROTEINE E caratteristica solo delle PROTEINE OLIGOMERICHE, quelle formate da due fino a diverse dozzine di catene uguali o diverse. La STRUTTURA QUATERNARIA indica la disposizione delle catene delle subunità una rispetto all altra, cioè come esse si adattano e si dispongono insieme nella conformazione nativa delle proteine oligomeriche. Legami responsabili della formazione e della stabilità della struttura quaternaria sono gli stessi della struttura terziaria ma intercatena. PROTEINE OLIGOMERICHE : PM maggiori, evolutivamente più recenti, funzioni più complesse Ciascuna delle subunità ha la sua propria conformazione spaziale secondaria e terziaria e,in più, un altro livello strutturale detto struttura quaternaria -Nella stragrande maggioranza delle proteine oligomeriche si hanno protomeri simmetrici. -Analisi ai R.X. è più complessa, ma si conoscono ormai molte informazioni sulla emoglobina e su altre proteine oligomeriche.

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24 E. Coli 12 subunità identiche. AA PM PDB (Protein Data Bank): un archivio che contiene strutture tridimensionali di macromolecole biologiche ottenute sperimentalmente, accessibile via Internet.

25 MALATTIE DA PRIONE: MORTE PER RIPIEGAMENTO SBAGLIATO DI UNA PROTEINA da: Campbell & Farrel

26 da: Nelson & Cox MALATTIE DA PRIONE: MORTE PER RIPIEGAMENTO SBAGLIATO DI UNA PROTEINA

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28 L insulina ad azione veloce: l ingegneria genetica risolve un problema di struttura quaternaria L insulina viene rilasciata dal pancreas in forma monomerica e agisce rapidamente sui tessuti bersaglio legandosi in questa forma ai recettori. L insulina in soluzione, invece, si aggrega a formare degli esameri inattivi perché viene nascosta la superficie che si lega al recettore. Insulina per via endovena: attiva dopo ore. Insulina ingegnerizzata (1988, G. Dodson) per via endovena: pochi minuti. Insulina ingegnerizzata: aspartato sulle superfici di contatto tra le subunità invece di prolina: aumento K d esamero monomero per repulsione cariche negative sulle superfici di contatto (Garrett, Zanichelli). La conoscenza della struttura e della funzione di una proteina può aiutarci a sintetizzare proteine con caratteristiche più funzionali.

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