Treponema pallidum Screen

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1 DCM025i-1 Ed. 10/2013 Treponema pallidum Screen per analisi di routine Determinazione immunoenzimatica per la determinazione qualitativa degli anticorpi umani contro il Treponema pallidum nel siero o plasma umano LOT IVD Vedere etichetta esterna Σ = 96 test REF DKI025 DESTINAZIONE D USO Il kit Diametra Treponema pallidum Screen è un metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa di anticorpi umani diretti contro il Treponema pallidum nel siero e plasma umano. Il kit Treponema pallidum Screen è destinato al solo uso di laboratorio. 1. SIGNIFICATO CLINICO Le spirochete sono batteri mobili con un filamento assiale periplasmatico. Tutte le specie patogene appartengono alla famiglia Treponemataceae, che comprende i tre generi: Treponema, Borrelia e Leptospira. I Treponema sono batteri mobili, di 5-15 µm in lunghezza e 0.2 µm in larghezza, contenenti circa 10 flagelli morbidi e ondulati a forma di spirale. Il Treponema pallidum è l'agente eziologico della Sifilide, e si trasmette per contatto diretto, di solito attraverso il rapporto sessuale. La Sifilide è una malattia infettiva acuta e cronica, che, insieme a Gonorrea, Chancroide e Linfogranuloma venereo, è designata come malattia venerea (VD). Dopo un periodo di incubazione di giorni, i primi sintomi a comparire sono ulcere, e successivamente ulcere sifilitiche che poi scompaiono spontaneamente in poche settimane. Durante questa prima fase (Sifilide primaria) il Treponema pallidum si propaga nei linfonodi e si propaga in tutto il corpo. Le tre fasi successive della malattia sono classificate come secondaria, terziaria e quaternaria. Il trattamento con antibiotici nella fase precoce della malattia e le misure di profilassi riescono a prevenire le epidemie. A questo scopo, lo screening prenatale e da donatori di sangue sono obbligatori nella maggior parte del mondo. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il kit Diametra Treponema pallidum Screen è un test immunoenzimatico in fase solida (ELISA). I pozzetti della micropiastra (fase solida) sono rivestiti con antigeni di Treponema pallidum. I campioni diluiti dei pazienti e i controlli pronti all'uso vengono pipettati in questi pozzetti. Durante l'incubazione gli anticorpi specifici per Treponema pallidum dei campioni positivi e dei controlli si legano agli antigeni immobilizzati. Dopo una fase di lavaggio per rimuovere il campione non legato, viene dispensato nei pozzetti il coniugato, costituito da antigeni di Treponema pallidum legati a perossidasi di rafano. Durante una seconda incubazione questi antigeni si legano specificamente agli anticorpi anti Treponema pallidum bloccati sui pozzetti della micropiastra durante la prima incubazione: il sito di riconoscimento antigene-anticorpo è diverso rispetto alla prima incubazione. Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il materiale non legato gli immunocomplessi formati (in caso di risultati positivi) vengono individuati mediante incubazione con il substrato TMB e lo sviluppo di un colore blu. Il colore blu si trasforma in giallo quando la reazione enzimatica è stoppata con acido solforico. L'intensità di questo colore è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi IgG contro vengono dispensati nei pozzetti nel campione del paziente. L assorbanza a 450 nm viene letta con un lettore di piastre ELISA. Non c'è dipendenza dalla classe dell'anticorpo, pertanto tutte le classi di immunoglobuline sono rilevate. Data la sensibilità del sistema, la maggior parte dei campioni positivi viene rilevato come un segnale fuori dal range di misurazione. 3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit 1. Controls (3 flaconi, pronti all'uso) Negative Control (1 ml) REF DCE045/02501i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/02502i-0 Cut-Off Control (1,8 ml) REF DCE045/02503i-0 2. Conjugate (1 flacone, 13 ml) Antigeni di Treponema pallidum coniugati con perossidasi REF DCE002/02502i-0 3. Coated Microplate (1 micropiastra breakable coattata con antigeni di Treponema pallidum) REF DCE002/02503i-0 4. TMB Substrate (1 flacone, 12 ml) H 2 O 2 -Tetrametilbenzidina (TMB) (evitare il contatto con la pelle) REF DCE004/02504i-0 5. Stop Solution (1 flacone, 12 ml) Acido Solforico 0,5M (evitare il contatto con la pelle) REF DCE005/02505i-0

2 6. 10X Conc Wash Solution (1 vial, 100 ml) Contiene preservanti privi di mercurio REF DCE054/02554i Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata Materiale e strumentazione ausiliari Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 nm). Note Conservare tutti i reattivi a 2 8 C, al riparo dalla luce. Una volta aperto, il kit mantiene la sua funzionalità per 1 mese se conservato a 2-8 C. Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate) solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da utilizzare. 4. AVVERTENZE Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da parte di personale esperto. Non per uso interno o esterno su esseri Umani o Animali. Usare i previsti dispositivi di protezione individuale mentre si lavora con i reagenti forniti. Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per la manipolazione di prodotti derivati da sangue. Tutti i reattivi di origine umana usati nella preparazione dei reagenti sono stati testati e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi anti- HTLV, TPHA (Sifilide), HIV 1&2, HBV e HCV. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i reagenti devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. Alcuni reagenti contengono piccole quantità di Proclin 300 R come conservante. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. Il TMB Substrato contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. La Stop Solution è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Evitare l esposizione del reagente TMB/H 2 O 2 a luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la soluzione. 5. PRECAUZIONI Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati presentati qui sono stati ottenuti usando specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per l Uso. Tutti i reattivi devono essere conservati a temperatura controllata di 2-8 C nei loro contenitori originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. Prima dell uso lasciare tutti i componenti dei kit e i campioni a temperatura ambiente (22-28 C) e mescolare accuratamente. Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi. Devono essere osservate le date di scadenza riportate sulle etichette della scatola e di tutte le fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di scadenza. Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso. Per evitare il time shifting durante la dispensazione degli reagenti, il tempo di dispensazione dei pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in ogni piastra. L addizione del TMB Substrato dà inizio ad una reazione cinetica, la quale termina con l addizione della Stop Solution. L addizione del TMB Substrato e della Stop Solution deve avvenire nella stessa sequenza per evitare tempi di reazione differenti. Osservare le linee guida per l esecuzione del controllo di qualità nei laboratori clinici testando controlli e/o pool di sieri. Osservare la massima precisione nella ricostituzione e dispensazione dei reagenti. Non usare campioni microbiologicamente contaminati, altamente lipemici o emolizzati. I lettori di micropiastre leggono l assorbanza verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti. 6. PROCEDIMENTO 6.1. Preparazione della Wash Solution Prima dell uso, diluire il contenuto di ogni fiala di soluzione di lavaggio tamponata concentrata (10X) con acqua distillata fino al volume di 1000 ml. Per preparare volumi minori rispettare il rapporto di diluizione di 1:10. La soluzione di lavaggio diluita è stabile a 2-8 C per almeno 30 giorni. Nella wash solution concentrata è possibile osservare la presenza di cristalli; in tal caso agitare a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione dei cristalli; per una maggiore precisione diluire tutto il flacone della soluzione di lavaggio concentrata a 1000 ml, avendo cura di trasferire anche i cristalli, poi agitare fino a completa dissoluzione dei cristalli Preparazione del Campione Il kit ELISA Diametra Treponema pallidum Screen può essere utilizzato con siero o plasma umano. Non usare campioni emolitici, itterici o lipemici.

3 I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 2 giorni. Per conservazioni più lunghe tenere i campioni a -20 C, congelare 1 sola volta. Evitare cicli di congelamento e scongelamento Procedura Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28 C). Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate a 2-8 C. Per evitare potenziali contaminazioni microbiche e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei flaconi originali. Al fine di aumentare l accuratezza dei risultati del test è necessario operare in doppio, allestendo due pozzetti per ogni Controllo, due per ogni Campione ed uno per il Bianco. Reagente Controlli Campione Bianco Controlli (Neg, Pos, Cut-Off) 100 µl Campione 100 µl Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare per 1 ora a 37 C. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. Conjugate 100 µl 100 µl Incubare 30 minuti a 37 C. Non esporre alla luce solare diretta. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubare 15 minuti al buio a 37 C. Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Agitare delicatamente la micropiastra. Leggere l'assorbanza (E) a 450 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm o contro il Bianco entro 5 minuti dopo l'aggiunta della Stop Solution. 7. CONTROLLO QUALITA Si raccomanda di utilizzare i controlli secondo le norme statali e federali. L'uso di controlli è consigliato per assicurare la validità dei risultati durante i test. Utilizzare controlli sia a livello normale che patologico. Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi per la valutazione della qualità nazionali o internazionali, al fine di assicurare l'accuratezza dei risultati. Se i risultati del test non rientrano nei range di accettazione dei controlli, i risultati devono essere considerati non validi. In questo caso, si prega di consultare i seguenti parametri tecnici: pipettaggio e apparecchiature di cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei reagenti, metodi di conservazione e condizioni di incubazione, aspirazione e lavaggio. Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile alcun errore, contattare il proprio distributore o Diametra direttamente. 8. RISULTATI 8.1. Calcolo dei risultati Il valore di Cut-off è fornito dalla densità ottica (OD) del controllo Cut-off. L'"indice di Cut-off" (COI) è calcolato sulla base della densità ottica media dei campioni e del valore Cut-off. Se la densità ottica del campione è all'interno di un intervallo del 20% dal Cut-off (zona grigia), il campione deve essere considerato come borderline. Campioni con OD superiori sono positivi, campioni con OD inferiori sono negativi. Per una quantificazione, l'indice di Cut-off (COI) dei campioni si ottiene come segue: COI = OD Sample OD Cut-off control 8.2. Interpretazione dei risultati Metodo Range Interpretazione Qualitativo < 0.8 negativo (Cut-off Index, equivoco COI) > 1.2 positivo Negativo: Nessun anticorpo contro T. pallidum rilevato Equivoco: Nessuna chiara interpretazione possibile. In tale caso si consiglia di confermare i risultati testando nuovamente il campione in duplicato. Nel caso il risultato sia di nuovo equivoco, effettuare il dosaggio su un secondo campione fresco. Positivo: Rilevati anticorpi specifici contro T. Pallidum. I soli risultati non devono essere l'unica motivazione alla base di una scelta terapeutica ma devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici.

4 9. LIMITAZIONI DEL SAGGIO La raccolta dei campioni ha un'influenza significativa sui risultati del test. Vedere il paragrafo "Preparazione del Campione" per i dettagli. Le seguenti sostanze non hanno un effetto significativo sui risultati del test fino alle concentrazioni indicate di seguito: Emoglobina Bilirubina Trigliceridi 0.07 mg/ml 1.25 mg/ml 5.70 mg/ml 10. PARAMETRI CARATTERISTICI Specificità Diagnostica La specificità diagnostica é definita come la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. La specificità diagnostica è 99,9% Sensibilità Diagnostica La sensibilità diagnostica è definita come la probabilità di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica è 99% Cross-reattività Nessuna cross-reattività è stata trovata per: H.pylori, TORCH, EBV, Measles, parvovirus, borrelliosis, anticorpi anti ds-dna, ANA-ANCA, anticorpi autoimmuni e siero da donne incinte. 11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali. BIBLIOGRAFIA 1. Report of a WHO Scientific group (1982). Treponemal infections. Technical Report Series Fieldsteel A.H., Cox D.L., Moeckli R.A. (1981). Cultivation of virulent Treponema pallidum in tissue culture. Infect. Immun. 32: Baker - Zander S.A., Roddy R.E. (1986). IgG and IgM antibody reactivity to antigens of Treponema pallidum after treatment of syphilis. Sex.Trans.Dis. 13 (4): Schroeter A.L., Lucas J.B. (1972). Treatment for early syphilis and reactivity of serologic tests. JAMA 221 (5): Farshy C., Hunter E. (1984). Double-Conjugate Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Immunoglobulins G and M against Treponema pallidum, J. Clin, Microbiol. 20(6): Lee. J., Larsen S. (1986). Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, J. Clin, Microbiol. 24(5): Norris S. J. (1993). Polypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their Structural, Functional, and Immunologic Roles, Microbiological Reviews 57(3): Ito F., Larsen S. (1992). Specific Immonofluorescent Staining of Pathogenic Treponemes with a Monoclonal Antibody. J. Clin, Microbiol. 30(2): Larsen S, Steiner B. (1995). Laboratory Diagnosis and Interpretation of Tests for Syphilis, Clinical Microbiology Reviews. 8(1): Zrein M., Maure I. (1995). Recombinant Antigen- Based Enzyme Immunoassay for the Screening of Treponema pallidum Antibodies in Blood Bank Routine., J.Clin.Microbiol. 33(2): Young H., Moyes A. (1998). Novel Recombinant- Antigen Enzyme Immunoassay for Serological Diagnosis of Syphilis. J.Clin.Microbiol. 36 (4): Ijsselmuiden O., Schouls L. (1998). Sensitivity and Specificity of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using the Recombinant DNA-Derived Treponema pallidum Protein TmpA for Serodiagnosis of Syphilis and the Potential Use of TmpA for Assessing the Effect of Antibiotic Therapy, J.Clin.Micobiol. 27(1): Notenboom R., Meddens M. (2006). Evaluation of Trep-Sure; a new first-line enzyme immunoassay for the detection of total anti-treponemal antibodies. Int. J. STD&AIDS. 17(S1): 15 Ed. 10/2013 DCM025i-1 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax [email protected]

5 DCM025i-1 Ed. 10/2013 Treponema pallidum Screen for routine analysis Enzyme immunoassay for the qualitative determination of antibodies to Treponema pallidum in human serum or plasma LOT IVD See external label Σ = 96 tests REF DKI025 INTENDED USE Diametra Treponema pallidum Screen ELISA assay is an immunoenzymatic method for the qualitative determination of human antibodies to Treponema pallidum in human serum or plasma. Treponema pallidum Screen kit is intended for laboratory use only. 1. CLINICAL SIGNIFICANCE Spirochetes are motile bacteria with a periplasmatic axial filament. All pathogenic species belong to the family Treponemataceae, which includes the three genera: Treponema, Borrelia, and Leptospira. The Treponema are motile bacteria, 5-15 µm in length and 0.2 µm in width, containing about 10 flexible, undulating, spiral shaped rods. Treponema pallidum, the causative agent of Syphilis, is transmitted by direct contact, usually through sexual intercourse. Syphilis along with Gonorrhoea, Chancroid and Lymphogranuloma venereum, designated as a venereal disease, or VD, is an acute and chronic infectious disease. After an incubation period of days, the first symptoms to appear are chancres, soon followed by syphilitic ulcers which then spontaneously disappear in a few weeks. During this first stage (primary syphilis) the Treponema pallidum propagates in related lymph nodes to be distributed to the whole body stream. Three further stages of disease follow which are classified as secondary, tertiary, and quaternary syphilis. Treatment with antibiotics at the earliest disease stage and prophylactic measures are ways to prevent epidemics. For this purpose, antenatal and donor blood screenings are mandatory in most of countries around the world. 2. PRINCIPLE OF THE METHOD Diametra Treponema pallidum Screen ELISA kit is a solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Microtiter wells as a solid phase are coated with specific, recombinant treponemal antigens. Patient specimens and ready-for-use controls are pipetted into these wells. During the incubation the Treponema pallidum-specific antibodies of positive specimens and controls are bound to the immobilized antigens. After a washing step to remove unbound sample and control material, a conjugate containing Treponema pallidum antigens and conjugated to horseradish peroxidase is dispensed into the wells. During a second incubation, this antigens binds specifically to the antibodies linked to the microplate during the first incubation: the antigen-antibody recognition site is different than the first incubation. After a second washing step to remove unbound conjugate, the immune complexes formed (in case of positive results) are detected by incubation with TMB substrate and development of a blue color. The blue color turns into yellow by stopping the enzymatic indicator reaction with sulfuric acid. The intensity of this color is directly proportional to the amount of Treponema pallidum-specific antibody in the patient specimen. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA microtiter plate reader. There is no antibody-class dependency. Consequently, all immunoglobulin classes will be detected, making the assay a real total antibody detecting system. Due to the sensitivity of the system, the vast majority of positive samples will result in an out of range signal. 3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION 3.1. Reagents and materials supplied in the kit 1. Controls (3 vials, ready to use) Negative Control (1 ml) REF DCE045/02501i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/02502i-0 Cut-Off Control (1.8 ml) REF DCE045/02503i-0 2. Conjugate (1 vial, 13 ml) Treponema pallidum antigen conjugated with peroxidase REF DCE002/02502i-0 3. Coated Microplate (1 breakable microplate coated with inactivated Treponema pallidum antigen) REF DCE002/02503i-0 4. TMB Substrate (1 vial, 12 ml) H 2 O 2 -Tetramethylbenzidine (avoid any skin contact) REF DCE004/02504i-0

6 5. Stop Solution (1 vial, 12 ml) Sulphuric acid 0.5M (avoid any skin contact) REF DCE005/02505i X Conc. Wash Solution (1 vial, 100 ml) Contain non-mercury preservative REF DCE054/02554i Reagents necessary not supplied Distilled water Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser. Microplates reader (450 nm) Notes Store all reagents at 2 8 C in the dark. Opened kits retain activity for one month if stored as described above. Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only when it is at room temperature and close it immediately after use. 4. WARNINGS This kit is intended for in vitro use by professional persons only. Not for internal or external use in Humans or Animals. Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All human source material used in the preparation of the reagents has been tested and found negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and HCV. No test method however can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Therefore, the reagents should be handled in the same manner as potentially infectious material. Some reagents contain small amounts of Sodium Azide or Proclin 300 R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa. Sodium Azide may be toxic if ingested or absorbed through the skin or eyes; moreover it may react with lead or copper plumbing to form potentially explosive metal azides. If you use a sink to remove the reagents, allow scroll through large amounts of water to prevent azide build-up. The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Avoid the exposure of reagent TMB/H 2 O 2 to directed sunlight, metals or oxidants. Do not freeze the solution. 5. PRECAUTIONS Please adhere strictly to the sequence of pipetting steps provided in this protocol. The performance data represented here were obtained using specific reagents listed in this Instruction For Use. All reagents should be stored refrigerated at 2-8 C in their original container. Any exceptions are clearly indicated. The reagents are stable until the expiry date when stored and handled as indicated. Allow all kit components and specimens to reach room temperature (22-28 C) and mix well prior to use. Do not interchange kit components from different lots. The expiry date printed on box and vials labels must be observed. Do not use any kit component beyond their expiry date. If you use automated equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately tested. The incomplete or inaccurate liquid removal from the wells could influence the assay precision and/or increase the background. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than 10 minutes are needed, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve in each plate Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera. Maximum precision is required for reconstitution and dispensation of the reagents. Samples microbiologically contaminated, highly lipemeic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. 6. PROCEDURE 6.1. Preparation of the Wash Solution Dilute the contents of each vial of the buffered wash solution concentrate (10X) with distilled water to a final volume of 1000 ml prior to use. For smaller volumes respect the 1:10 dilution ratio. The diluted wash solution is stable for 30 days at 2-8 C. In concentrated wash solution is possible to observe the presence of crystals; in this case mix at room temperature until the complete dissolution of crystals; for greater accuracy, dilute the whole bottle of concentrated wash solution to 1000 ml, taking care to transfer completely the crystals, then mix until crystals are completely dissolved Preparation of the Sample Diametra Treponema pallidum Screen ELISA can be used with human serum or plasma. The usual precautions for venipuncture should be observed. Do not use hemolytic, icteric or lipemic specimens. Specimens should be capped and may be stored for up to 48 hours at 2-8 C prior to

7 assaying. Specimens held for a longer time should be frozen only once at 20 C prior to assay. Avoid repeated freeze-thaw cycles Procedure Allow all reagents to reach room temperature (22-28 C). Unused coated microwell strips should be released securely in the foil pouch containing desiccant and stored at 2-8 C. To avoid potential microbial and/or chemical contamination, unused reagents should never be transferred into the original vials. As it is necessary to perform the determination in duplicate in order to improve accuracy of the test results, prepare two wells for each Control, two for each sample, one for Blank. Reagent Controls Sample Blank Controls (Neg, Pos, Cut-Off) 100 µl Sample 100 µl Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 1 hour at 37 C. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. Conjugate 100 µl 100 µl Incubate 30 minutes at 37 C. Do not expose to direct sunlight. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubate 15 minutes in the dark at 37 C. Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Shake the microplate gently. Read the absorbance (E) at 450 nm with a reference wavwlenght of 620 nm or against Blank within 5 minutes after adding the Stop Solution. 7. QUALITY CONTROL It is recommended to use control samples according to state and federal regulations. The use of control samples is advised to assure the day to day validity of results. Use controls at both normal and pathological levels. It is also recommended to make use of national or international Quality Assessment programs in order to ensure the accuracy of the results. If the results of the assay do not fit to the established acceptable ranges of control materials patient results should be considered invalid. In this case, please check the following technical areas: Pipetting and timing devices; photometer, expiration dates of reagents, storage and incubation conditions, aspiration and washing methods. After checking the above mentioned items without finding any error contact your distributor or Diametra directly. 8. RESULTS 8.1. Calculation of Results The Cut-off value is given by the optical density (OD) of the Cut-off control. The Cut-off index (COI) is calculated from the mean optical densities of the sample and Cut-off value. If the optical density of the sample is within a range of 20% around the Cut-off value (grey zone), the sample has to be considered as borderline. Samples with higher ODs are positive, samples with lower ODs are negative. For a quantification, the Cut-off index (COI) of the samples can be formed as follows: COI = OD Sample OD Cut-off control 8.2. Interpretation of Results Method Range Interpretation Qualitative < 0.8 negative (Cut-off Index, equivocal COI) > 1.2 positive Negative: No antibodies against T. pallidum detected. Equivocal: No clear interpretation possible. In such case it is advised to confirm the results by testing that sample again in duplicate. In the case the repeated result is again equivocal, a second sample should be tested and judged for a change in result. Positive: Specific antibodies against T.pallidum detected. The results themselves should not be the only reason for any therapeutical consequences. They have to be correlated to other clinical observations and diagnostic tests. 9. LIMITATIONS OF USE Specimen collection has a significant effect on the test results. See "Preparation of the Sample" for details. The following substances do not have a significant effect on the test results up to the below stated concentrations: Hemoglobin Bilirubin Triglyceride 0.07 mg/ml 1.25 mg/ml 5.70 mg/ml

8 10. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. It is 99.9% Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. 99% Cross-reactivity No cross-reactivities were found to: H.pylori, TORCH, EBV, Measles, parvovirus, borrelliosis, ds-dna antibodies, ANA-ANCA, autoimmune antibodies and Serum from Pregnant women. 11. WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations. BIBLIOGRAPHY 1. Report of a WHO Scientific group (1982). Treponemal infections. Technical Report Series Fieldsteel A.H., Cox D.L., Moeckli R.A. (1981). Cultivation of virulent Treponema pallidum in tissue culture. Infect. Immun. 32: Baker - Zander S.A., Roddy R.E. (1986). IgG and IgM antibody reactivity to antigens of Treponema pallidum after treatment of syphilis. Sex.Trans.Dis. 13 (4): Schroeter A.L., Lucas J.B. (1972). Treatment for early syphilis and reactivity of serologic tests. JAMA 221 (5): Farshy C., Hunter E. (1984). Double-Conjugate Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Immunoglobulins G and M against Treponema pallidum, J. Clin, Microbiol. 20(6): Lee. J., Larsen S. (1986). Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, J. Clin, Microbiol. 24(5): Norris S. J. (1993). Polypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their Structural, Functional, and Immunologic Roles, Microbiological Reviews 57(3): Ito F., Larsen S. (1992). Specific Immonofluorescent Staining of Pathogenic Treponemes with a Monoclonal Antibody. J. Clin, Microbiol. 30(2): Larsen S, Steiner B. (1995). Laboratory Diagnosis and Interpretation of Tests for Syphilis, Clinical Microbiology Reviews. 8(1): Zrein M., Maure I. (1995). Recombinant Antigen- Based Enzyme Immunoassay for the Screening of Treponema pallidum Antibodies in Blood Bank Routine., J.Clin.Microbiol. 33(2): Young H., Moyes A. (1998). Novel Recombinant- Antigen Enzyme Immunoassay for Serological Diagnosis of Syphilis. J.Clin.Microbiol. 36 (4): Ijsselmuiden O., Schouls L. (1998). Sensitivity and Specificity of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using the Recombinant DNA-Derived Treponema pallidum Protein TmpA for Serodiagnosis of Syphilis and the Potential Use of TmpA for Assessing the Effect of Antibiotic Therapy, J.Clin.Micobiol. 27(1): Notenboom R., Meddens M. (2006). Evaluation of Trep-Sure; a new first-line enzyme immunoassay for the detection of total anti-treponemal antibodies. Int. J. STD&AIDS. 17(S1): 15 Ed. 10/2013 DCM025i-1 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax [email protected]