Epstein Barr Virus VCA IgA

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1 DCM001i-0 Ed. 08/2012 Epstein Barr Virus VCA IgA per analisi di routine Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e quantitativa di anticorpi umani di classe IgA contro l Epstein Barr Virus VCA in siero o plasma umano IVD LOT Vedere etichetta esterna Σ = 96 test REF DKI001 DESTINAZIONE D USO Il kit ELISA Diametra Epstein Barr Virus VCA IgA è un metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e quantitativa di anticorpi umani di classe IgA contro l Epstein Barr Virus VCA in siero o plasma umano. Il kit Epstein Barr Virus VCA IgA è destinato al solo uso di laboratorio. 1. SIGNIFICATO CLINICO La mononucleosi infettiva è una malattia acuta linfoproliferativa comuni nei bambini e negli adulti più giovani. E causata dall Epstein-Barr Virus (EBV). L'EBV è uno dei virus herpes 4 (gamma). Le caratteristiche cliniche sono: 1. febbre, mal di gola e linfoadenopatia, 2. linfocitosi assoluta associata, 3. sviluppo di eterofili transienti e persistenti risposte anticorpali anti EBV, 4. funzionalità epatica anormale. Il 4% dei giovani adulti infetti mostra una manifestazione itterica e il 50% mostra una splenomegalia. Inoltre EBV è implicato nel linfoma di Burkitt, nel carcinoma nasofaringeo e nel morbo di Hodgkin. Una sindrome mononucleosi infettiva simile può essere causata da citomegalovirus, toxoplasmosi e altre infezioni virali. Pertanto la diagnosi differenziale è di grande importanza. Test sierologici come l ELISA sono molto utili per la rivelazione di anticorpi anti-ebv IgG e IgM soprattutto quando gli anticorpi eterofili sono assenti. Relativamente a infezioni recenti, gli anticorpi IgM contro VCA e EA sono determinate mediante immunofluorescenza o ELISA. In fase avanzata compaiono anticorpi IgG per VCA e successivamente per EBNA-1. L'attivazione simultanea di IgM VCA IgM e IgG EBNA-1 indica riattivazione di una infezione latente da EBV. Gli anticorpi IgG per VCA compaiono precocemente nella malattia, per raggiungere i più alti titoli entro 2-4 settimane e persistere per molti anni, probabilmente per tutta la vita. Gli anticorpi IgM per VCA compaiono all'inizio della malattia, ma diminuiscono o addirittura scompaiono entro pochi mesi. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il kit è un dosaggio immunoenzimatico in fase solida (ELISA) basato sul principio sandwich. I pozzetti sono rivestiti con antigene. Gli anticorpi specifici del campione che si legano ai pozzetti rivestiti di antigene vengono rilevati da un anticorpo secondario coniugato con enzima (E-Ab) specifico per IgA umane. Dopo la reazione del substrato, l'intensità del colore sviluppato è proporzionale alla quantità di anticorpi IgA specifici. Il risultato dei campioni può essere determinato direttamente usando la curva di calibrazione. 3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit 1. Calibrators (4 flaconi, 2 ml ciascuno) CAL 1 REF DCE002/00107i-0 CAL 2 REF DCE002/00108i-0 CAL 3 REF DCE002/00109i-0 CAL 4 REF DCE002/00110i-0 2. Conjugate IgA (1 flacone, 14 ml) Anticorpi anti IgA umane coniugati con perossidasi REF DCE002/00102i-0 3. Coated Microplate (1 micropiastra breakable coattata con antigeni specifici) REF DCE002/00103i-0 4. TMB Substrate (1 flacone, 14 ml) H 2 O 2 -Tetrametilbenzidina (TMB) (evitare il contatto con la pelle) REF DCE004/00104i-0 5. Stop Solution (1 flacone, 14 ml) Acido Solforico 0,5 mol/l (evitare il contatto con la pelle) REF DCE005/00105i X Conc Wash Solution (1 vial, 60 ml) Contiene Tween 20 in tampone PBS REF DCE054/00154i-0 7. Sample diluent (1 vial, 60 ml) Tween 20, BSA in soluzione tampone, NaN 3 < 0,1% REF DCE053/00153i-0

2 3.2. Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata Materiale e strumentazione ausiliari Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 nm). Note Conservare tutti i reattivi a 2 8 C, al riparo dalla luce. Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate) solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da utilizzare; una volta aperta è stabile fino alla data di scadenza del kit. 4. AVVERTENZE Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da parte di personale esperto. Non per uso interno o esterno su esseri Umani o Animali. Usare i previsti dispositivi di protezione individuale mentre si lavora con i reagenti forniti. Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per la manipolazione di prodotti derivati da sangue. Tutti i reattivi di origine umana usati nella preparazione dei reagenti sono stati testati e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi anti- HIV 1&2, per HbsAg e per anticorpi anti-hcv. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Calibratori ed i Controlli devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. Alcuni reagenti contengono piccole quantità di Sodio Azide (NaN 3 ) o di Proclin 300 R come conservante. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. La Sodio Azide può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi; inoltre, può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, lasciar scorrere grandi quantità di acqua per prevenire la formazione di azidi. Il TMB Substrato contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. La Stop Solution è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Evitare l esposizione del reagente TMB/H 2 O 2 a luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la soluzione. 5. PRECAUZIONI Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati presentati qui sono stati ottenuti usando specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per l Uso. Tutti i reattivi devono essere conservati a temperatura controllata di 2-8 C nei loro contenitori originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. Prima dell uso lasciare tutti i componenti dei kit e i campioni a temperatura ambiente (22-28 C) e mescolare accuratamente. Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi. Devono essere osservate le date di scadenza riportate sulle etichette della scatola e di tutte le fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di scadenza. Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso. Per evitare il time shifting durante la dispensazione degli reagenti, il tempo di dispensazione dei pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in ogni piastra. L addizione del TMB Substrato dà inizio ad una reazione cinetica, la quale termina con l addizione della Stop Solution. L addizione del TMB Substrato e della Stop Solution deve avvenire nella stessa sequenza per evitare tempi di reazione differenti. Osservare le linee guida per l esecuzione del controllo di qualità nei laboratori clinici testando controlli e/o pool di sieri. Osservare la massima precisione nella ricostituzione e dispensazione dei reagenti. Non usare campioni microbiologicamente contaminati, altamente lipemici o emolizzati. I lettori di micropiastre leggono l assorbanza verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti. 6. PROCEDIMENTO 6.1. Preparazione dei Calibratori I Calibratori sono pronti all uso ed hanno le seguenti concentrazioni: C 1 C 2 C 3 C 4 U/mL Preparazione della Wash Solution Diluire la 10X Conc. Wash Solution 1:10 con acqua distillata; ad esempio per preparare 500 ml di soluzione di lavaggio diluita aggiungere 50 ml di soluzione di lavaggio 10X a 450 ml di acqua distillata. Se la "10X Conc. Wash Solution" presenta i

3 cristalli, scioglierli in un bagno di acqua calda a 37 C prima dell uso. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 2 mesi a 2-8 C Preparazione del Campione Il kit Diametra Epstein Barr Virus VCA IgA può essere utilizzato con siero e plasma umano. Tutti i campioni devono essere pre-diluiti con Sample Diluent 1:101; ad esempio 10 µl di campione può essere diluito con 1000 µl di Sample Diluent. i campioni con concentrazioni più alte del Calibratore 4 devono essere diluiti ulteriormente. Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. È importante preservare l'integrità del campione di sangue dal momento del prelievo all'esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato. I campioni possono essere conservati in frigorifero a 2-8 C per 2 giorni. Per conservazioni più lunghe tenere i campioni a -20 C. Tenere lontano da fonti di calore e luce solare diretta. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento Procedura Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28 C). Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate a 2-8 C. Per evitare potenziali contaminazioni microbiche e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei flaconi originali. Al fine di aumentare l accuratezza dei risultati del test è necessario operare in doppio, allestendo due pozzetti per ogni campione, due per ogni Calibratore (C 1 -C 4 ), e due per il Bianco. NB: nella misurazione di tipo qualitativo utilizzare solo il Calibratore 2 (10 U/mL). Reagente Calibratore Campione Bianco Calibratore C 1 -C 4 Campione diluito 100 µl 100 µl Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (22-28 C). Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 3 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione battendo delicatamente la piastra capovolta su un tovagliolo di carta assorbente. Conjugate IgA 100 µl 100 µl Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (22-28 C). Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 3 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione battendo delicatamente la piastra capovolta su un tovagliolo di carta assorbente. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubare 20 minuti al buio a temperatura ambiente (22 28 C) senza la pellicola adesiva. Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Agitare delicatamente la micropiastra. Leggere l assorbanza (E) a 450 nm contro una lunghezza d onda di riferimento di nm o contro il bianco. 7. CONTROLLO QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni. Inoltre l'utilizzatore deve attenersi alle regole GLP (Good Laboratory Practice) o ad altri standard / regolamenti applicabili. Tutti i calibratori devono rientrare nei range di accettazione indicati sul Certificato di Analisi. Se i criteri di accettazione non sono soddisfatti il test non è valido e deve essere ripetuto. Ogni laboratorio deve usare campioni noti come ulteriori controlli. In caso di discrepanze è necessario verificare i seguenti dati: date di scadenza dei reagenti, condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni di incubazione e metodi di lavaggio. Si consiglia di partecipare a programmi di controllo qualità. 8. RISULTATI 8.1. Calcolo dei Risultati La OD ottenute per i Calibratori (asse y, lineare) vengono riportate contro la loro concentrazione (asse x, logaritmico) su un grafico su carta semilogaritmica o utilizzando un metodo automatico. Buoni risultati si

4 ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva di calibrazione, utilizzare ogni assorbanza dei calibratori (in caso di doppietti nei duplicati, utilizzare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere letta dalla curva di calibrazione. La diluizione iniziale è già stata presa in considerazione quando si leggono i risultati dal grafico. I risultati dei campioni con ulteriori diluizioni devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione. Esempio di curva di calibrazione (esempio solamente, non utilizzare per i dosaggi): Calibratore U/mL OD media Cal 0 1 0,016 Cal ,447 Cal ,860 Cal ,858 2,000 1,500 1,000 0,500 OD 450 nm 0, EBV (VCA) IgA (U/mL) 8.2. Interpretazione dei Risultati U/mL Interpretazione < 8 negativo 8-12 dubbio > 12 positivo È importante tenere presente che la determinazione di un range di valori attesi in un dato metodo per una popolazione normale è dipendente da molteplici fattori, quali la specificità e sensibilità del metodo in uso, e la popolazione in esame. Perciò ogni laboratorio dovrebbe considerare i range indicati dal Fabbricante come un indicazione generale e produrre range di valori attesi propri basati sulla popolazione indigena dove il laboratorio risiede. I seguenti componenti del sangue non hanno effetto significativo (±15%) sui risultati del test fino alle concentrazioni indicate di seguito: Emoglobina Bilirubina Trigliceridi 11. PARAMETRI CARATTERISTICI 8.0 mg/ml 0.3 mg/ml 5.0 mg/ml Cross Reattività Nessuna croos-reattività per: RSV Precisione Media (U/mL) CV (%) Intra assay Inter assay Linearità Range Diluizioni Range (U/mL) seriali fino a: (%) : Recupero % % Recupero (n=3) Correlazion e con ELISA Sensibilità > 95% Specificità > 95% 12. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali. Ed. 08/2012 DCM001i-0 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax [email protected] 9. VALORI ATTESI In uno studio con soggetti sani sono stati ottenuti i seguenti risultati: Interpretazione Isotipo Ig n positivo dubbio negativo IgA % 9.1% 87.5% 10. LIMITAZIONI DEL SAGGIO La raccolta dei campioni ha un effetto significativo sui risultati del test. Sodio Azide e Thimerosal a concentrazioni > 0.1% interferiscono con questo test e possono portare a falsi risultati.

5 DCM001i-0 Ed. 08/2012 Epstein Barr Virus VCA IgA for routine analysis Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative determination of human IgA antibodies against Epstein Barr Virus VCA in human serum or plasma IVD LOT See external label Σ = 96 tests REF DKI001 INTENDED USE Diametra Epstein Barr Virus VCA IgA ELISA assay is an immunoenzymatic method for the qualitative and quantitative determination of human IgA antibodies against Epstein Barr Virus VCA in human serum or plasma. Epstein Barr Virus VCA IgA kit is intended for laboratory use only. 1. CLINICAL SIGNIFICANCE Infectious mononucleosis is an acute lymphoproliferative disease common in children and young adults. It is caused by the Epstein-Barr Virus. The EBV is one of the herpes viruses 4 (gamma). Characteristic clinical features are: 1. fever, sore throat and lymphadenopathy, 2. associated absolute lymphocytosis, 3. development of transient heterophil and persistent antibody responses against EBV, 4. abnormal liver function. 4% of infected young adults show an icteric manifestation and 50% show a splenomegaly. In addition EBV is implicated in Burkitt lymphoma, the nasopharyngeal carcinoma and Hodgkin s disease. An infectious mononucleosis similar syndrome can be caused by cytomegalovirus, toxoplasmosis and other viral infections. Therefore differential diagnosis is of major importance. Serological tests like EIA are very useful for the detection of anti-ebv IgG and IgM antibodies especially when heterophil antibodies are absent. Related to fresh infections, IgM antibodies against VCA and EA are determined by immunofluorescence or ELISA. Later VCA IgG and then EBNA-1 IgG antibodies appear. The simultaneous activation of VCA IgM and EBNA-1 IgG indicates a reactivation of a latent EBV infection. VCA IgG antibodies occur early in disease, reach the highest titers within 2 to 4 weeks and persist for many years probably for life. VCA IgM antibodies occur at the beginning of the disease but decrease or even disappear within a few months. 2. PRINCIPLE OF THE METHOD Solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on the sandwich principle. The wells are coated with antigen. Specific antibodies of the sample binding to the antigen coated wells are detected by a secondary enzyme conjugated antibody (E-Ab) specific for human IgA. After the substrate reaction the intensity of the color developed is proportional to the amount of IgA-specific antibodies detected. Results of samples can be determined directly using the calibration curve. 3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION 3.1. Reagents and materials supplied in the kit 1. Calibrators (4 vials, 2 ml each) CAL 1 REF DCE002/00107i-0 CAL 2 REF DCE002/00108i-0 CAL 3 REF DCE002/00109i-0 CAL 4 REF DCE002/00110i-0 2. Conjugate IgA (1 vial, 14 ml) Anti human IgA antibodies conjugated with peroxidase REF DCE002/00102i-0 3. Coated Microplate (1 breakable microplate coated with a specific antigen) REF DCE002/00103i-0 4. TMB Substrate (1 vial, 14 ml) H 2 O 2 -Tetramethylbenzidine (avoid any skin contact) REF DCE004/00104i-0 5. Stop Solution (1 vial, 14 ml) Sulphuric acid 0.5M (avoid any skin contact) REF DCE005/00105i X Conc. Wash Solution (1 vial, 60 ml) Contain Tween 20 in PBS buffer REF DCE054/00154i-0 7. Sample diluent (1 vial, 60 ml) Tween 20, BSA in a buffer solution, NaN 3 < 0,1% REF DCE053/00153i Reagents necessary not supplied Distilled water Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser. Microplates reader (450 nm)

6 Notes Store all reagents at 2 8 C in the dark. Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only when it is at room temperature and close it immediately after use; once opened, it is stable up to expiry date of the kit. 4. WARNINGS This kit is intended for in vitro use by professional persons only. Not for internal or external use in Humans or Animals. Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All human source material used in the preparation of the reagents has been tested and found negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and HCV. No test method however can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Therefore, the reagents should be handled in the same manner as potentially infectious material. Some reagents contain small amounts of Sodium Azide or Proclin 300 R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa. Sodium Azide may be toxic if ingested or absorbed through the skin or eyes; moreover it may react with lead or copper plumbing to form potentially explosive metal azides. If you use a sink to remove the reagents, allow scroll through large amounts of water to prevent azide build-up. The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Avoid the exposure of reagent TMB/H 2 O 2 to directed sunlight, metals or oxidants. Do not freeze the solution. 5. PRECAUTIONS Please adhere strictly to the sequence of pipetting steps provided in this protocol. The performance data represented here were obtained using specific reagents listed in this Instruction For Use. All reagents should be stored refrigerated at 2-8 C in their original container. Any exceptions are clearly indicated. The reagents are stable until the expiry date when stored and handled as indicated. Allow all kit components and specimens to reach room temperature (22-28 C) and mix well prior to use. Do not interchange kit components from different lots. The expiry date printed on box and vials labels must be observed. Do not use any kit component beyond their expiry date. If you use automated equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately tested. The incomplete or inaccurate liquid removal from the wells could influence the assay precision and/or increase the background. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than 10 minutes are needed, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve in each plate Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera. Maximum precision is required for reconstitution and dispensation of the reagents. Samples microbiologically contaminated, highly lipemeic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. 6. PROCEDURE 6.1. Preparation of the Calibrators The Calibrators are ready to use and have the following concentrations: C 1 C 2 C 3 C 4 U/mL Preparation of the Wash Solution Dilute the "10X Conc. Wash Solution" 1:10 with distilled water; for example to prepare 500 ml of diluted Wash Solution add 50 ml of "10X Wash Solution" to 450 ml of distilled water. If the "10X Wash Solution" presents crystals, dissolve them by warming up at 37 C before use. The diluted Wash Solution is stable for 2 months at 2-8 C Preparation of the Sample Diametra Epstein Barr Virus VCA IgA ELISA can be used both with serum and human plasma. All serum and plasma samples have to be prediluted with sample diluent 1:101; for example 10 µl of sample may be diluted with 1000 µl of sample diluent. Samples containing concentrations higher than the highest Calibrator have to be diluted further. The usual precautions for venipuncture should be observed. It is important to preserve the chemical integrity of a blood specimen from the moment it is collected until it is assayed. Do not use grossly hemolytic, icteric or grossly lipemic specimens. Samples appearing turbid should be centrifuged before testing to remove any particulate material.

7 Samples may be stored refrigerated at 2-8 C for at least 2 days. For longer storage store the samples at -20 C. Keep away from heat or direct sun light. Avoid repeated freeze-thaw cycles Procedure Allow all reagents to reach room temperature (22-28 C). Unused coated microwell strips should be released securely in the foil pouch containing desiccant and stored at 2-8 C. To avoid potential microbial and/or chemical contamination, unused reagents should never be transferred into the original vials. As it is necessary to perform the determination in duplicate in order to improve accuracy of the test results, prepare two wells for each point of the calibration curve (C 1 -C 4 ), two for each Control, two for each sample, one for Blank. NB: in the qualitative test only the Calibrator 2 (10 U/mL) is used. Reagent Calibrator Sample Blank Calibrator C 1 -C 4 Diluted Sample 100 µl 100 µl Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 1 hour at room temperature (22-28 C). Remove the contents from each well. Wash the wells 3 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. Conjugate IgA 100 µl 100 µl Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 30 minutes at room temperature (22-28 C). Remove the contents from each well. Wash the wells 3 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubate 20 minutes in the dark at room temperature (22 28 C) without the adhesive foil. Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Shake the microplate gently. Read the absorbance (E) at 450 nm with a reference wavwlenght of nm or against Blank. 7. QUALITY CONTROL The test results are only valid if the test has been performed following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All Calibrators must be found within the acceptable ranges as stated on the QC Certificate. If the criteria are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any deviation the following technical issues should be proven: expiration dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials. 8. RESULTS 8.1. Calculation of Results The obtained OD of the Calibrators (y-axis, linear) are plotted against their concentration (x-axis, logarithmic) either on semi-logarithmic graph paper or using an automated method. A good fit is provided with cubic spline, 4 Parameter Logisitcs or Logit-Log. For the calculation of the calibration curve, apply each signal of the Calibrators (one obvious outlier of duplicates might be omitted and the more plausible single value might be used). The concentration of the samples can be read from the calibration curve. The initial dilution has been taken into consideration when reading the results from the graph. Results of samples of higher predilution have to be multiplied with the dilution factor. Typical Calibration Curve (example only, do not use for calculation): Calibrator U/mL Mean OD Cal 0 1 0,016 Cal ,447 Cal ,860 Cal ,858 2,000 1,500 1,000 0,500 OD 450 nm 0, EBV (VCA) IgA (U/mL) 8.2. Interpretation of Results U/mL Interpretation < 8 negative 8-12 equivocal > 12 positive Please pay attention to the fact that the determination of a range of expected values for a normal population in a given method is dependent on many factors, such as specificity and sensitivity of the method used and type of population under

8 investigation. Therefore each laboratory should consider the range given by the Manufacurer as a general indication and produce their own range of expected values based on the indigenous population where the laboratory works. 9. EXPECTED VALUES In an in-house study, apparently healthy subjects showed the following results: Interpretation Ig isotype n positive equivocal negative IgA % 9.1% 87.5% 10. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Specimen collection has a significant effect on the test results. Azide and thimerosal at concentrations > 0.1% interfere in this assay and may lead to false results. The following blood components do not have a significant effect (+/- 15% of expected) on the test results up to the concentrations stated below: 3. Färber I., Wutzler P., Wohlrabe P. et al., Serological diagnosis of infectious mononucleosis using three anti-epstein-barr virus recombinant ELISAs, J. Virol. Meth.; 42: , (1993) Ed. 08/2012 DCM001i-0 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax [email protected] Hemoglobin Bilirubin Triglyceride 8.0 mg/ml 0.3 mg/ml 5.0 mg/ml 11. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS Cross Reactivity No cross reactivity for: RSV Precision Mean (U/mL) CV (%) Intra assay Inter assay Linearity Range Serial dilution Range (U/mL) up to (%) : % Recovery after spiking Recovery % (n=3) Comparison versus ELISA Sensitivity > 95% Specificity > 95% 12. WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations. BIBLIOGRAPHY 1. Bergman M., Gleckman R.A., Heterophilnegative infectious mononucleosis-like syndrome. Postgrad.Med., 81 (1): (1987) 2. De-The, G., Epidemiology of EBV and Associated Diseases in Man, In: The Herpesviruses, Roizman, B. (ed)., Volume 1, New York: Plenum-Press, , (1982)