BEIA CMV IgG Quant 21465

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1 BEIA CMV IgG Quant Edizione 20/04/2013 Solo per uso professionale 0459 TECHNOGENETICS SRL N Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

2 INTRODUZIONE Il kit BEIA CMV IgG Quant è un test immunoenzimatico quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma degli anticorpi di classe IgG specifici verso il citomegalovirus umano. SIGNIFICATO CLINICO Il Cytomegalovirus umano (HCMV) appartiene alla famiglia delle Herpersviridae sottofamiglia delle Betaherpesvirinae. Il virione è costituito da un nucleo cilindrico (core) circondato da un filamento di DNA a doppia elica. Questa struttura è rivestita da un Capside e all esterno si rilevano una o più membrane contenenti lipidi. E un virus ubiquitario e specie-specifico. L infezione da Cytomegalovirus può essere primaria (infezione congenita o infezione post-natale) oppure secondaria (riattivazione della replicazione virale) in individui quali le donne in gravidanza, in terapia immunosoppressiva ed in presenza di malattie molto gravi. L infezione congenita, che può essere causata sia da infezione primaria che da reinfezione della donna gravida, è trasmessa per via transplacentale o al momento della nascita ed è responsabile, nei neonati infetti, di gravi manifestazioni cliniche quali sordità, corioretinite, microcefalia, idrocefalo, cardiopatia, epatite, epatosplenomegalia, trombocitopenia, aborto spontaneo.le infezioni post-natali sono spesso asintomatiche eccetto negli individui immunocompromessi ( AIDS, tumori, trapianti) nei quali l infezione evolve in forma disseminata comportando, in questi individui, severe complicanze (anemia emolitica, encefalite, splenomegalia, morte). La diagnosi dell'infezione da CMV può essere condotta sia con la ricerca diretta della presenza del virus, (viremia, DNAemia, antigenemia) che con la ricerca indiretta della presenza di anticorpi di classe IgG ad IgM. Le immunoglobuline di classe IgM sono rilevabili dopo 1-2 settimane dall'infezione mentre le IgG appaiono circa una settimana più tardi rispetto alle IgM. Il dosaggio delle IgM specifiche è importante per diagnosticare la fase acuta dell'infezione, tenendo presente che tali anticorpi possono essere prodotti anche Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

3 nel 50% dei casi di infezione secondaria nei pazienti immunocompromessi. L'infezione primaria è caratterizzata dalla presenza di alti titoli anticorpali verso un antigene precoce del CMV di peso molecolare di 52 kda (p52), risulta quindi particolarmente utile l'impiego di un kit in grado di rilevare gli anticorpi diretti verso questa proteina per la diagnosi sierologica dell'infezione acuta da CMV. Il dosaggio delle IgG, essendo la presenza di queste immunoglobuline sinonimo di infezione pregressa, permette di distinguere la popolazione protetta da quella non protetta, oltre a confermare la sieroconversione da infezione primaria. Numerosi studi hanno ormai dimostrato che la distinzione tra infezione primaria e riattivazione, può essere efficacemente conseguita mediante la ricerca delle IgG a differente avidità in quanto l'infezione primaria è caratterizzata dalla presenza di IgG a minore avidità per l'antigene rispetto a quella che caratterizza le IgG prodotte a seguito di successivi stimoli antigenici. PRINCIPIO DEL METODO Il test BEIA CMV IgG Quant è un dosaggio immunoenzimatico in micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con l'antigene CMV. I campioni da esaminare vengono incubati nei micropozzetti; le IgG del campione si legano formando un complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza di IgG anti-cmv viene rilevata attraverso il legame con un anticorpo monoclonale anti-igg coniugato con perossidasi. Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato viene aggiunto il substrato-tmb che, per azione dell enzima presente sulla fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. L aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall azzurro al giallo. La densità ottica letta a 450/620 è direttamente proporzionale alla quantità di IgG specifiche presenti nel campione in esame. Nei kit BEIA CMV IgG Quant la concentrazione degli anticorpi di classe IgG viene calcolata mediante l'utilizzo di una curva di calibrazione ed espressa in Unità Arbitrarie/mL. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

4 CONTENUTO DELLA CONFEZIONE La confezione è sufficiente per 96 determinazioni. Componente SORB A Strip da 8 micropozzetti frazionabili 12x8x1 CAL 0 B Calibratore 0 (0 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibratore 1 (10 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibratore 2 ( 20 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibratore 3 ( 50 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibratore 4 ( 120 UA/mL) 1 x 2 ml DIL SPE D Diluente Campioni BEIA System 1 x 120 ml CONJ E Coniugato 1 x 13,5 ml BUF WASH 20X F Tampone di Lavaggio 1 x 100 ml SUBS TMB G Substrato-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 H Soluzione Stoppante 1 x 25 ml Istruzioni per l uso 1 A. Strip sensibilizzate Strip sensibilizzate con CMV virus inattivato, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli. B. Calibratore 0 UA/ml Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-cmv. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. C. Calibratori 10, 20,50 e 120 UA/mL Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgG anti-cmv. Contengono 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagenti pronti all uso. D. Diluente Campioni BEIA System Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente pronto all'uso. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

5 E. Coniugato Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-igg umane, marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso. F. Tampone di Lavaggio Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene 0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti. G. Substrato-TMB Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante (rosa). Reagente pronto all'uso. H. Soluzione Stoppante Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8 C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sull etichetta. REAGENTI INTERCAMBIABILI Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il Substrato- TMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA. MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm. Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di micropiastre. Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µl. Provette monouso e normale vetreria da laboratorio. Acqua distillata o deionizzata. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (18-25 C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

6 Evitare l'essiccamento dei micropozzetti. Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita. Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi. Cambiare il puntale tra un campione e l altro. Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad azzurro, il reagente non deve essere utilizzato. Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione del campione. Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire. Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle pipette e del lettore. AUTOMAZIONE Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA). Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario, aliquotare i campioni e congelarli a -20 C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il Diluente Campioni BEIA System prima del dosaggio. Vedi esecuzione del test. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tampone di Lavaggio Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

7 15 giorni se conservato a 2-8 C e comunque non oltre la data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37 C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso. CICLO DI LAVAGGIO Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi manualmente. 1. Svuotare completamente i pozzetti. 2. Riempirli con 300 µl di tampone di lavaggio. 3. Svuotare i pozzetti. 4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli. 5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti al termine del lavaggio. ESECUZIONE DEL TEST Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno minuti a C). 1. Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni BEIA System (esempio 10 µl di siero e 800 µl di Diluente Campioni BEIA System). Agitare su Vortex. 2. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del numero di campioni in esame e dei Calibratori (vedi il paragrafo Schema del dosaggio ). Richiudere accuratamente la busta. 3. Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in esame prediluito e dei Calibratori. 4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Coniugato. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

8 7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Substrato-TMB. 10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 15 minuti. 11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun pozzetto 100 µl di Soluzione Stoppante. 12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA Le condizioni che consentono l accettazione dei risultati sono : il rapporto tra la DO del Calibratore 4 (120 UA/mL) e la DO del Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere > 3.0. il rapporto tra la DO del Calibratore 0 (0 UA/mL) e la DO del Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere < 0.6. Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed alla gestione di eventuali non conformità. CALCOLO DEI RISULTATI Calcolare la media dei valori di densità ottica per ogni calibratore e campione (i duplicati dovrebbero presentare un CV minore del 20%). Elaborare la curva di calibrazione riportando la media delle densità ottiche di ogni calibratore sull asse delle ordinate e le corrispondenti concentrazioni sull asse delle ascisse. Disegnare la migliore curva che passi attraverso i punti della calibrazione. Per calcolare la concentrazione di IgG anti-cmv di ogni campione riportare il valore della densità ottica sull asse delle ordinate e collegare con una linea retta alla curva di calibrazione. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

9 Al punto di intersezione, collegare con una linea verticale all asse delle ascisse e leggere il corrispondente valore di IgG anti-cmv. Qualora si disponesse di un sistema di calcolo automatico si consiglia di utilizzare una delle seguenti funzioni matematiche: spline cubica, iperbolica e lineare punto a punto. I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall utilizzatore. Esempio di calcolo con interpolazione spline cubica: Calibratori UA/mL Densità Ottica UA/mL Cal Cal Cal Cal Cal Campione A Campione B Campione C INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi: UA/mL > INTERPRETAZIONE Il campione è da considerare POSITIVO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-cmv Il campione è da considerare NEGATIVO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-cmv Il campione è da considerare DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-cmv Va tenuto presente che: - il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di classe IgG. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato infettivo; Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

10 - una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test, ma va fondata sull insieme dei dati clinici disponibili. Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione, eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello; - risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento. PRESTAZIONI DEL KIT Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal fabbricante. SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le prestazioni del kit BEIA CMV IgG Quant nei confronti di un kit già immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA CMV IgG). BEIA CMV IgG Quant EIA CMV IgG Da questi dati si ottiene: Sensibilità relativa 97,5% Specificità relativa 100% Concordanza 98,2% LIMITE DI RILEVAZIONE Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di rilevazione in 0.44 UA/mL. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

11 SPECIFICITÀ ANALITICA Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, fino a 1 mg/ml di bilirubina e fino a 30 mg/ml di trioleina. L uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque sconsigliato. RIPETIBILITÀ La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata valutando un campione negativo con concentrazione 4 UA/mL e due campioni positivi a due concentrazioni 11 UA/mL e 70 UA/mL. I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 20% per il campione negativo ed inferiori al 7% per i due campioni positivi. LIMITAZIONI Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche. PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni previste per l'esecuzione del test. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell area di laboratorio designata. Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca. Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando guanti monouso e camici. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di lavoro eventualmente contaminate. Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme vigenti. Controllare periodicamente il grado di contaminazione dell'ambiente di lavoro e degli operatori. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

12 Reagenti contenenti siero I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e trovati negativi per HbsAg, anti-hcv ed anticorpi anti-hiv. Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele. Reagenti pericolosi Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritante per gli occhi e per la pelle S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. SCHEMA DEL DOSAGGIO Preparare i reattivi Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System Dispensare 100 L di ogni Calibratore (0-120 UA/mL) in doppio 100 L di campione prediluito in singolo o doppio, Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Coniugato Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Substrato-TMB Incubare 15 minuti a T.A. (18-25 C) Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm A Cal 0 Cal 120 B Cal 0 Cal 120 C Cal 8 P1 D Cal 8 P2 E Cal 20 P3 F Cal 20. G Cal 50. H Cal 50. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

13 BEIA CMV IgG Quant Version 20/04/2013 For professional use only 0459 TECHNOGENETICS SRL Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

14 INTENDED USE The BEIA CMV IgG Quant kit is a quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgG antibodies to Cytomegalovirus, in human serum or plasma samples. CLINICAL RELEVANCE Human Cytomegalovirus (HCMV) is a virus belonging to the group of Herpesviridae, a subfamily of the Betaherpesvirinae. Virion has a cylindric nucleus (core) surrounded by double-stranded DNA. This structure is covered by a Capside and one or more membranes containing lipides can be found externally. Is a host-specific and ubiquitarian virus. CMV infection can be primary (congenital or postnatal) as well as secondary (viral replication reactivation) in individuals like pregnant women, people being treated with immunosuppressant drugs, people suffering from serious diseases. Congenital infection, which can be caused both by a primary infection or by a re-infection in pregnant women, is transmitted transplacentally or during delivery and is responsible in infected newborns of complications which may include hearing loss, vision impairment, microcephaly, hydrocephalus, hearth disease, hepatitis, hepatosplenomegaly, thrombocytopenia, miscarriage. For healthy persons who acquire CMV after birth there are no symptoms but in immunocompromised patients (AIDS patients, organ transplant recipients, patients with cancer) CMV infection can cause serious disease with manifestations such as hemolytic anemia, encephalitis, splenomegaly and death. Diagnosis of infection can be made directly determining the presence of the virus (viremia, DNAemia, antigenemia) and indirectly measuring IgG and IgM class antibodies to CMV. IgM antibodies can be detected within 2 weeks after infection while IgG appear about a week later than IgM. Specific IgM antibodies titers are important for the diagnosis of acute infections, considering that such antibodies can be also produced in 50% of secondary infections in individuals with impaired immune system. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

15 As in primary infections high titers of antibodies against the early antigen of 52 kda (p52) can be found, kits able to detect antibodies against this protein are particularly indicated for a serologial diagnosis of CMV primary infection. The detection of the IgG antibodies in a patient s serum helps to determine his immune status as these antibodies persist in the body for the lifetime of the patient. Many studies have demonstrated that the detection of low avidity IgG antibodies is indicative of primary infection while in reactivated CMV infections high avidity IgG antibodies are produced. PRINCIPLE OF THE ASSAY The BEIA CMV IgG Quant kit is a quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgG antibodies to CMV, in human serum or plasma. During the first incubation, only anti-cmv specific antibodies present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with the CMV antigen. After the first incubation the wells are washed to remove non-reactive serum components. During the second incubation a monoclonal antibody anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) is added. After a second washing cycle, a substrate-tmb solution is dispensed into the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which changes to yellow the blue colour developed into the wells. The amount of colour is directly proportional to the specific IgG anti-cmv concentration in the patient samples. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

16 KIT COMPONENTS Package size: 96 tests. Component SORB A Coated Strip 12x8x1 CAL 0 B Calibrator 0 (0 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibrator 1 ( 10 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibrator 2 ( 20 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibrator 3 ( 50 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibrator 4 ( 120 AU/mL) 1 x 2 ml DIL SPE D Sample Diluent BEIA System 1 x 120 ml CONJ E Conjugate 1 x 13,5 ml BUF WASH 20X F Wash Buffer 1 x 100 ml SUBS TMB G Substrate-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 H Stop Solution 1 x 25 ml Package Insert 1 A. Coated strips Breakable strips coated with inactivated CMV virus packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal. B. Calibrator 0 AU/mL Negative human serum for IgG antibodies anti-cmv. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. C. Calibrators AU/mL Human serum, containing IgG antibodies anti-cmv with different known concentrations. Contain 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. D. Sample Diluent BEIA System Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent E. Conjugate Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase. Ready to use reagent. F. Wash Buffer Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di Kathon CG and Tween 20. See Preparation of reagents. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

17 G. Substrate-TMB Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered solution. Contains pink dye. Ready to use reagent. H. Stop Solution 1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent. STORAGE OF REAGENTS Store all reagents at 2-8 C avoiding exposure to light. Do not use reagents after the expiry date indicated on the label. INTERCHANGEABLE REAGENTS The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop Solution are common to all BEIA kits. MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader with 450/620 nm filters. Manual or automated microplate washing device. Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L. Disposable pipettes and normal glassware. Distilled or deionised water. WARNINGS AND PRECAUTIONS Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use. Only take the quantity necessary for the assay. Avoid wells drying. Use clean glassware. Use a clean disposable pipette tip for each reagent. Use a clean disposable pipette tip for each sample. If the substrate-tmb shows a change from pink to blue colour, discard the reagent. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

18 For repeated assays, each time provide for new diluted samples. Every analytical run should include control samples in order to validate the results, according to criteria and procedures established by each laboratory. Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate reader are required. AUTOMATION The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to specific instrument manual for proper applications. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The test can be performed on serum or plasma (heparin EDTA). Specimens may be stored refrigerated at 2-8 C up to 5 days. For longer storage they should be aliquoted and stored frozen at 20 C. Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with Sample Diluent BEIA System prior to assay. See assay protocol. PREPARATION OF REAGENTS Wash Buffer (20 X) Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored at 2-8 C; in any case, do not use it after expiry date printed on the original label. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer, warm the solution to 37 C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay. WASHING CYCLES Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform the following steps. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

19 1. Empty the wells 2. Fill them with 300 µl of Wash Buffer. 3. Empty the wells 4. Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles 5. Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the washing cycles. ASSAY PROTOCOL Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least minutes at C. 1. Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample Diluent BEIA System (i.e. 10 µl of serum and 800 µl of Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex. 2. Select the number of strips required for the assay according to the number of samples to be assayed and the Calibrators (see paragraph Summary of protocol below). Reseal the pouch. 3. Dispense 100 µl of each Calibrator and of the diluted sample. 4. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 5. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 6. Dispense 100 µl of Conjugate in each well. 7. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 8. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 9. Dispense 100 µl of Substrate-TMB in each well. 10. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 15 minutes. 11. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µl of Stop Solution into each well. 12. Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm. CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS RUN VALIDATION CRITERIA Criteria used to validate the obtained results are the following: Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

20 The ratio of the OD for Calibrator 4 (120 AU/mL) to the OD for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be > 3.0 The ratio of the OD for Calibrator 0 (0 AU/mL) to the OD for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be < 0.6 If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot be reported without a documented critical review of the data. The non conformity must be addressed and treated according to each laboratory s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its own internal Quality Control procedures and use the QC results to validate runs and manage non conformities. CALCULATION OF RESULTS Calculate the average O.D. values for each set of duplicate calibrators and samples (duplicates should have a CV < 20%). Create a calibration curve by plotting the mean of O.D. for each calibrator concentration on the ordinate against the IgG anti-cmv concentration on the abscissa. Draw a best fit curve through the points of the graph. To determine the concentration of IgG anti- CMV for each sample, first find the O.D. value on the ordinate and extend a horizontal line to the calibration curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the abscissa and read the corrisponding IgG anti-cmv concentration. If an automated processor is available it s advise to select among the following curve fit types: cubic spline, hyperbolic and point-to-point straigth line. The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. Example of calculation with cubic spline fit: Calibrators AU/mL O.D. AU/mL Cal Cal Cal Cal Cal Sample A Sample B Sample C Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

21 INTERPRETATION OF RESULTS Results from our clinical trials, performed on samples representative of the European population, suggest the following interpretative criteria: AU/mL INTERPRETATION > 10 Sample should be considered POSITIVE for the presence of IgG anti-cmv antibodies. 8 Sample should be considered NEGATIVE for the presence of IgG anti-cmv antibodies Sample should be considered BORDERLINE for the presence of IgG anti-cmv antibodies. Please consider that: - the test only detects specific IgG antibodies. It cannot per se and univocally be referred to as evidence of infection; - a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but should be grounded on all the available clinical data; discrepancies in clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests; - results within grey zone should be made clear: re-testing the same sample; testing a sample from another collection from the same patient; comparing the results with those of a reference test. PERFORMANCE DATA Warning: Data below do not represent the performance specifications of the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is within such specifications, as intended by the manufacturer. SPECIFICITY AND SENSITIVITY The diagnostic sensitivity and specificity were evaluated comparing the BEIA CMV IgG Quant results versus an established EIA commercial kit (EIA CMV IgG) with acceptable performances. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

22 BEIA CMV IgG Quant EIA CMV IgG From which the following table can be calculated: Relative Sensitivity 97,5% Relative Specificity 100% Agreement 98,2% DETECTION LIMIT: Trials in replicate on the Calibrator 0 lead to calculate the detection limit in 0.44 AU/mL. ANALYTICAL SPECIFICITY No interference has been observed in samples with hemoglobin up to 10 mg/ml, bilirubin up to 1 mg/ml, triolein up to 30 mg/ml. Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be used. REPEATABILITY The within-run and run-to-run variability were determined using one negative sample with concentration of 4 AU/mL and two positive samples, containing different concentration : 11 AU/mL and 70 AU/mL. These samples were tested 6 times per single run in 12 different analytical runs. Coefficients of variation lower than 20% have been obtained for the negative sample and 7% for the positive samples. LIMITATIONS Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may affect the detectable levels of specific IgG. Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

23 GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the procedural directions. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab. Do not pipette solutions or samples by mouth. Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and samples. Avoid direct contact. Wash hands thoroughly after assay. Thoroughly clean working area with proper detergent solutions. Collect solid and liquid waste material in proper containers and provide for disposal according to the local regulations. Periodically check contamination level of operators and rooms. Reagents containing serum All components of human origin have been tested and found negative for HbsAg, anti-hcv and anti-hiv antibodies. Since no known test can guarantee, however, that products derived from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous material. Hazardous Reagents Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritating to eyes and skin. S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek for medical advice. SUMMARY OF PROTOCOL Prepare reagents Pre-dilute samples 1:81 with Sample Diluent Dispense: 100 L of Calibrators (0-120 AU/mL) in duplicate 100 L of pre-diluted samples in single or duplicate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013

24 Dispense 100 L of Conjugate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Substrate-TMB Incubate 15 minutes at R.T. (18-25 C) Dispense 100 L of Stop Solution Read the O.D. at 450/620nm A Cal 0 Cal 120 B Cal 0 Cal 120 C Cal 10 P1 D Cal 10 P2 E Cal 20 P3 F Cal 20. G Cal 50. H Cal 50. REFERENCE - BIBLIOGRAFIA - Champsaur H., Fattal-German M., Arranhado R Sensitivity and specificity of viral M determination by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Clinical Microbiology 26: Demmler GJ Congenital cytomegalovirus infection. Semin. Pediatr. Neurol. 1: Dolan J., Briggs J.D. and Clements GB Antibodies to cytomegalovirus in renal allograft recipients : correlation with isolation of virus. J. Clin.Pathol. 42: Griffiths PD., Stagno S., Pass RF., Alford CH : Infection with cytomegalovirus during pregnancy : specific IgM antibodies as a marker of recent primary infection. Journal of Infectious Diseases 145 : Lennette EH Laboratory Diagnosis of Viral Infections Second Edition. New York : Dekker M, Inc. - Nelson CT., Demmler GJ Cytomegalovirus infection in the pregnant mother, fetus and newborn infant. Clin. Perinatol. 24 : Pass Rf., Griffiths PD., August AM : Antibody response to cytomegalovirus after renal transplantation : comparison of patients with primary and recurrent infections. Journal of Infectious Diseases 147 : Patel R. and Paya C.V Infections in solid-organ transplantrecipents.clin. microbial. Rev. 10 : Rasmussen L., Kelsall D., Nelson R., Carney W., Hirsch M., Winston D., Preisatis J., Merican TC. 1982: Virus-specific IgG and IgM antibodies in normal and immunocompromised subjects infected with cytomegalovirus. Journal of Infectious Diseases 145: Pag BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013